Композиция, содержащая антитело, которое связывается с доменом ii her2, и его кислые варианты

Композиция, содержащая антитело, которое связывается с доменом ii her2, и его кислые варианты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственные заявки

Настоящая заявка притязает на приоритет предварительной заявки на выдачу патента США № 61/024825, поданной 30 января 2008, описание которой включено в настоящую заявку в виде ссылки в полном объеме для всех целей.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей HER2-антитело главного типа, которое связывается с доменом II HER2, и его кислым вариантам. Изобретение также относится к фармацевтическим препаратам, содержащим композицию, и терапевтическим применениям композиции.

Уровень техники

Представители семейства рецепторных тирозинкиназ HER являются важными медиаторами клеточного роста, дифференцировки и жизнеспособности. Семейство рецепторов включает четыре отдельных представителя, в том числе рецептор эпидермального фактора роста (EGFR, ErbB1 или HER1), HER2 (ErbB2 или p185neu), HER3 (ErbB3) и HER4 (ErbB4 или tyro2).

EGFR, кодируемый геном erbB1, причинно вовлечен в развитие злокачественных новообразований у человека. В частности, повышенную экспрессию EGFR наблюдали в злокачественной опухоли молочной железы, мочевого пузыря, легкого, головы, шеи и желудка, а также при глиобластомах. Повышенная экспрессия рецептора EGFR часто ассоциирована с повышенной продукцией лиганда EGFR, трансформирующего фактора роста альфа (TGF-α), некоторыми опухолевыми клетками, приводящей к активации рецептора посредством аутокринного пути стимуляции. Baselga and Mendelsohn, Pharmac. Ther. 64: 127-154 (1994). Моноклональные антитела, направленные против EGFR или его лигандов, TGF-α и EGF, оценивали в качестве терапевтических средств для лечения таких злокачественных заболеваний. См., например, Baselga and Mendelsohn, выше; Masui et al. Cancer Research 44: 1002-1007 (1984); и Wu et al. J. Clin. Invest. 95: 1897-1905 (1995).

Второй представитель семейства HER, p185neu, исходно идентифицировали в качестве продукта трансформирующего гена из нейробластом химически обработанных крыс. Активированная форма протоонкогена neu возникает в результате точечной мутации (валин на глутаминовую кислоту) в трансмембранной области кодируемого белка. Амплификацию гомолога neu человека наблюдали при раке молочной железы и яичника, что коррелировало с плохим прогнозом (Slamon et al., Science, 235: 177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244: 707-712 (1989); и патент США No. 4968603). До настоящего времени не сообщалось о точечной мутации, аналогичной точечной мутации в протоонкогене neu, в случае опухолей человека. Сверхэкспрессию HER2 (часто, но не всегда вследствие амплификации гена) также наблюдали в других карциномах, включая карциномы желудка, эндометрия, слюнной железы, легкого, почки, ободочной кишки, щитовидной железы, поджелудочной железы и мочевого пузыря. См. наряду с другими публикациями King et al., Science, 229:974 (1985); Yokota et al., Lancet: 1:765-767 (1986); Fukushige et al., Mol Cell Biol, 6:955-958 (1986); Guerin et al., Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Res., 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol Oncol, 38:364 (1990); Werners et al., Cancer Res., 50:421-425 (1990); Kern et al., Cancer Res., 50:5184 (1990); Park et al., Cancer Res., 49:6605 (1989); Zhau et al, Mol Carcinog., 3:254-257 (1990); Aasland et al. Br.J. Cancer 57:358-363 (1988); Williams et al. Pathobiology 59:46-52 (1991); и McCann et al., Cancer, 65:88-92 (1990). HER2 может быть сверхэкспрессирован в злокачественной опухоли простаты (Gu et al., Cancer Lett. 99: 185-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol. 28: 827-33 (1997); Ross et al., Cancer 79: 2162-70 (1997); и Sadasivan et al., J. Urol. 150: 126-31 (1993)).

Описаны антитела, направленные против белковых продуктов p185neu крысы и HER2 человека. Drebin с соавторами получили антитела против продукта гена neu крысы, p185neu. См., например, Drebin et al., Cell 41: 695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym. 198: 277-290 (1991); и WO94/22478. В публикации Drebin et al. Oncogene 2: 273-277 (1988) сообщается, что смеси антител, взаимодействующих с двумя разными областями p185neu, приводят к синергетическому противоопухолевому воздействию на neu-трансформированные клетки NIH-3T3, имплантированные мышам nude. См. также патент США № 5824311, опубликованный 20 октября 1998.

В публикации Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9(3): 1165-1172 (1989) описано создание панели антител к HER2, которые были охарактеризованы с использованием линии клеток опухоли молочной железы человека SK-BR-3. Относительную пролиферацию клеток SK-BR-3 после воздействия антител определяли окрашиванием монослоя кристаллическим фиолетовым через 72 часа. С помощью такого анализа максимальное ингибирование получали с использованием антитела, названного 4D5, которое ингибировало пролиферацию клеток на 56%. Другие антитела в панели в данном анализе снижали пролиферацию клеток в меньшей степени. Кроме того, обнаружено, что антитело 4D5 сенсибилизировало линии опухолевых клеток молочной железы, сверхэкспрессирующих HER2, к цитотоксическому действию TNF-α. См. также патент США № 5677171, опубликованный 14 октября 1997. HER2-антитела, обсуждаемые в работе Hudziak с соавторами, дополнительно охарактеризованы в Fendly et al. Cancer Research 50:1550-1558 (1990); Kotts et al. In Vitro 26(3):59A (1990); Sarup et al. Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard et al. J. Clin. Immunol. 11(3): 117-127 (1991); Kumar et al. Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986 (1991); Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras et al. Oncogene 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al. Cancer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665 (1994); Scott et al. J. Biol. Chem. 266:14300-5 (1991); D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7202-7206 (1994); Lewis et al. Cancer Research 56:1457-1465 (1996); и Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997).

Рекомбинантный гуманизированный вариант мышиного HER2-антитела 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, трастузумаб или HERCEPTIN^®; патент США № 5821337) является клинически активным у пациентов с метастатическими злокачественными опухолями молочной железы, сверхэкспрессирующими HER2, которые получали экстенсивную предварительную противоопухолевую терапию (Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996)). Трастузумаб был разрешен для реализации управлением по контролю за продуктами питания и лекарствами 25 сентября 1998 для лечения пациентов с метастатическим раком молочной железы, опухоли у которых сверхэкспрессируют белок HER2.

Другие HER2-антитела с различными свойствами описаны в Tagliabue et al. Int. J. Cancer 47:933-937 (1991); McKenzie et al. Oncogene 4:543-548 (1989); Maier et al. Cancer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus et al. Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus et al. Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al. Int. J. Cancer 53:401-408 (1993); WO94/00136; Kasprzyk etal. Cancer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock et al. Cancer Res. 51:4575-4580 (1991); Shawver et.al., Cancer Res. 54:1367-1373 (1994); Arteaga etal. Cancer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwerth etal. J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992); U.S. Patent No. 5,783,186; и Klapper et al. Oncogene 14:2099-2109 (1997); патент США № 5783186; и Klapper et al. Oncogene 14: 2099-2109 (1997).

Скрининг гомологии привел к идентификации двух других представителей семейства рецепторов HER; HER3 (патенты США № 5183884 и 5480968, а также Kraus et al., PNAS (USA) 86: 9193-9197 (1989)) и HER4 (заявка на выдачу патента EP № 599274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993); и Plowman et al., Nature, 366: 473-475 (1993)). Оба указанных рецептора имеют повышенную экспрессию, по меньшей мере, в некоторых линиях клеток рака молочной железы.

Рецепторы HER обычно обнаруживают в клетках в различных сочетаниях, и считается, что гетеродимеризация увеличивает разнообразие клеточных ответов на множество лигандов HER (Earp et al. Breast Cancer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)). EGFR связывается шестью разными лигандами; эпидермальным фактором роста (EGF), трансформирующим фактором роста альфа (TGF-α), амфирегулином, связывающим гепарин эпидермальным фактором роста (HB-EGF), бетацеллюлином и эпирегулином (Groenen et al. Growth Factors 11: 235-257 (1994)). Семейство белков херегулинов, образуемых в результате альтернативного сплайсинга одного гена, являются лигандами для HER3 и HER4. Семейство херегулинов включает альфа-, бета- и гамма-херегулины (Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992); патент США № 5641869; и Schaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997)); факторы дифференцировки neu (NDF), глиальные факторы роста (GGF); активность, индуцирующую рецептор ацетилхолина (ARIA); и фактор, полученный из сенсорных и мотонейронов (SMDF). Обзор См. в Groenen et al. Growth Factors 11: 235-257 (1994); Lemke, G. Molec. and Cell. Neurosci. 7: 247-262 (1996) и Lee et al. Pharm. Rev. 47: 51-85 (1995). Недавно идентифицированы три дополнительных лиганда HER; нейрегулин-2 (NRG-2), который, как сообщается, связывает либо HER3, либо HER4 (Chang et al. Nature 387: 509-512 (1997); и Carraway et al. Nature 387: 512-516 (1997)); нейрегулин-3, который связывает HER4 (Zhang et al. PNAS (USA) 94(18): 9562-7 (1997)); и нейрегулин-4, который связывает HER4 (Harari et al. Oncogene 18: 2681-89 (1999)). HB-EGF, бетацеллюлин и эпирегулин также связываются с HER4.

Хотя EGF и TGFα не связывают HER2, EGF стимулирует EGFR и HER2 к образованию гетеродимера, который активирует EGFR и приводит к трансфосфорилированию HER2 в гетеродимере. Димеризация и/или трансфосфорилирование, по-видимому, активируют тирозинкиназу HER2. См. Earp et al., выше. Подобным образом, когда HER3 коэкспрессируется с HER2, образуется активный комплекс передачи сигнала, и антитела, направленные против HER2, способны разрушать такой комплекс (Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)). Кроме того, аффинность HER3 по отношению к херегулину (HRG) повышается до состояния более высокой аффинности в случае коэкспрессии с HER2. См. также, Levi et al., Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1431-1435 (1995); и Lewis et al., Cancer Res., 56: 1457-1465 (1996) в отношении комплекса белков HER2-HER3. HER4, подобно HER3, образует активный комплекс передачи сигнала с HER2 (Carraway and Cantley, Cell 78: 5-8 (1994)).

Чтобы целенаправленно воздействовать на путь передачи сигнала HER, было разработано rhuMAb 2C4 (пертузумаб), в виде гуманизированного антитела, которое ингибирует димеризацию HER2 с другими рецепторами HER, тем самым ингибируя управляемое лигандом фосфорилирование и активацию, а также активацию ниже по ходу путей RAS и AKT. В фазе I испытаний пертузумаба, в качестве единственного средства лечения солидных опухолей, 3 пациента с раком яичника на поздней стадии подвергались лечению пертузумабом. У одного пациента наблюдали длительный частичный ответ, и у другого пациента имело место стабильное заболевание в течение 15 недель. Agus et al. Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22: 192, Abstract 771 (2003).

Композиции вариантов антител

В патенте № 6339142 описана композиция HER2-антител, содержащая смесь анти-HER2 антитела и одного или нескольких его кислых вариантов, при этом количество кислого варианта (вариантов) составляет менее чем примерно 25%. Трастузумаб является примером HER2-антитела.

В стендовом докладе Reid с соавторами, представленном на конференции по хорошо охарактеризованным биотехнологическим фармацевтическим препаратам (Well Characterized Biotech Pharmaceuticals conference) (январь 2003), "Effects of Cell Culture Process Changes on Humanized Antibody Characteristics", описана композиция не имеющих названия гуманизированных IgG1-антител, гетерогенных на N-конце вследствие сочетания сигнального пептида VHS, N-концевого глутамина и пироглутаминовой кислоты в их тяжелой цепи.

В докладе Harris с соавторами "The Ideal Chromatographic Antibody Characterization Method, представленном на конференции по получению антител IBC (февраль 2002), сообщается о приращении VHS на тяжелой цепи E25, гуманизированного анти-IgE-антитела.

В стендовом докладе Rouse с соавторами, представленном на WCBP "Top Down' Glycoprotein Characterization by High Resolution Mass Spectrometry and Its Application to Biopharmaceutical Development" (6-9 января 2004), описана композиция моноклонального антитела с N-концевой гетерогенностью в результате остатков сигнального пептида -3AHS или -2HS в его легкой цепи.

В презентации на конференции IBC (сентябрь 2000) "Стратегическое использованием исследований и анализов совместимости для получения хорошо охарактеризованных биологических препаратов" Jill Porter приводит обсуждение поздно элюируемой формы ZENAPAXTM с тремя дополнительными аминокислотными остатками в его тяжелой цепи.

В US2006/0018899 описана композиция, содержащая антитело пертузумаб главного типа и вариант с удлинением в виде аминоконцевого лидера, а также другие формы вариантов антитела пертузумаба.

Сущность изобретения

Согласно первому аспекту изобретение относится к композиции, содержащей HER2-антитело главного типа, которое связывается с доменом II HER2, и его кислые варианты, при этом кислые варианты включают гликозилированный вариант, вариант с восстановленной дисульфидной связью или невосстанавливаемый вариант. Предпочтительно кислыми вариантами являются гликозилированный вариант, дезаминированный вариант, вариант с восстановленной дисульфидной связью, сиалилированный вариант и невосстанавливаемый вариант. Желательно количество кислых вариантов составляет менее чем примерно 25%.

В другом аспекте изобретение относится к композиции, содержащей HER2-антитело главного типа, включающее вариабельные последовательности легкой цепи и вариабельные последовательности тяжелой цепи в SEQ ID NO: 3 и 4, соответственно, и кислые варианты антитела главного типа, при этом кислые варианты включают гликозилированный вариант, дезаминированный вариант, вариант с восстановленной дисульфидной связью, сиалилированный вариант и невосстанавливаемый вариант.

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим композиции в фармацевтически приемлемом носителе.

Кроме того, изобретение относится к способу лечения HER2-позитивной злокачественной опухоли у пациента, включающему введение фармацевтического препарата пациенту в количестве, эффективном для лечения злокачественной опухоли. Что касается таких способов, как показано в примере, приведенном в настоящем описании, предпочтительно, чтобы антитело главного типа и кислые варианты имели по существу одну и ту же фармакокинетику.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, включающему: (1) получение композиции, содержащей HER2-антитело главного типа, которое связывается с доменом II HER2, и его кислые варианты, включая гликозилированный вариант, вариант с восстановленной дисульфидной связью или невосстанавливаемый вариант, и (2) оценку кислых вариантов в композиции и подтверждение того, что их количество составляет менее чем примерно 25%. В одном варианте осуществления изобретения кислые варианты оценивают способом, выбранным из группы, состоящей из ионообменной хроматографии, при которой композицию обрабатывают сиалидазой, капиллярного электрофореза в восстанавливающих условиях с использованием додецилсульфата натрия (CE-SDS), CE-SDS в не восстанавливающих условиях, хроматографии с использованием бороната и картирования пептидов.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 показана схема структуры белка HER2 и аминокислотные последовательности доменов I-IV (SEQ ID NO: 19-22, соответственно) его внеклеточного домена.

На фигурах 2A и 2B изображено выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельного домена легкой цепи (VL) (фиг. 2A) и вариабельного домена тяжелой цепи (VH) (фиг. 2B) мышиного моноклонального антитела 2C4 (SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно); доменов VL и VH варианта 574 гуманизированного 2C4 (SEQ ID NO: 3 и 4, соответственно) и консенсусных каркасов VL и VH человека (hum κl, подгруппа I легкой цепи каппа; humIII, подгруппа III тяжелой цепи) (SEQ ID NO: 5 и 6, соответственно). Звездочками отмечены различия между вариантом 574 гуманизированного 2C4 и мышиным моноклональным антителом 2C4 или между вариантом 574 гуманизированного 2C4 и каркасом человека. Определяющие комплементарность области (CDR) указаны в квадратных скобках.

На фигурах 3A и 3B показаны аминокислотные последовательности легкой цепи (SEQ ID NO: 15) и тяжелой цепи (SEQ ID NO: 16) пертузумаба. CDR показаны жирным шрифтом. Остаток углевода связан с Asn 299 тяжелой цепи.

На фигурах 4A и 4B показаны аминокислотные последовательности легкой цепи (SEQ ID NO: 17) и тяжелой цепи (SEQ ID NO: 18) пертузумаба, каждая из которых содержит интактную аминоконцевую последовательность сигнального пептида.

На фигуре 5 схематично изображено связывание 2C4 с участком связывания HER2 в гетеродимере, которое предотвращает гетеродимеризацию с активированным EGFR или HER3.

На фигуре 6 изображена связь HER2/HER3 с путями MAPK и Akt.

На фигуре 7 показано сравнение активностей трастузумаба и пертузумаба.

На фигурах 8A и 8B показаны аминокислотные последовательности легкой цепи (SEQ ID NO: 13) и тяжелой цепи (SEQ ID NO: 14) трастузумаба.

На фигурах 9A и 9B изображена последовательность легкой цепи варианта пертузумаба (SEQ ID NO: 23) и последовательность тяжелой цепи варианта пертузумаба (SEQ ID NO: 24).

На фигуре 10 показана схема эксперимента по выделению MP (главного пика) и AV (кислых вариантов) при катионном обмене, культивированию клеток, извлечению и оценке ФК (фармакокинетики) и аналитическим испытаниям. Свежая среда = стандартная среда; использованная среда = стандартная среда после 12 суток культивирования клеток, клетки извлекали центрифугированием. Растворенный кислород, pH и другие параметры не контролировали.

На фигуре 11 показана типичная катионообменная хроматограмма (CEX) DIONEX PROPACTM из примера 1.

На фигуре 12 показан анализ исходного вещества пертузумаба и фракции CEX. AV = кислый вариант, MP = главный пик и BV = вариант со свойствами основания.

На фигуре 13 показана CEX главного пика (MP), введенного в среду культивирования клеток и инкубированного в течение 12 суток.

На фигуре 14 описаны условия инкубации главного пика.

На фигуре 15 обобщены способы характеристики кислых вариантов.

На фигуре 16 показана концентрация пертузумаба в зависимости от времени в исследовании ФК в примере 1.

На фигуре 17 показана площадь под кривой (AUC) и средние геометрические отношения, полученные в исследовании ФК в примере 1.

Подробное описание предпочтительных вариантов

I. Определения

Термин "антитело главного типа" в настоящем описании относится к структуре с аминокислотной последовательностью антитела в композиции, которая является количественно преобладающей молекулой антитела в композиции. Предпочтительно антителом главного типа является HER2-антитело, такое как антитело, которое связывается с доменом II HER2, антитело, которое ингибирует димеризацию HER более эффективно, чем трастузумаб, и/или антитело, которое связывается с участком связывания HER2 в гетеродимере. В предпочтительном варианте настоящего изобретения антителом главного типа является антитело, содержащее аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 3 и 4 и наиболее предпочтительно содержащее аминокислотные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи SEQ ID NO: 15 и 16 (пертузумаб).

Антитело с "вариантом аминокислотной последовательности" в настоящем описании означает антитело с аминокислотной последовательностью, которая отличается от последовательности антитела главного типа. Обычно варианты аминокислотной последовательности будут обладать, по меньшей мере, примерно 70% гомологией с антителом главного типа, и предпочтительно они будут, по меньшей мере, примерно на 80%, и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 90% гомологичны антителу главного типа. Варианты аминокислотной последовательности имеют замены, делеции и/или добавления в некоторых положениях в пределах или вблизи аминокислотной последовательности антитела главного типа. Примерами вариантов аминокислотной последовательности согласно настоящему изобретению являются кислый вариант (например, дезаминированный вариант антитела), вариант со свойствами основания, антитело с удлинением в виде аминоконцевого лидера (например, VHS-) в одной или двух легких цепях антитела, антитело с C-концевым остатком лизина в одной или двух тяжелых цепях антитела, антитело с одним или несколькими окисленными остатками метионина и т.д. и включают сочетания изменений аминокислотных последовательностей тяжелой и/или легкой цепей.

"Кислый вариант" означает вариант антитела главного типа, который является более кислым, чем антитело главного типа. Кислый вариант приобретает отрицательный заряд или теряет положительный заряд по сравнению с антителом главного типа. Такие кислые варианты могут быть отделены с использованием методики разделения, такой как ионообменная хроматография, которая позволяет разделять белки в соответствии с зарядом. Кислые варианты антитела главного типа элюируются раньше, чем главный пик, при разделении катионообменной хроматографией.

"Вариант с восстановленной дисульфидной связью" имеет еще один связанный дисульфидной связью цистеин (цистеины), химически восстановленный до формы свободного тиола. Такой вариант можно наблюдать с использованием основанной на гидрофобном взаимодействии хроматографии или способом разделения по размеру, таким как капиллярный электрофорез с додецилсульфатом натрия (CE-SDS), например, как описано в примере 1. В настоящем описании "невосстанавливаемый вариант" означает вариант антитела главного типа, который не может быть химически восстановлен до тяжелой и легкой цепи обработкой восстановителем, таким как дитиотреитол. Такие варианты можно оценивать посредством обработки композиции восстановителем и оценки полученной композиции с использованием методики, которая позволяет оценивать размер белка, такой как капиллярный электрофорез с додецилсульфатом натрия (CE-SDS), например с использованием методики, описанной в примере 1 ниже.

Антитело с "вариантом гликозилирования" в данном описании означает антитело с одним или несколькими связанными с ним углеводными остатками, которые отличаются от одного или нескольких углеводных остатков, связанных с антителом главного типа. Примеры вариантов гликозилирования согласно изобретению включают антитело с G1- или G2-олигосахаридной структурой вместо G0-олигосахаридной структуры, связанной с его Fc-областью, антитело с одним или двумя углеводными остатками, связанными с одной или двумя легкими цепями, антитело, не содержащее углевода, связанного с одной или двумя тяжелыми цепями антитела, антитело, которое сиалилировано, и т.д., а также сочетания таких изменений гликозилирования.

В том случае, когда антитело имеет Fc-область, олигосахаридная структура, такая как структура, показанная на фиг. 14 в данном описании, может быть связана с одной или двумя тяжелыми цепями антитела, например по остатку 299. В случае пертузумаба преобладающей олигосахаридной структурой была структура G0, при этом другие олигосахаридные структуры, такие как G0-F, G-1, Man5, Man6, G1-1, G1(1-6), G1(1-3) и G2, обнаружены в меньших количествах в композиции пертузумаба.

Если не оговорено особо, "олигосахаридная структура G1" в данном описании включает структуры G1(1-6) и G1(1-3).

В целях настоящего описания "сиалилированный вариант" означает вариант антитела главного типа, содержащий один или несколько сиалилированных углеводных остатков, связанных с одной или двумя тяжелыми цепями такого антитела. Сиалилированный вариант можно выявить при оценке композиции (например, при ионообменной хроматографии) с обработкой или без обработки сиалидазой, например, как описано в примере.

"Гликозилированный вариант" означает антитело, с которым был ковалентно связан сахар, такой как глюкоза. Такое добавление может быть осуществлено в результате взаимодействия глюкозы с остатком лизина в белке (например, в среде для культивирования клеток). Гликозилированный вариант может быть идентифицирован в масс-спектрометрическом анализе восстановленного антитела, при котором оценивают увеличение массы тяжелой и легкой цепей. Гликозилированный вариант также можно количественно оценить хроматографией с использованием бороната, пояснения к которой приведены в примере 1 ниже. Гликозилированный вариант отличается от антитела с вариантом гликозилирования.

"Дезаминированное" антитело представляет собой антитело, в котором один или несколько остатков аспарагина дериватизованы, например, до аспарагиновой кислоты, сукцинимида или изо-аспарагиновой кислоты. Примером дезаминированного антитела является вариант пертузумаба, в котором Asn-386 и/или Asn-391 в одной или двух тяжелых цепях пертузумаба дезаминированы.

"Вариант с удлинением в виде аминоконцевого лидера" в данном описании относится к антителу главного типа с одним или несколькими аминокислотными остатками аминоконцевой лидерной последовательности на аминоконце любой одной или нескольких тяжелых или легких цепей антитела. Типичное удлинение в виде аминоконцевого лидера содержит или состоит из трех аминокислотных остатков, VHS, присутствующих на одной или обеих легких цепях варианта антитела.

"Гомологию" определяют как процент остатков в варианте аминокислотной последовательности, которые идентичны после выравнивания последовательностей и введения пробелов, если это необходимо, чтобы добиться максимальной гомологии в процентах. Способы и компьютерные программы для выравнивания хорошо известны в данной области. Одной из таких компьютерных программ является программа "Align 2", разработанная Genentech, Inc., которая была подана вместе с документацией для пользователя в Бюро охраны авторских прав США, Washington, DC 20559, 10 декабря 1991.

В целях настоящего описания "катионообменный анализ" относится к любому способу, при котором композицию, содержащую два или более соединений, разделяют на основе различий зарядов, используя катионообменник. Катионообменник обычно содержит ковалентно связанные отрицательно заряженные группы. Предпочтительно в данном случае катионообменник является слабым катионообменником и/или содержит карбоксилатную функциональную группу, например катионообменная колонка PROPAC WCX-10TM, продаваемая Dionex.

"HER-рецептор" является рецепторной тирозиновой протеинкиназой, которая относится к семейству HER-рецепторов и включает рецепторы EGFR, HER2, HER3 и HER4 и других представителей такого семейства, которые будут идентифицированы в будущем. HER-рецептор, как правило, может содержать внеклеточный домен, который может связывать лиганд HER; липофильный трансмембранный домен; консервативный внутриклеточный тирозинкиназный домен; и находящийся на карбоксильном конце домен передачи сигнала, несущий несколько остатков тирозина, которые могут быть фосфорилированы. Предпочтительно HER-рецептор представляет собой HER-рецептор человека с нативной последовательностью.

Внеклеточный домен HER2 содержит четыре домена: домен I (аминокислотные остатки примерно от 1 до 195), домен II (аминокислотные остатки примерно от 196 до 319), домен III (аминокислотные остатки примерно от 320 до 488) и домен IV (аминокислотные остатки примерно от 489 до 630) (нумерация остатков без сигнального пептида). См. Garrett et al. Mol. Cell. 11: 495-505 (2003), Cho et al. Nature 421: 756-760 (2003), Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328 (2004) и Plowman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 1746-1750 (1993). Также см. фиг. 1 в данном описании.

Термины "ErbB1", "HER1", "рецептор эпидермального фактора роста" и "EGFR" используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и они относятся к EGFR, который описан, например, в Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56: 881-914 (1987), включая его встречающиеся в природе мутантные формы (например, делеционный мутант EGFR, который описан в Humphrey et al. PNAS (USA) 87: 4207-4211 (1990)). ErbB1 относится к гену, кодирующему белковый продукт EGFR.

Выражения "ErbB2" и "HER2" используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и они относятся к белку HER2 человека, описанному, например, в Semba et al., PNAS (USA) 82: 6497-6501 (1985) и Yamamoto et al. Nature 319: 230-234 (1986) (номер доступа в Genebank X03363). Термин "erbB2" относится к гену, кодирующему ErbB2 человека, и "neu" относится к гену, кодирующему p185neu крысы. Предпочтительный HER2 представляет собой HER2 человека с нативной последовательностью.

"ErbB3" и "HER3" относятся к полипептиду рецептора, который описан, например, в патентах США № 5183884 и 5480968, а также в Kraus et al. PNAS (USA) 86: 9193-9197 (1989).

Термины "ErbB4" и "HER4" в настоящем описании относятся к полипептиду рецептора, который описан, например, в заявке на выдачу патента EP № 599274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993); и Plowman et al., Nature, 366: 473-475 (1993), включая его изоформы, которые описаны, например, в WO99/19488, опубликованной 22 апреля 1999.

Под "лигандом HER" подразумевают полипептид, который связывается и/или активирует рецептор HER. Лиганд HER, представляющий особый интерес согласно настоящему изобретению, является лигандом HER человека с нативной последовательностью, таким как эпидермальный фактор роста (EGF) (Savage et al., J. Biol. Chem. 247: 7612-7621 (1972)); трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α) (Marquardt et al., Science 223: 1079-1082 (1984)); амфирегулин, также известный как аутокринный фактор роста шванномы и кератиноцитов (Shoyab et al. Science 243: 1074-1076 (1989); Kimura et al. Nature 348: 257-260 (1990); и Cook et al. Mol. Cell. Biol. 11: 2547-2557 (1991)); бетацеллюлин (Shing et al., Science 259: 1604-1607 (1993); и Sasada et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 190: 1173 (1993)); гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science 251: 936-939 (1991)); эпирегулин (Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270: 7495-7500 (1995); и Komurasaki et al. Oncogene 15: 2841-2848 (1997)); херегулин (См. ниже); нейрегулин-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature 387: 512-516 (1997)); нейрегулин-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 9562-9567 (1997)); нейрегулин-4 (NRG-4) (Harari et al. Oncogene 18: 2681-89 (1999)); и cripto-(CR-1) (Kannan et al. J. Biol. Chem. 272(6): 3330-3335 (1997)). Лиганды HER, которые связывают EGFR, включают EGF, TGF-α, амфирегулин, бетацеллюлин, HB-EGF и эпирегулин. Лиганды HER, которые связывают HER3, включают херегулины. Лиганды HER, способные связывать HER4, включают бетацеллюлин, эпирегулин, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 и херегулины.

"Херегулин" (HRG) при использовании в настоящем описании относится к полипептиду, кодируемому продуктом гена херегулина, который описан в патенте США № 5641869 или в Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993). Примеры херегулинов включают херегулин-α, херегулин-β1, херегулин-β2 и херегулин-β3 (Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992) и патент США № 5641869); фактор дифференцировки neu (NDF) (Peles et al. Cell 69: 205-216 (1992)); активность, индуцирующая рецептор ацетилхолина (ARIA) (Falls et al. Cell 72: 801-815 (1993)); глиальные факторы роста (GGF) (Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993)); фактор, полученный из сенсорных нейронов и мотонейронов (SMDF) (Ho et al. J. Biol. Chem. 270: 14523-14532 (1995)); γ-херегулин (Schaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997)). Термин включает биологически активные фрагменты и/или варианты аминокислотной последовательности полипептида HRG с нативной последовательностью, такие как его фрагмент EGF-подобного домена (например, HRGβ1177-244).

"Димер HER" в настоящем описании означает нековалентно связанный димер, содержащий, по меньшей мере, два HER-рецептора. Такие комплексы могут образовываться, когда на клетку, экспрессирующую два или более HER-рецепторов, воздействует лиганд HER, и они могут быть выделены иммунопреципитацией и проанализированы в SDS-ПААГ, как описано, например, в Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994). Примеры таких димеров HER включают гетеродимеры EGFR-HER2, HER2-HER3 и HER3-HER4. Кроме того, димер HER может содержать два или более HER2-рецепторов, объединенных с другим HER-рецептором, таким как HER3, HER4 или EGFR. С димером могут быть ассоциированы другие белки, такие как субъединица рецептора цитокина (например, gp130).

"Участок связывания в гетеродимере" HER2 относится к области во внеклеточном домене HER2, которая контактирует или служит местом связывания с областью во внеклеточном домене EGFR, HER3 или HER4 при образовании с ними димера. Область обнаружена в домене II HER2. Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328 (2004).

"Активация HER" или "активация HER2" относится к активации или фосфорилированию любого одного или нескольких рецепторов HER или рецепторов HER2. В общем, активация HER приводит к трансдукции сигнала (например, трансдукции сигнала, вызванной внутриклеточным киназным доменом HER-рецептора, фосфорилирующим остатки тирозина в HER-рецепторе или полипептиде субстрата). Активация HER может быть опосредована связыванием лиганда HER с димером HER, содержащим представляющий интерес рецептор HER. Связывание лиганда HER с димером HER может активировать киназный домен одного или нескольких HER-рецепторов в димере и тем самым приводить к фосфорилированию остатков тирозина в одном или нескольких HER-рецепторах и/или к фосфорилированию остатков тирозина в дополнительном субстратном полипептиде(дах), таком как внутриклеточные киназы Akt или MAPK.

Термин "антитело" в настоящем описании используют в самом широком смысле, и термин специально охватывает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), образованные, по меньшей мере, из двух интактных антител, и фрагменты антител, при условии, что они проявляют требуемую биологическую активность.

Термин "моноклональное антитело" в используемом в настоящем описании смысле относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными и/или связывают один и тот же эпитоп, за исключением возможных вариантов, которые могут возникать во время получения моноклонального антитела, таких как варианты, описанные в настоящей публикации. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно содержат разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Кроме своей специфичности моноклональные антитела имеют преимущество, состоящее в том, что они не содержат примесей других иммуноглобулинов. Определение "моноклональное" указывает на природу антитела, как антитела, полученного из по существу гомогенной популяции антител, и его не следует рассматривать как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, применяемые согласно настоящему изобретению, могут быть получены способом на основе гибридом, впервые описанным в Kohler et al., Nature 256: 495 (1975), или могут быть получены способами на основе рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 4816567). "Моноклональные антитела" также могут быть выделены из фаговых библиотек антител с использованием способов, описанных, например, в Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).

Моноклональные антитела в настоящем описании специально включают "химерные" антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от конкретного вида, или относящихся к конкретному классу или подклассу антител, тогда как остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от другого вида, или относящихся к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют требуемую биологическую активность (патент США № 4816567 и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)). Химерные антитела, представляющие интерес согласно настоящему изобретению, включают "приматизированные" антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена, полученные от примата, отличного от человека (например, обезьяны Старого Света, человекообразные обезьяны и т.д.), и последовательности константной области человека.

"Фрагменты антител" содержат часть интактного антитела, предпочтительно включающую его антигенсвязывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab'₎₂ и Fv; диантитела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител и полиспецифичные антитела, образованные из фрагмента(ов) антител.

"Интактное антитело" представляет собой антитело, которое содержит антигенсвязывающую вариабельную область, а также константный домен легкой цепи (C_L) и константные домены тяжелой цепи, C_H1, C_H2 и C_H3. Константные домены могут быть константными доменами с нативной последовательностью (например, константные домены человека с нативной последовательностью) или с вариантами аминокислотной последовательности. Предпочтительно интактное антитело обладает одной или несколькими эффекторными функциями и содержит олигосахаридную структуру, связанную с его одной или двумя тяжелыми цепями.

"Эффекторные функции" антитела относятся к биологическим активностям, относящимся к Fc-области (Fc-области с нативной последовательностью или Fc-области с вариантом аминокислотной последовательности) антитела. Примеры эффекторных функций антител включают связывание C1q; комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание рецептора Fc; зависимую от антител опосредованную клетками цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточного рецептора, BCR) и т.д.

Термин "Fc-область" в настоящем описании используют для определения C-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, включая Fc-области с нативной последовательностью или варианты Fc-области. Хотя границы Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьировать, Fc-область тяжелой цепи IgG человека обычно определяют в промежутке от аминокислотного остатка примерно в положении Cys226 или примерно от положения Pro230 до карбоксильного конца Fc-области. C-концевой лизин (остаток 447 согласно системе нумерации EU) Fc-области может быть удален, например, во время получения или очистки антитела или при рекомбинантном конструировании нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела. Соответственно, композиция интактных антител может содержать популяции антител с удалением всех остатков K447, популяции антител без удаленных остатков K447 и популяции антител, состоящие из смеси антител, содержащих и не содержащих остатка K447.

Если в настоящем описании не оговорено особо, то нумерация остатков d тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой нумерацию согласно указател