Полиспецифические антитела

Полиспецифические антитела

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к полиспецифическим антителам и способам получения и применения таких антител.

Предпосылки создания изобретения

Антитела представляют собой специфические иммуноглобулиновые полипептиды, продуцируемые иммунной системой позвоночных в ответ на заражение чужими белками, гликопротеинами, клетками или другими антигенными "чужими" веществами. Важной частью этого процесса является выработка антител, которые специфически связываются с конкретным "чужим" веществом. Специфичность связывания таких полипептидов с конкретным антигеном является очень тонкой (утонченной), и совокупность (множество) специфичностей, способных вырабатываться отдельным позвоночным, является удивительным по своей сложности и вариабельности. Тысячи антигенов способны выявлять ответы (реакции), каждый из которых почти исключительно направлен на конкретный антиген, который выявил этот ответ (реакцию).

Специфическое распознавание антигена является необходимым для функционирования антител при адаптивном иммунном ответе. Комбинаторная ассоциация тяжелой цепи (НС) и легкой цепи (LC) при выработке спектра антител сохраняется у всех позвоночных. Однако в обеих цепях наблюдается асимметрия и разнообразие (вариабельность). Вариабельный домен НС (V_H) содержит значительно большее разнообразие последовательностей и вводит детерминанты распознавания антигена чаще, чем вариабельный домен LC (V_L). На роль LC в определении специфичности к антигену указывает процесс, называемый "редактированием" рецептора. Постоянная рекомбинация V_L генов с целью редактирования В-клеточного рецептора является основным механизмом корректировки предшественников аутореактивных антител, которые, по-видимому, составляют значительную часть начального спектра (~75%). Показано, что изменение легкой цепи гасит (аннулирует) нежелательную специфичность связывания или полиспецифичность.

Специфичность антител и фрагментов антител к конкретному антигену или к конкретным антигенам делает антитела подходящими (хорошими) терапевтическими агентами. Антитела и фрагменты антител можно использовать для нацеливания на конкретные ткани, например на опухоль, и тем самым свести к минимуму потенциальные побочные эффекты неспецифического нацеливания. По этой причине существует постоянная необходимость в идентификации и определении характеристик терапевтических антител, в особенности антител, их фрагментов и производных, применимых для лечения рака и других пролиферативных расстройств.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение охватывает выделенное антитело, включающее последовательность гипервариабельной области (HVR) L1, содержащую последовательность NIAKTISGY (SEQ ID NO:1), причем антитело специфически связывает рецептор эпидермального фактора роста 2-го типа (HER2) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). В одном варианте изобретения антитело дополнительно включает HVR-L2, содержащую последовательность WGSFLY (SEQ ID 2 NO:), и/или HVR-L3, содержащую последовательность HYSSPP (SEQ ID NO:3). В другом варианте изобретения антитело дополнительно включает одну, две или три HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей последовательность NIKDTY (SEQ ID NO:4); (ii) HVR-H2, содержащей последовательность RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); и (iii) HVR-Н3, содержащей последовательность WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6). В другом варианте изобретения антитело дополнительно включает одну, две или три HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей последовательность NISGTY (SEQ ID NO:7); (ii) HVR-H2, содержащей последовательность RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); и (iii) HVR-Н3, содержащей последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9).

В другом аспекте изобретение охватывает выделенное антитело, включающее последовательность HVR-L1, содержащую последовательность X₁IX₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉Y (SEQ ID NO:83), где X₁ обозначает любую аминокислоту, за исключением аспарагиновой кислоты, Х₃ обозначает любую аминокислоту, за исключением пролина, Х₄ обозначает любую аминокислоту, за исключением аргинина, и Х₅ обозначает любую аминокислоту, за исключением серина, причем антитело специфически связывает HER2 и VEGF. В одном варианте изобретения антитело, содержащее последовательность X₁IX₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉Y (SEQ ID NO:83), имеет аспарагин в X₁, аланин в Х₃, лизин в Х₄, треонин в Х₅, серин в X₇ и/или глицин в Х₈, или любую их комбинацию. В различных комбинациях этого аспекта изобретения любой из остатков HVR-L1, имеющий, как показано на Фигуре 57, значение F больше чем 1, 5 или 10, представляет собой остаток, который, предпочтительно, сохраняется в виде такого же остатка, находящегося в том же самом положении HVR-L1 в bH1-44 или bH1-81 (SEQ ID NO:1). В других вариантах изобретения любой из остатков HVR-L1, имеющий, как показано в Таблице 14, величину ΔΔG более 1, представляет собой остаток, который, предпочтительно, сохраняется в виде такого же остатка, находящегося в том же самом положении HVR-L1 в bH1-44 или bH1-81 (SEQ ID NO:1). В одном варианте изобретения антитело включает последовательность HVR-H2, содержащую последовательность RX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉R (SEQ ID NO:84). В одном варианте изобретения антитело дополнительно включает последовательность HVR-L2, содержащую последовательность WGSFLY (SEQ ID NO:2), и/или HVR-L3, содержащую последовательность HYSSPP (SEQ ID NO:3). В другом варианте изобретения антитело дополнительно включает одну, две или три HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей последовательность NIKDTY (SEQ ID NO:4); (ii) HVR-H2, содержащей последовательность RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); и (iii) HVR-Н3, содержащей последовательность WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6). В другом варианте изобретения антитело дополнительно включает одну, две или три HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей последовательность NISGTY (SEQ ID NO:7); (ii) HVR-H2, содержащей последовательность RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); и (iii) HVR-Н3, содержащей последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9).

В другом аспекте изобретение охватывает выделенное антитело, включающее последовательность HVR-H2, содержащую последовательность RX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉R (SEQ ID NO:85), где Х₅ обозначает любую аминокислоту, за исключением треонина, а Х₆ обозначает любую аминокислоту, за исключением аспарагина, и при этом антитело специфически связывает HER2 и VEGF. В другом варианте изобретения антитело, содержащее последовательность RX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉R (SEQ ID NO:84), имеет тирозин в X₈. В одном варианте изобретения антитело, содержащее последовательность RX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉R (SEQ ID NO:84), имеет серин в X₅ и/или глутаминовую кислоту в Х₆. В другом варианте данного аспекта антитела дополнительно содержат одну, две или три HVR последовательности, выбранные из группы HVR-L1, содержащей последовательность NIAKTISGY (SEQ ID NO:1), HVR-L2, содержащей последовательность WGSFLY (SEQ ID NO:2), и/или HVR-L3, содержащей последовательность HYSSPP (SEQ ID NO:3). В любом из вариантов по данному описанию антитела дополнительно содержат одну или две HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей последовательность NIKDTY (SEQ ID NO:4), и (ii) HVR-H3, содержащей последовательность WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6). В другом варианте изобретения антитела дополнительно содержат одну или две HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей последовательность NISGTY (SEQ ID NO:7), и (ii) HVR-H3, содержащей последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9).

В различных вариантах этого аспекта изобретения любые из остатков HVR-H2, имеющие, как показано на Фигуре 57, значение F больше чем 1, 5 или 10, представляют собой остатки, которые, предпочтительно, сохраняются в виде такого же остатка, находящегося в том же самом положении HVR-H2 в bH1-44 или bH1-81 (SEQ ID NO:8 и 5, соответственно). В других вариантах изобретения любой из остатков HVR-H2, имеющий, как показано в Таблице 14, величину ΔΔG более 1, представляет собой остаток, который, предпочтительно, сохраняется в виде такого же остатка, находящегося в том же самом положении HVR-H2 в bH1-44 или bH1-81 (SEQ ID NO:8 и 5, соответственно).

В конкретных вариантах изобретения антитело включает HVR-L1 последовательность, содержащую NIAKTISGY (SEQ ID NO:1); HVR-L2 последовательность, содержащую WGSFLY (SEQ ID NO:2); HVR-L3 последовательность, содержащую HYSSPP (SEQ ID NO:3); HVR-H1 последовательность, содержащую NIKDTY (SEQ ID NO:4); HVR-H2 последовательность, содержащую RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); и HVR-H3 последовательность, содержащую WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6), или включает HVR-L1 последовательность, содержащую NIAKTISGY (SEQ ID NO:1); HVR-L2 последовательность, содержащую WGSFLY (SEQ ID NO:2); HVR-L3 последовательность, содержащую HYSSPP (SEQ ID NO:3); HVR-H1 последовательность, содержащую NISGTY (SEQ ID NO:7); HVR-H2 последовательность, содержащую RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); и/или HVR-H3 последовательность, содержащую WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9).

В другом конкретном (частном) варианте изобретения выделенное антитело включает области HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, причем каждая из этих областей, по порядку, содержит последовательность NIAKTISGY (SEQ ID NO:1); WGSFLY (SEQ ID NO:2); HYSSPP (SEQ ID NO:3); NIKDTY (SEQ ID NO:4); RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5) и WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6) и специфически связывает HER2 и VEGF. В другом конкретном варианте изобретения антитело включает области HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-Н2 и HVR-H3, причем каждая из этих областей, по порядку, содержит последовательность NIAKTISGY (SEQ ID NO:1); WGSFLY (SEQ ID NO:2); HYSSPP (SEQ ID NO:3); NISGTY (SEQ ID NO:7); RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8) и WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9) и специфически связывает HER2 и VEGF.

В различных вариантах любого из аспектов по данному описанию антитело связывает человеческий и мышиный VEGF с Kd 150 нМ или сильнее, а HER2 с Kd 7 нМ или сильнее. В других вариантах изобретения антитело ингибирует индуцируемую VEGF клеточную пролиферацию и пролиферацию HER2-экспрессирующей клетки по сравнению с контролем. В конкретном варианте изобретения антитело связывает человеческий и мышиный VEGF с Kd 36 нМ или сильнее, а HER2 с Kd 1 нМ или сильнее. В дополнительном варианте изобретения антитело ингибирует связывание VEGF с VEGFR2.

В другом аспекте изобретение включает выделенный фрагмент антитела, который связывает человеческий и мышиный VEGF с Kd 58 нМ или сильнее, а HER2 с Kd 6 нМ или сильнее, и/или ингибирует VEGF-индуцируемую клеточную пролиферацию и пролиферацию HER2-экспрессирующей клетки по сравнению с контролем. В конкретном варианте изобретения фрагмент антитела связывает человеческий и мышиный VEGF с Kd 33 нМ или сильнее, а HER2 с Kd 0,7 нМ или сильнее. В другом конкретном варианте изобретения фрагмент представляет собой Fab фрагмент или одноцепочечный вариабельный фрагмент антитела (scFv).

В любом из вышеописанных аспектов антитело может представлять собой моноклональное антитело. В другом варианте всех вышеуказанных аспектов изобретения антитело может представлять собой IgG антитело. В дополнительных вариантах всех вышеуказанных аспектов изобретения по меньшей мере один участок каркасной последовательности антитела может представлять собой человеческую консенсусную каркасную последовательность.

В другом аспекте изобретение включает в качестве фрагмента антитела фрагмент любого из антител по данному описанию. Один вариант фрагмента антитела представляет собой фрагмент, включающий последовательность HVR-L1, содержащую последовательность NIAKTISGY (SEQ ID NO:1), которая специфически связывает HER2 и VEGF. В другом варианте изобретения фрагмент антитела дополнительно включает одну или две HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-L2, содержащей последовательность WGSFLY (SEQ ID NO:2); и (ii) HVR-L3, содержащей последовательность HYSSPP (SEQ ID NO:3). В другом варианте изобретения фрагмент антитела дополнительно включает одну, две или три HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей последовательность NIKDTY (SEQ ID NO:4); (ii) HVR-H2, содержащей последовательность RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); и (iii) HVR-НЗ, содержащей последовательность WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6). В другом варианте изобретения фрагмент антитела дополнительно включает одну, две или три HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей последовательность NISGTY (SEQ ID NO:7); (ii) HVR-H2, содержащей последовательность RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); и (iii) HVR-Н3, содержащей последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9). В конкретных вариантах изобретения фрагмент антитела включает последовательность HVR-L1, содержащую NIAKTISGY (SEQ ID NO:1); последовательность HVR-L2, содержащую WGSFLY (SEQ ID NO:2); и последовательность HVR-L3, содержащую HYSSPP (SEQ ID NO:3); последовательность HVR-H1, содержащую NIKDTY (SEQ ID NO:4); последовательность HVR-H2, содержащую RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); и последовательность HVR-Н3, содержащую WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6), или включает последовательность HVR-L1, содержащую NIAKTISGY (SEQ ID NO:1); последовательность HVR-L2, содержащую WGSFLY (SEQ ID NO:2); последовательность HVR-L3, содержащую HYSSPP (SEQ ID NO:3); последовательность HVR-H1, содержащую NISGTY (SEQ ID NO:7); последовательность HVR-H2, содержащую RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); и последовательность HVR-Н3, содержащую WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9). В одном варианте изобретения фрагмент представляет собой Fab фрагмент или одноцепочечный вариабельный фрагмент антитела (scFv). В дополнительных вариантах всех вышеуказанных аспектов изобретения по меньшей мере один участок каркасной последовательности антитела может представлять собой человеческую консенсусную каркасную последовательность.

В других аспектах изобретение включает полинуклеотиды, кодирующие любое антитело или любой фрагмент антитела по данному описанию, а также вектор, содержащий такой полинуклеотид. В конкретных вариантах изобретения кодированное антитело включает HVR-L1 последовательность, содержащую NIAKTISGY (SEQ ID NO:1). Необязательно, или помимо этого, полинуклеотид кодирует антитело, которое также включает последовательность HVR-L2, содержащую WGSFLY (SEQ ID NO:2); и/или последовательность HVR-L3 содержащую HYSSPP (SEQ ID NO:3), или любую их комбинацию. В другом аспекте полинуклеотид может дополнительно кодировать антитело, включающее одну, две или три последовательности из HVR-H1 последовательности, содержащей NIKDTY (SEQ ID NO:4); последовательности HVR-H2, содержащей RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); и последовательности HVR-Н3, содержащей WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6); или антитело, включающее одну, две или три последовательности из HVR-H1, содержащей NISGTY (SEQ ID NO:7); HVR-H2, содержащей RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); и/или последовательности HVR-Н3, содержащей WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9).

В дополнительных аспектах изобретения полинуклеотид кодирует последовательность HVR-H1, содержащую NISGTY (SEQ ID NO:7), HVR-H2, содержащую последовательность RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8) или HVR-Н3, содержащую последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9), или любую их комбинацию.

В других аспектах изобретение включает выделенный полинуклеотид, кодирующий последовательность HVR-L1, содержащую последовательность NIAKTISGY (SEQ ID NO:1), и, необязательно, помимо этого, полинуклеотид кодирует одну, две или три HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей последовательность NIKDTY (SEQ ID NO:4); (ii) HVR-H2, содержащей последовательность RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); и (iii) HVR-Н3, содержащей последовательность WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6). В дополнительных аспектах изобретение включает выделенный полинуклеотид, кодирующий последовательность HVR-L1, содержащую последовательность NIAKTISGY (SEQ ID NO:1); и (i) последовательность HVR-L2, содержащую последовательность WGSFLY (SEQ ID NO:2) или (ii) последовательность HVR-L3, содержащую последовательность HYSSPP (SEQ ID NO:3), или обе, или, необязательно, полинуклеотид дополнительно кодирует одну, две или три HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей последовательность NIKDTY (SEQ ID NO:4); (ii) HVR-H2, содержащей последовательность RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); и (iii) HVR-Н3, содержащей последовательность WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6).

В другом аспекте изобретение включает выделенный полинуклеотид, кодирующий последовательность HVR-L1, содержащую последовательность NIAKTISGY (SEQ ID NO:1); HVR-H1, содержащую последовательность NISGTY (SEQ ID NO:7); HVR-H2, содержащую последовательность RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); и HVR-Н3, содержащую последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9). Еще в одном аспекте изобретение включает выделенный полинуклеотид, кодирующий последовательность HVR-L1, содержащую последовательность NIAKTISGY (SEQ ID NO:1); последовательность HVR-L2, содержащую последовательность WGSFLY (SEQ ID NO:2); последовательность HVR-L3, содержащую последовательность HYSSPP (SEQ ID NO:3); HVR-H1, содержащую последовательность NISGTY (SEQ ID NO:7); HVR-H2, содержащую последовательность RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); и HVR-Н3, содержащую последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9).

В других аспектах изобретение включает выделенный полинуклеотид, кодирующий последовательность HVR-H1, содержащую последовательность NISGTY (SEQ ID NO:7), выделенный полинуклеотид, кодирующий последовательность HVR-Н2, содержащую последовательность RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8), и выделенный полинуклеотид, кодирующий последовательность HVR-Н3, содержащую последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9). В другом аспекте изобретение включает выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, включающий последовательность HVR-H1, содержащую последовательность NISGTY (SEQ ID NO:7); последовательность HVR-H2, содержащую последовательность RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); и последовательность HVR-Н3, содержащую последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9).

В дополнительном варианте изобретения выделенный полинуклеотид кодирует последовательность HVR-L1, содержащую последовательность X₁IX₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉Y (SEQ ID NO:83), где X₁ обозначает любую аминокислоту, аспарагиновой кислоты, Х₃ обозначает любую аминокислоту, за исключением пролина, Х₄ обозначает любую аминокислоту, за исключением аргинина, и Х₅ обозначает любую аминокислоту, за исключением серина. В другом варианте изобретения полинуклеотид кодирует последовательность HVR-L1, содержащую последовательность X₁IX₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉Y (SEQ ID NO:83), где X₁ обозначает любую аминокислоту, за исключением Asp, Х₃ обозначает любую аминокислоту, за исключением пролина, Х₄ обозначает любую аминокислоту, за исключением аргинина, и Х₅ обозначает любую аминокислоту, за исключением серина; и последовательность HVR-L2, содержащую последовательность WGSFLY (SEQ ID NO:2), и/или последовательность HVR-L3, содержащую последовательность HYSSPP (SEQ ID NO:3). В дополнительных вариантах данного аспекта изобретения полинуклеотид кодирует антитело, содержащее последовательность X₁IX₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉Y (SEQ ID NO:83), которая имеет аспарагин в X₁, аланин в Х₃, лизин в Х₄, треонин в X₅, серин в Х₇ и/или глицин в X₈, или любую их комбинацию. В различных вариантах этого аспекта изобретения любой из остатков HVR-L1, имеющий, как показано на Фигуре 57, значение F больше чем 1, 5 или 10, представляет собой остаток, который, предпочтительно, сохраняется в виде такого же остатка, находящегося в том же самом положении HVR-L1 в bH1-44 или bH1-81 (SEQ ID NO:1). В других вариантах изобретения любой из остатков HVR-L1, имеющий, как показано в Таблице 14, величину ΔΔG более 1, представляет собой остаток, который, предпочтительно, сохраняется в виде такого же остатка, находящегося в том же самом положении HVR-L1 в bH1-44 или bH1-81 (SEQ ID NO:1).

В дополнительном варианте изобретения выделенный полинуклеотид кодирует последовательность HVR-H2, содержащую последовательность RX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉R (SEQ ID NO:85), где Х₅ обозначает любую аминокислоту, за исключением треонина, а Х₆ обозначает любую аминокислоту, за исключением аспарагина. В другом аспекте изобретение включает полинуклеотид, кодирующий последовательность HVR-H1, содержащую последовательность NISGTY (SEQ ID NO:7); последовательность HVR-Н2, содержащую последовательность RX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉R (SEQ ID NO:85), в которой Х₅ обозначает любую аминокислоту, за исключением треонина, а Х₆ обозначает любую аминокислоту, за исключением аспарагина; и последовательность HVR-Н3, содержащую последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9). В дополнительных вариантах изобретения полинуклеотид кодирует последовательность HVR-H2, содержащую последовательность RX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉R (SEQ ID NO:84), которая имеет серин в Х₅, глутаминовую кислоту в Х₆ и/или тирозин в Х₈, или любую их комбинацию. В различных вариантах этого аспекта изобретения любые из остатков HVR-H2, имеющие, как показано на Фигуре 57, значение F больше чем 1, 5 или 10, представляют собой остатки, которые, предпочтительно, сохраняются в виде такого же остатка, находящегося в том же самом положении HVR-H2 в bH1-44 или bH1-81 (SEQ ID NO:8 и 5, соответственно). В других вариантах изобретения любой из остатков HVR-H2, имеющий, как показано в Таблице 14, величину ΔΔG более 1, представляет собой остаток, который, предпочтительно, сохраняется в виде такого же остатка, находящегося в том же самом положении HVR-H2 в bH1-44 или bH1-81 (SEQ ID NO:8 и 5, соответственно).

В других аспектах изобретение охватывает выделенный полипептид, включающий последовательность HVR-L1, содержащую последовательность NIAKTISGY (SEQ ID NO:1), или выделенный полипептид, включающий последовательность HVR-L1, содержащую последовательность NIAKTISGY (SEQ ID NO:1); последовательность HVR-L2, содержащую последовательность WGSFLY (SEQ ID NO:2); и/или последовательность HVR-L3, содержащую последовательность HYSSPP (SEQ ID NO:3). В другом аспекте изобретение охватывает полипептид, включающий последовательность HVR-L1, содержащую последовательность X₁IX₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉Y (SEQ ID NO:83), в которой X₁ обозначает любую аминокислоту, за исключением аспарагиновой кислоты, Х₃ обозначает любую аминокислоту, за исключением пролина, Х₄ обозначает любую аминокислоту, за исключением аргинина, и Х₅ обозначает любую аминокислоту, за исключением серина. В другом варианте данного аспекта изобретения полипептид содержит HVR-L1 последовательность X₁IX₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉Y (SEQ ID NO:83), где X₁ обозначает любую аминокислоту, за исключением аспарагиновой кислоты, Х₃ обозначает любую аминокислоту, за исключением пролина, Х₄ обозначает любую аминокислоту, за исключением аргинина, и X₅ обозначает любую аминокислоту, за исключением серина. Необязательно, помимо этого полипептид включает последовательность HVR-L2, содержащую последовательность WGSFLY (SEQ ID NO:2), и/или последовательность HVR-L3, содержащую последовательность HYSSPP (SEQ ID NO:3). В конкретных вариантах любого из вышеуказанных аспектов изобретения, которые включают полипептид, который содержит последовательность X₁IX₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉Y (SEQ ID NO:83), в X₁ находится аспарагин, в Х₃ находится аланин, в Х₄ находится лизин, в Х₅ находится треонин, в Х₇ находится серин и/или в X₈ находится глицин или любая их комбинация. В различных вариантах этого аспекта изобретения любой из остатков HVR-L1, имеющий, как показано на Фигуре 57, значение F больше чем 1, 5 или 10, представляет собой остаток, который, предпочтительно, сохраняется в виде такого же остатка, находящегося в том же самом положении HVR-L1 в bH1-44 или bH1-81 (SEQ ID NO:1). В других вариантах изобретения любой из остатков HVR-L1, имеющий, как показано в Таблице 14, величину ΔΔG более 1, представляет собой остаток, который, предпочтительно, сохраняется в виде такого же остатка, находящегося в том же самом положении HVR-L1 в bH1-44 или bH1-81 (SEQ ID NO:1).

Изобретение также охватывает полипептид, включающий последовательность HVR-H2, содержащую последовательность RX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉R (SEQ ID NO:85), где X₅ обозначает любую аминокислоту, за исключением треонина, а Х₆ обозначает любую аминокислоту, за исключением аспарагина. В другом аспекте изобретения полипептид включает последовательность HVR-H2 RX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉R (SEQ ID NO:85), где Х₅ обозначает любую аминокислоту, за исключением треонина, а Х₆ обозначает любую аминокислоту, за исключением аспарагина, последовательность HVR-H1, содержащую последовательность NISGTY (SEQ ID NO:7), и последовательность HVR-H3, содержащую последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9). В различных вариантах вышеуказанных аспектов полипептид, включающий последовательность HVR-H2, содержащую последовательность RX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉R (SEQ ID NO:84), имеет серин в Х₅, глутаминовую кислоту в Х₆ и/или тирозин в положении X₈, или любую их комбинацию. В различных вариантах данного аспекта изобретения любые из остатков HVR-H2, имеющие, как показано на Фигуре 57, значение F больше чем 1, 5 или 10, представляют собой остатки, которые, предпочтительно, сохраняются в виде такого же остатка, находящегося в том же самом положении HVR-H2 в bH1-44 или bH1-81 (SEQ ID NO:8 и 5, соответственно). В других вариантах изобретения любой из остатков HVR-H2, имеющий, как показано в Таблице 14, величину ΔΔG более 1, представляет собой остаток, который, предпочтительно, сохраняется в виде такого же остатка, находящегося в том же самом положении HVR-H2 в bH1-44 или bH1-81 (SEQ ID NO:8 и 5, соответственно).

Изобретение охватывает также полипептид, содержащий одну, две или три HVR последовательности из последовательности HVR-H1, содержащей последовательность NISGTY (SEQ ID NO:7), последовательности HVR-H2, содержащей последовательность RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8), и/или последовательности HVR-Н3, содержащей последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9), или любую их комбинацию.

В любом из вышеуказанных аспектов выделенный полипептид может дополнительно содержать одну, две или три HVR последовательности из последовательности HVR-L1, содержащей последовательность NIAKTISGY (SEQ ID NO:1); HVR-H1, содержащей последовательность NIKDTY (SEQ ID NO:4); HVR-H2, содержащей последовательность RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); и/или HVR-H3, содержащей последовательность WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6), или любую их комбинацию.

В любом из вышеуказанных аспектов выделенный полипептид может дополнительно содержать одну, две или три HVR последовательности из последовательности HVR-L1, содержащей последовательность NIAKTISGY (SEQ ID NO:1); последовательности HVR-L2, содержащей последовательность WGSFLY (SEQ ID NO:2); и/или последовательности HVR-L3, содержащей последовательность HYSSPP (SEQ ID NO:3), или любую их комбинацию.

В любом из вышеуказанных аспектов выделенный полипептид может дополнительно содержать HVR-H1, содержащую последовательность NIKDTY (SEQ ID NO:4); HVR-H2, содержащую последовательность RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); и/или HVR-Н3, содержащую последовательность WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6), или любую их комбинацию.

В любом из вышеуказанных аспектов выделенный полипептид может дополнительно содержать одну, две или три HVR последовательности, выбранных из HVR-H1, содержащей последовательность NISGTY (SEQ ID NO:7); и последовательности HVR-H2, содержащей последовательность RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); и/или HVR-Н3, содержащей последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9), или любую их комбинацию.

В дополнительных аспектах изобретение охватывает выделенный полипептид, включающий последовательность HVR-L1, содержащую последовательность NIAKTISGY (SEQ ID NO:1) и (i) последовательность HVR-L2, содержащую последовательность WGSFLY (SEQ ID NO:2), или (ii) последовательность HVR-L3, содержащую последовательность HYSSPP (SEQ ID NO:3), или и ту, и другую последовательность; и одну, две из трех HVR последовательностей, выбранных из (i) HVR-H1, содержащей последовательность NISGTY (SEQ ID NO:7); (ii) HVR-H2, содержащей последовательность RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); и/или (iii) HVR-Н3, содержащей последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9), или любую их комбинацию.

В дополнительных аспектах изобретение охватывает выделенный полипептид, включающий последовательность HVR-L1, содержащую последовательность NIAKTISGY (SEQ ID NO:1) и (i) последовательность HVR-L2, содержащую последовательность WGSFLY (SEQ ID NO:2), или (ii) последовательность HVR-L3, содержащую последовательность HYSSPP (SEQ ID NO:3), или и ту, и другую последовательность; и одну, две из трех HVR последовательностей, выбранных из (i) HVR-H1, содержащей последовательность NIKDTY (SEQ ID NO:4); (ii) HVR-H2, содержащей последовательность RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); и/или (iii) HVR-Н3, содержащей последовательность WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6), или любую их комбинацию.

В других аспектах изобретение включает выделенный полипептид, включающий последовательность HVR-H1, содержащую последовательность NISGTY (SEQ ID NO:7); выделенный полипептид, включающий последовательность HVR-H2, содержащую последовательность RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); и выделенный полипептид, включающий последовательность HVR-H3, содержащую последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9). Еще в одном аспекте изобретение включает выделенный полипептид, включающий последовательность HVR-H1, содержащую последовательность NISGTY (SEQ ID NO:7); последовательность HVR-H2, содержащую последовательность RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); и последовательность HVR-H3, содержащую последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9).

В одном варианте изобретение включает вектор, содержащий любой из вышеописанных полинуклеотидов по изобретению. В другом аспекте изобретение включает клетку-хозяина, содержащую любой из векторов по изобретению. В одном варианте изобретения клетка-хозяин является прокариотической клеткой. В другом варианте изобретения клетка-хозяин является эукариотической клеткой, например клеткой млекопитающего.

В другом аспекте изобретение включает способ получения любого из вышеописанных антител или фрагментов антител. Этот способ включает культивирование клетки-хозяина, которая содержит вектор, включающий полинуклеотид, кодирующий антитело, и извлечение антитела. В некоторых вариантах изобретения полинуклеотид кодирует последовательность HVR-L1, содержащую последовательность NIAKTISGY (SEQ ID NO:1), и, необязательно, полинуклеотид дополнительно кодирует HVR-H1, содержащую последовательность NIKDTY (SEQ ID NO:4); HVR-H2, содержащую последовательность RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); и HVR-H3, содержащую последовательность WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6). В других вариантах изобретения полинуклеотид кодирует последовательность HVR-L1, содержащую последовательность NIAKTISGY (SEQ ID NO:1); последовательность HVR-L2, содержащую последовательность WGSFLY (SEQ ID NO:2); и последовательность HVR-L3, содержащую последовательность HYSSPP (SEQ ID NO:3), и, необязательно, полинуклеотид дополнительно HVR-H1, содержащую последовательность NIKDTY (SEQ ID NO:4); HVR-H2, содержащую последовательность RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); и HVR-Н3, содержащую последовательность WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6). В другом варианте изобретения полинуклеотид кодирует последовательность HVR-L1, содержащую последовательность NIAKTISGY (SEQ ID NO:1); HVR-H1, содержащую последовательность NISGTY (SEQ ID NO:7); HVR-H2, содержащую последовательность RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); HVR-Н3, содержащую последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9). Еще в одном варианте изобретения полинуклеотид кодирует последовательность HVR-L1, содержащую последовательность NIAKTISGY (SEQ ID NO:1); последовательность HVR-L2, содержащую последовательность WGSFLY (SEQ ID NO:2); последовательность HVR-L3, содержащую последовательность HYSSPP (SEQ ID NO:3); HVR-H1, содержащую последовательность NISGTY (SEQ ID NO:7); HVR-H2, содержащую последовательность RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); и HVR-Н3, содержащую последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9).

В других вариантах изобретения полинуклеотид кодирует последовательность HVR-L1, содержащую последовательность NISGTY (SEQ ID NO:7), последовательность HVR-H2, содержащую последовательность RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8), или последовательность HVR-Н3, содержащую последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9). Еще в одном варианте изобретения полинуклеотид кодирует полипептид, включающий последовательность HVR-L1, содержащую последовательность NISGTY (SEQ ID NO:7), последовательность HVR-H2, содержащую последовательность RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8), и последовательность HVR-Н3, содержащую последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9).

В одном варианте изобретения клетка-хозяин является прокариотической клеткой, а в другом варианте изобретения клетка-хозяин является эукариотической клеткой, такой как клетка млекопитающего.

В другом аспекте изобретение включает способ лечения опухоли у субъекта. Этот способ включает введение субъекту антитела или фрагмента антитела по данному описанию, причем введение проводят в течение такого времени и в таком количестве, которые достаточны для лечения или предупреждения опухоли у субъекта. В одном варианте изобретения опухоль представляет собой колоректальную опухоль, рак молочной железы, рак легкого, почечноклеточную карциному, глиому, глиобластому или рак яичника. В другом варианте изобретения антитело включает последовательность HVR-L1, содержащую последовательность NIAKTISGY (SEQ ID NO:1), и специфически связывает HER2 и VEGF. В одном варианте изобретения антитело дополнительно включает HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-L2, содержащей последовательность WGSFLY (SEQ ID NO:2), и/или (ii) HVR-L3, содержащей последовательность HYSSPP (SEQ ID NO:3). В другом варианте изобретения антитело включает одну, две или три HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей последовательность NIKDTY (SEQ ID NO:4); (ii) HVR-H2, содержащей последовательность RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); и (iii) HVR-Н3, содержащей последовательность WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6). В дополнительном варианте изобретения антитело включает одну, две или три HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей последовательность NISGTY (SEQ ID NO:7); (ii) HVR-H2, содержащей последовательность RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); и (iii) HVR-Н3, содержащей последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9). В конкретных вариантах изобретения антитело включает последовательность HVR-L1, содержащую NIAKTISGY (SEQ ID NO:1); последовательность HVR-L2, содержащую WGSFLY (SEQ ID NO:2); последовательность HVR-L3, содержащую HYSSPP (SEQ ID NO:3); последовательность HVR-H1, содержащую NIKDTY (SEQ ID NO:4); последовательность HVR-H2, содержащую RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); и последовательность HVR-Н3, содержащую WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6), и специфически связывает HER2 и VEGF. В другом варианте изобретения антитело включает последовательность HVR-L1, содержащую NIAKTISGY (SEQ ID NO:1); последовательность HVR-L2, содержащую WGSFLY (SEQ ID NO:2); последовательность HVR-L3, содержащую HYSSPP (SEQ ID NO:3); последовательность HVR-H1, содержащую NISGTY (SEQ ID NO:7); последовательность HVR-H2, содержащую RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); и последовательность HVR-Н3, содержащую WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9), и специфически связывает HER2 и VEGF.

В одном варианте способ дополнительно включает дополнительную противораковую терапию. В другом варианте изобретения дополнительная противораковая терапия включает введение другого антитела, химиотерапевтического агента, цитотоксического агента, антиангиогенного агента, иммуносупрессора, пролекарства, цитокина, антагониста цитокина, проведение цитотоксической лучевой терапии, введение кортикостероида, противорвотного средства, противораковой вакцины, анальгетика или ингибитора роста.

В другом варианте изобретения дополнительную противораковую терапию проводят до или после введения антитела. В другом варианте изобретения дополнительную противораковую терапию проводят одновременно с введением антитела.

В другом аспекте изобретение включает способ лечения аутоиммунного заболевания у субъекта. Этот способ включает введение субъекту антитела или фрагмента антитела по данному описанию, причем введение проводят в течение такого времени и в таком количестве, которые достаточны для лечения или предупреждения аутоиммунного заболевания у субъекта. В одном варианте изобретения антитело включает последовательность HVR-L1, содержащую последовательность NIAKTISGY (SEQ ID NO:1), и специфически связывает HER2 и VEGF. В одном варианте изобретения антитело включает одну или две HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-L2, содержащей последовательность WGSFLY (SEQ ID NO:2); и (ii) HVR-L3, содержащей последовательность HYSSPP (SEQ ID NO:3). В другом варианте изобретения антитело включает одну, две или три HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей последовательность NIKDTY (SEQ ID NO:4); (ii) HVR-H2, содержащей последовательность RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); и (iii) HVR-Н3, содержащей последовательность WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6). В дополнительном варианте изобретения антитело включает одну, две или три HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей последовательность NISGTY (SEQ ID NO:7); (ii) HVR-H2, содержащей последовательность RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); и (iii) HVR-Н3, содержащей последовательность WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9). В конкретных вариантах изобретения антитело включает последовательность HVR-L1, содержащую NIAKTISGY (SEQ ID NO:1); последовательность HVR-L2, содержащую WGSFLY (SEQ ID NO:2); последовательность HVR-L3, содержащую HYSSPP (SEQ ID NO:3); последовательность HVR-H1, содержащую NIKDTY (SEQ ID NO:4); последовательность HVR-H2, содержащую RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); и последовательность HVR-Н3, содержащую WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6), и специфически связывает HER2 и VEGF; или антитело включает последовательность HVR-L1, содержащую NIAKTISGY (SEQ ID NO:1); последовательность HVR-L2, содержащую WGSFLY (SEQ ID NO:2); последовательность HVR-L3, содержащую HYSSPP (SEQ ID NO:3); последовательность HVR-H1, содержащую NISGTY (SEQ ID NO:7); последовательность HVR-H2, содержащую RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); и последовательность HVR-Н3, содержащую WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9), и специфически связывает HER2 и VEGF.

Еще в одном аспекте изобретение охватывает способ лечения незлокачественного заболевания, включающего патологическую активацию HER2 у субъекта. Этот способ включает введение субъекту антитела или фрагмента антитела по данному описанию, причем введение провод