Способ получения медицинского геля, применяемого для сепарации эритроцитов и лейкоцитов методом центрифугирования

Способ получения медицинского геля, применяемого для сепарации эритроцитов и лейкоцитов методом центрифугирования

Реферат

зобретение относится к области медицины, а именно, к способу получения медицинского геля, который используют для сепарации эритроцитов и лейкоцитов, и который может применяться при подготовке плазмы для использования в методике плазмолифтинг, применяемой в различных областях медицины, в частности, в хирургической области, стоматологии, в косметологии и дерматологии.

Плазмолифтинг - это очень широко известный и применяемый в России и во всем мире метод инъекционного введения в ткани организма богатой тромбоцитами плазмы, полученной из крови самого пациента. Методика может применяться в хирургической стоматологии при имплантации зубов. Плазмолифтинг ускоряет процесс сращения поверхностей имплантата с костной тканью и регенерации тканей десны. Методика также применяется в косметологии и дерматологии: разглаживает морщины, выравнивает шрамы, растяжки, повышает иммунитет кожи, лечит пигментацию. Методика эффективна и для лечения выпадения волос. Богатая тромбоцитами плазма позволяет остановить отмирание волосяных фолликулов, истончение волос и стимулирует рост новых волос. Методика эффективно используется для лечения пародонтита и пародонтоза.

Смысл методики состоит в том, что пациенту вводится плазма его собственной крови без эритроцитов и лейкоцитов. Известно применение методики для лечения фотодерматоза [Ахмеров P.P., Зарудий Р.Ф. «Применение обогащенной тромбоцитами аутоплазмы для лечения фотодерматоза», «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии», Уфа. 2005, №3]. Плазму, богатую тромбоцитами, получали на центрифуге SmartPReP®2 АРС+™ фирмы Harvest Technologies. В качестве антикоагулянта использовали трицитрат натрия в декстрозе. В процессе методики плазма обогащается тромбоцитами. При увеличении концентрации тромбоцитов увеличивается концентрация факторов роста, а именно: тромбоцитарный фактор роста (PDGF-aa, PDGF-bb, PDGF-ab), трансформирующий фактор роста (TGF-b1, TGF-b2), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактор роста эпителия (EGF). Именно эта обогащенная тромбоцитами плазма (БоТП) и производит описанное в методике действие на человеческий организм, ускоряя и усиливая коллагеногенез, регенерацию тканей, остеогенез и т.д.

Богатую тромбоцитами плазму можно получить из крови с помощью специальных центрифуг. В ходе вращения центрифуги кровь разделяется на три основных составляющих по степени плотности. Наименее плотная и бедная тромбоцитами плазма отделяется первой, богатая тромбоцитами плазма (которую иногда называют тромбоцитарно-лейкоцитарным слоем) отделяется во вторую очередь, и наиболее плотные эритроциты отделяются последними.

Обычно пробирки, используемые для центрифугирования, имеют на внутренней поверхности напыление из специальных препаратов, которые позволяют крови не сворачиваться (антикоагулянтов), а разделяться и концентрировать максимальное количество полезных веществ, в первую очередь факторов роста, способствующих регенерации клеток. Чем чище и насыщеннее плазма, тем лучше результат процедуры. Специальные препараты, способствующие разделению компонентов крови, а также способы их получения, соответственно, не известны авторам.

Из Интернета [http://www.dental-azbuka.ru/articles/2-2/1-articlel] известно, что при выделении тромбоцитов из крови методом центрифугирования на первом этапе эритроциты отделяются от плазмы и лейкоцитов с тромбоцитами. Во время второго этапа происходит окончательное разделение плазмы, лейкоцитов и тромбоцитов с незначительным количеством эритроцитов на БоТП и бедную тромбоцитами плазму (наличие небольшого количества эритроцитов в БоТП неизбежно, потому что молодые и наиболее активные тромбоциты находятся вместе с самой легкой фракцией эритроцитов). При одноэтапном разделении крови истинной БоТП не образуется. Вместо этого получается смесь богатой и бедной тромбоцитами плазмы с крайне низкой концентрацией тромбоцитов. Независимо от скорости вращения центрифуги и времени центрифугирования разделение эритроцитов и тромбоцитов за один этап невозможно.

Из источника [RU 2305563 C2, 10.09.2007] известен способ получения богатой тромбоцитами аутоплазмы крови для регенерации трубчатой кости, заключающийся во введении в аутогенную кровь стабилизатора, ее центрифугировании, добавлении прокоагулянта, содержащего 10% раствор CaCl₂, и фактора свертывания крови протромбина. Центрифугирование проводят при комнатной температуре в течение 6-8 мин со скоростью 1000-2300 об/мин.

Ни в одном из указанных источников не содержатся сведения о том, что можно получить богатую тромбоцитами плазму высокой чистоты, с сохранением ее естественного состава, в которой сведены к минимуму или практически исключены эритроциты и лейкоциты.

Кроме того, авторам не известны аналогичные препараты, которые используют при подготовке плазмы для использования в методике плазмолифтинг, позволяющие отделить эритроциты и лейкоциты от плазмы, оставив плазму крови в естественном составе, без потери входящих в ее состав белков и изменения концентрации витаминов и гормонов, входящих в ее состав. Также авторам неизвестны, соответственно, и способы получения таких препаратов.

Таким образом, предлагаемое изобретение направлено на достижение технического результата, заключающегося в получении медицинского геля для подготовки плазмы для сепарации эритроцитов и лейкоцитов методом центрифугирования, для использования в методике плазмолифтинг, позволяющего отделить эритроциты и лейкоциты от плазмы, оставив плазму крови в естественном составе, без потери входящих в ее состав белков и изменения концентрации витаминов и гормонов, входящих в ее состав.

Технический результат также направлен разработку простого и дешевого способа получения медицинского геля для подготовки плазмы для сепарации эритроцитов и лейкоцитов, с использованием доступного сырья, без использования какого-либо специального оборудования, который не требует высоких энергетических затрат и который позволит получить медицинский гель, обладающий необходимыми свойствами, в частности определенной плотностью.

Технический результат достигается за счет использования медицинского геля для подготовки плазмы для сепарации эритроцитов и лейкоцитов методом центрифугирования, для использования в методике плазмолифтинг, содержащего, мас.%:

Полиизобутилен	58,5-59,5
Хлорированный парафин	19,5-20,5
Силикон диоксид	13,0-14,0
Пропиленгликоль гександиоевая кислота	остальное

Технический результат также достигается за счет разработки способа получения медицинского геля для подготовки плазмы для сепарации эритроцитов и лейкоцитов. Способ согласно изобретению включает следующие стадии:

- сначала в реакционную емкость помещают хлорпарафин (57% от исходного количества), нагретый до температуры 53-57°C,

- далее разогретый до такой же температуры полиизобутилен, который при данной температуре представляет собой мелкозернистую кашицу, постепенно вливают в емкость с хлорпарафином, постоянно перемешивая, получая гель;

- далее в остатке хлорпарафина (43 мас.% от исходного количества) растворяют пропиленгликоль гександиоевую кислоту и затем в образовавшуюся смесь замешивают 13,0 мас.% силикон диоксида,

- полученную смесь постепенно добавляют к получившемуся в реакционной емкости гелю и оставляют перемешиваться в течение 4 часов, причем интенсивность перемешивания устанавливают таким образом, чтобы исключить возникновение в полученном геле газовой фазы (пузырьков быть не должно).

Полученный гель должен иметь плотность (удельный вес) от 1050 г/л до 1060 г/л, поскольку именно этот диапазон плотности позволяет отделить эритроциты и лейкоциты, оставив тромбоциты в плазме крови при центрифугировании. Для корректировки плотности готового геля, при необходимости, используется остаток силикон диоксида (до 14,0 мас.%).

Гель, введенный в состав пробирки, отделяет эритроциты и лейкоциты от плазмы, сохраняя тромбоциты в плазме. Эритроциты и лейкоциты являются балластом. Использование полученного геля позволяет избавиться от этого балласта, который может вызвать побочные эффекты.

Действие геля для подготовки плазмы, полученного предложенным способом, заключается в следующем. Гель, под влиянием центробежного ускорения при центрифугировании, при использовании относительной силы центрифугирования в пределах от 835 до 1400 G, изменяет свои вязкостные характеристики, свойства текучести и плотность (свойство тиксотропии). В данном диапазоне значений относительной силы центрифугирования плотность геля находится в промежутке между значениями плотностей эритроцитов, а также лейкоцитов, с одной стороны, и тромбоцитов - с другой стороны. Таким образом, под воздействием центробежного ускорения эритроциты и лейкоциты погружаются в гель, а тромбоциты остаются в жидкой фазе. По окончании центрифугирования гель приобретает прежние характеристики вязкости и текучести и, соответственно, не позволяет обратного процесса - смешения эритроцитарной и лейкоцитарной массы с плазмой, в которой содержатся тромбоциты, необходимые для осуществления эффектов методики. Использование геля позволяет полностью отделить эритроциты и лейкоциты от плазмы, оставив плазму в естественном составе, без потери входящих в ее состав белков и изменения концентрации витаминов и гормонов, входящих в ее состав.

Полиизобутилен, входящий в состав геля, представляет собой полимер, имеющий общую структурную формулу: [-C(CH₃)CH₂-]_n. Полиизобутилен является собственно гелеобразующим веществом. В предложенном геле используется полимер со средней молекулярной массой 50000. Более низкое значение молекулярной массы полимера не дает необходимой вязкости геля в интактном состоянии, что, соответственно, не позволяет хранить пробирки с внесенным в них гелем в любом положении, а также не позволяет после центрифугирования исполнять функцию надежного барьера между плазмой и эритроцитарно-лейкоцитарной массой. Полимер с более высокой средней молекулярной массой при температуре до 140° остается недостаточно пластичным, что затрудняет его растворение. Данная концентрация полиизобутилена 58,5-59,5 мас.% позволяет достигнуть необходимой удельной массы геля при воздействии центробежного ускорения (около 1050-1060 г/л), что гарантированно выше плотности тромбоцитов (около 1030 г/л) и ниже плотностей эритроцитов и лейкоцитов (от 1060 г/л до 1100 г/л).

Хлорпарафин представляет собой низкомолекулярное полимерное соединение, имеющее общую структурную формулу: C_nH_2n-mCl_m, где n=10-30, m=1-24. В рамках настоящего изобретения используется продукт с массовой долей хлора 40%. Хлорпарафин выполняет функцию растворителя. Хлорпарафин выбран в качестве растворителя вследствие хорошей растворимости в нем полиизобутилена, малолетучести, негорючести и нетоксичности. Количество хлорпарафина 19,5-20,5 мас.% выбрано, поскольку в нем в этом количестве хорошо растворяется указанное количество полиизобутилена с образованием гелеобразной коллоидной системы.

Следует отметить, что плотность хлорпарафина (40% массы хлора) составляет 1,185-1,235 г/мл, что заведомо выше, чем та плотность геля, которую нужно достичь (1,05 г/мл), а плотность полиизобутилена заведомо ниже (0,880-0,910 г/см³). Чем больше берется легкого компонента, тем ниже плотность получаемого геля. Низкая плотность позволит тромбоцитам погружаться в гель при центрифугировании. Чем больше тяжелого компонента, тем плотность выше, и тогда перестанут в нем тонуть эритроциты и лейкоциты. Поэтому предложенное количественное соотношение полиизобутилена и хлорпарафина является оптимальным для осуществления центрифугирования.

Пропиленгликоль гександиоевая кислота (сложный эфир пропиленгликоля и адипиновой (гександиоевой) кислоты) используется в качестве пластификатора и придания гелю свойства тиксотропии, которые наиболее ярко выражены при содержании его в количестве приблизительно 7-8 мас.%.

Силикон диоксид (мелкодисперсный оксид кремния (SiO₂)) выполняет роль химически и биологически инертного наполнителя, корректирующего плотность получаемого геля до необходимых значений. Поскольку плотность полиизобутилена и хлорпарафина (ингредиенты, не имеющие строгой химической формулы) может варьироваться в зависимости от конкретной партии, необходимо корректировать плотность получаемого геля, что осуществляется путем изменения количества силикон диоксида, добавляемого в гель. Оптимальным является количество силикон диоксида 13,0-14,0 мас.%.

Пример

В реакционную емкость помещают 114 г хлорпарафина (57% от исходного количества (от 20 мас.%)) и на водяной бане нагревают до температуры 55°C. Далее 600 г (59 мас.%) полиизобутилена также нагревают на водяной бане до 55°C и затем тщательно смешивают с разогретым хлорпарафином. Остаток хлорпарафина 86 г (43% от исходного количества) также нагревают на водяной бане до 55°C и растворяют в нем навеску пропиленгликоль гександиоевой кислоты (70 г (7 мас.%)). После полного растворения кислоты в полученный раствор замешивают 130 г (13 мас.%) силикон диоксида. Полученную смесь постепенно добавляют в реакционную емкость, постоянно перемешивая образующийся гель. Интенсивность перемешивания устанавливают таким образом, чтобы добиться однородной структуры геля без присутствия газовой фазы (пузырьков). Для корректировки плотности готового геля используется остаток (10 г) мелкодисперсного диоксида кремния, т.е. общее количество силикон диоксида в геле составляет 13,0-14,0 мас.%. В результате плотность полученного геля соответствует необходимому значению (от 1050 г/л до 1060 г/л). Поскольку именно этот диапазон плотности позволяет отделить эритроциты и лейкоциты, оставив тромбоциты в плазме крови при центрифугировании, то полученный гель можно применять для разделения указанных компонентов методом центрифугирования, поскольку он обладает всеми необходимыми свойствами.

Полученный гель вводят в пробирки для центрифугирования, используемые для получения богатой тромбоцитами плазмы, туда же помещают кровь пациента. Проводят центрифугирование крови, при использовании относительной силы центрифугирования в пределах от 835 до 1400 G. Под воздействием центробежного ускорения эритроциты и лейкоциты погружаются в гель, а тромбоциты остаются в жидкой фазе. По окончании центрифугирования гель приобретает прежние характеристики вязкости и текучести и не позволяет смешения эритроцитарной и лейкоцитарной массы с плазмой, в которой содержатся тромбоциты.

Таким образом, предложенный способ позволяет получить медицинский гель, который позволяет получать богатую тромбоцитами плазму высокой чистоты, которая не содержит эритроцитов и лейкоцитов, с сохранением ее естественного состава, без потери входящих в ее состав белков и изменения концентрации витаминов и гормонов, входящих в ее состав. Способ простой и дешевый, при получении геля используют доступное сырье, способ осуществляют без использования какого-либо специального оборудования, не требует высоких энергетических затрат, и позволяет получить медицинский гель, обладающий необходимыми свойствами, в частности плотностью, которая позволяет использовать полученный по указанному назначению.

Плазму, полученную при использовании геля, которая богата тромбоцитами, можно использовать в методике плазмолифтинг.

Способ получения медицинского геля, применяемого для сепарации эритроцитов и лейкоцитов методом центрифугирования, включающий следующую последовательность стадий:- в реакционную емкость помещают хлорпарафин, нагретый до температуры 53-57°C, в количестве 57 мас.% от общего количества хлорпарафина, которое составляет 19,5-20,5 мас.% от общей массы геля;- разогретый до такой же температуры полиизобутилен в количестве 58,5-59,5 мас.% постепенно вливают в емкость с хлорпарафином, постоянно перемешивая, получая гель;- в остатке хлорпарафина растворяют пропиленгликоль гександиоевую кислоту, по меньшей мере, 7 мас.% и затем в образовавшуюся смесь замешивают, по меньшей мере, 13,0 мас.% силикон диоксида;- полученную смесь постепенно добавляют к получившемуся в реакционной емкости гелю и оставляют перемешиваться в течение 4 ч с получением продукта, имеющего плотность от 1050 г/л до 1060 г/л,причем интенсивность перемешивания устанавливают таким образом, чтобы исключить возникновение в полученном геле газовой фазы, и для корректировки плотности готового геля, при необходимости, используется силикон диоксид, причем общее количество силикон диоксида в геле составляет 13,0-14,0 мас.%.