Двухвалентные биспецифические антитела

Двухвалентные биспецифические антитела

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к новым двухвалентным биспецифическим антителам, их получению и применению.

Предпосылки создания изобретения

В данной области известны сконструированные белки, такие как би- и мультиспецифические антитела, которые могут связываться с двумя или большим количеством антигенов. Указанные мультиспецифические связывающие белки можно создавать на основе методов клеточного слияния, химической конъюгации или рекомбинантной ДНК.

В последние годы создано широкое разнообразие форматов рекомбинантных биспецифических антител, например четырехвалентные биспецифические антитела, полученные путем слияния, например антитела IgG-формата и одноцепочечных доменов (см., например, Coloma M.J. и др., Nature Biotech 15, 1997, cc.159-163; WO 001/077342 и Morrison S.L., Nature Biotech 25, 2007, cc.1233-1234).

Разработано также несколько других новых форматов, в которых уже не сохранялась основная структура антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM), таких как диа-, триа- или тетратела, мини-тела, несколько одноцепочечных форматов (scFv, бис-scFv), которые могут связывать два или большее количество антигенов (Holliger Р. и др., Nature Biotech 23, 2005, cc.1126-1136; Fischer N., Leger О., Pathobiology 74, 2007, cc.3-14; Shen J и др., Journal of Immunological Methods 318, 2007, cc.65-74; Wu С. и др., Nature Biotech 25, 2007, cc.1290-1297).

Во всех указанных форматах используют линкеры либо для слияния основной структуры антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) с дополнительным связывающим белком (например, scFv), либо для слияния, например, двух Fab-фрагментов или scFv (Fischer N., Leger О., Pathobiology 74, 2007, cc.3-14). Хотя очевидно, что линкеры имеют преимущество при создании биспецифических антител, с ними могут быть связаны также проблемы терапевтического плана. Фактически эти чужеродные пептиды могут вызывать иммунный ответ против самого линкера или области стыка между белком и линкером. Кроме того, гибкая природа этих пептидов делает их более чувствительными к протеолитическому расщеплению, что может приводить к плохой стабильности, агрегации и повышению иммуногенности антитела. Кроме того, может существовать необходимость в поддержании эффекторных функций, таких как комплементзависимая цитотоксичность (CDC) или антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC), которые опосредуются Fc-областью, путем сохранения высокой степени сходства с встречающимися в естественных условиях антителами.

Таким образом, в идеальном варианте необходимо создавать биспецифические антитела, которые обладают очень сходной общей структурой с встречающимися в естественных условиях антителами (типа IgA, IgD, IgE, IgG или IgM), с минимальным отклонением от человеческих последовательностей.

В соответствии с одним из подходов биспецифические антитела с высокой степенью сходства с встречающимися в естественных условиях антителами создавали с помощью технологии квадром (квадрогибридом) (см. Milstein С. и А.С.Cuello, Nature, 305, 1983, cc.537-540) на основе соматического слияния двух различных клеточных линий гибридом, экспрессирующих мышиные моноклональные антитела с требуемыми специфичностями биспецифического антитела. В результате случайного спаривания тяжелых и легких цепей двух различных антител в образующейся линии клеток гибрида гибридомы (или квадромы) получают вплоть до 10 различных видов антител, из которых только одно представляет собой требуемое функциональное биспецифическое антитело. Из-за присутствия ошибочно спаренных побочных продуктов и в значительной степени сниженного выхода продукта, требуются более сложные процедуры очистки (см., например, Morrison S.L., Nature Biotech 25, 2007, cc.1233-1234). В целом, эта же проблема, связанная с ошибочно спаренными побочными продуктами, сохраняется при применении методов рекомбинантной экспрессии.

Подход, с помощью которого можно обойти проблему, связанную с имеющими ошибочные спаривания побочными продуктами, известный под названием «knobs-into-holes» (взаимодействие по типу «выступ-впадина»), направлен на усиление спаривания двух различных тяжелых цепей антитела путем интродукции мутаций в СН3-домены для модификации поверхности раздела в области контакта. На одной цепи имеющие большие размеры аминокислоты заменяли на аминокислоты с короткими боковыми цепями для создания «впадины». И, наоборот, аминокислоты с более крупными боковыми цепями интродуцировали в другой CH3-домен, создавая «выступ». Путем совместной экспрессии этих двух тяжелых цепей (и двух идентичных легких цепей, которые должны соответствовать обеим тяжелым цепям), получали высокий выход гетеродимерной формации («выступ-впадина») относительно гомодимерной формации («впадина-впадина» или «выступ-выступ») (Ridgway J.В., Presta L.G., Carter Р. и WO 1996/027011). Процентное содержание гетеродимера можно дополнительно повышать путем ремоделирования поверхностей раздела двух СН3-доменов с помощью технологии фагового дисплея и интродукции дисульфидного мостика для стабилизации гетеродимеров (Merchant А.М. и др., Nature Biotech 16, 1998, cc.677-681; Atwell S., Ridgway J.B., Wells J.A., Carter P., J Mol Biol 270, 1997, cc.26-35). Новые подходы к технологии «knobs-into-holes» описаны, например, в ЕР 1870459 А1. Хотя указанный формат, вероятно, является очень привлекательным, в настоящее время отсутствуют данные о его развитии в направлении клинического применения. Одним из важных ограничений этой стратегии является то, что легкие цепи двух родительских антител должны быть идентичными для предупреждения ошибочных спариваний и формирования неактивных молекул. Таким образом, эта технология не пригодна для более легкого создания рекомбинантных двухвалентных биспецифических антител к двум антигенам с использованием в качестве исходных двух антител к первому и второму антигену, поскольку должны быть оптимизированы или тяжелые цепи этих антител, и/или идентичные легкие цепи.

В WO 2006/093794 описаны композиции гетеродимерных связывающих белков. В WO 99/37791 описаны многоцелевые производные антител. У Morrison и др., J. Immunolog, 160, 1998, cc.2802-2808 описано влияние замены вариабельных областей на функциональные свойства IgG.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к двухвалентному биспецифическому антителу, содержащему:

а) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося с первым антигеном; и

б) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном, в котором вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга

и

в котором CL- и CH1-домены константных областей (константные домены CL и СН1) заменены друг на друга.

Следующим вариантом осуществления изобретения является способ получения двухвалентного биспецифического антитела, предлагаемого в изобретении, заключающийся в том, что

а) трансформируют клетку-хозяина

- векторами, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь антитела, которое специфически связывается с первым антигеном,

- векторами, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном, в котором вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга

и

в котором константные домены CL и СН1 заменены друг на друга;

б) культивируют клетку-хозяина в условиях, которые позволяют синтезировать указанную молекулу антитела; и

в) выделяют молекулу антитела из культуры.

Следующим вариантом осуществления изобретения является клетка-хозяин, содержащая

- векторы, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь антитела, которое специфически связывается с первым антигеном,

- векторы, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном, в котором вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга

и

в котором константные домены CL и СН1 заменены друг на друга.

Следующим вариантом осуществления изобретения является композиция, предпочтительно фармацевтическая или диагностическая композиция антитела, предлагаемого в изобретении.

Следующим вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержит антитело, предлагаемое в изобретении, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.

Следующим вариантом осуществления изобретения является способ лечения пациента, который нуждается в терапии, отличающийся тем, что вводят пациенту в терапевтически эффективном количестве антитело, предлагаемое в изобретении.

Подробное описание изобретения

Изобретение относится к двухвалентному биспецифическому антителу, содержащему:

а) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося с первым антигеном; и

б) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном, в котором вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга

и

в котором константные домены CL и СН1 заменены друг на друга.

Таким образом, двухвалентное биспецифическое антитело содержит:

а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося с первым антигеном; и

б) вторую легкую цепь и вторую тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном,

в котором вариабельные домены VL и VH второй легкой цепи и второй тяжелой цепи заменены друг на друга

и

в котором константные домены CL и СН1 второй легкой цепи и второй тяжелой цепи заменены друг на друга.

Таким образом, для создания антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном, применяют следующие процессы:

в легкой цепи

вариабельный домен VL легкой цепи заменяют на вариабельный домен VH тяжелой цепи указанного антитела и константный домен CL легкой цепи заменяют на константный домен СН1 тяжелой цепи указанного антитела;

и в тяжелой цепи

вариабельный домен VH тяжелой цепи заменяют на вариабельный домен VL легкой цепи указанного антитела и константный домен СН1 тяжелой цепи заменяют на константный домен CL легкой цепи указанного антитела.

Понятие «антитело» к контексте настоящего описания относится к полным моноклональным антителам. Такие полные антитела состоят из двух пар, каждая из которых включает «легкую цепь» (LC) и «тяжелую цепь» (НС) (указанные пары легкая цепь (LC)/тяжелая цепь сокращенно обозначают в контексте настоящего описания как LC/HC). Легкие цепи и тяжелые цепи указанных антител представляют собой полипептиды, состоящие из нескольких доменов (областей). В полном антителе каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно обозначена в контексте настоящего описания как HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит константные СН1-, СН2- и СН3-домены тяжелой цепи (в антителе, которое относится к классам IgA, IgD и IgG) и необязательно константный СН4-домен тяжелой цепи (в антителе, которое относится к классам IgE и IgM). Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен легкой цепи VL и константный домен легкой цепи CL. Структура одного из классов встречающихся в естественных условиях антител, а именно антитела класса IgG, показана, например, на фиг.1. Вариабельные домены VH и VL можно дополнительно подразделять на области гипервариабельности, обозначенные как гипервариабельные участки (CDR), перемежающиеся более консервативными областями, которые называют каркасными участками (FR). Каждая VH- и VL-область состоит из трех CDR и четырех FR, которые расположены в направлении от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (Janeway С.A., Jr. и др., Immunobiology., 5-е изд., изд-во Garland Publishing, 2001; и Woof J., Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc.89-99). Две пары, каждая из которых включает тяжелую цепь и легкую цепь (HC/LC), обладают способностью специфически связываться с одним и тем же антигеном. Таким образом, полное антитело представляет собой двухвалентное моноспецифическое антитело. Указанные «антитела» представляют собой, например, мышиные антитела, человеческие антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела и созданные с помощью генной инженерии антитела (варианты антител или мутантные антитела), если они сохраняют свои характерные свойства. Наиболее предпочтительными являются человеческие или гуманизированные антитела, прежде всего в виде рекомбинантных человеческих или гуманизированных антител.

Известно пять типов тяжелых цепей антител млекопитающих, которые обозначают греческими буквами: α, δ, ε, γ и µ (Janeway С.А., Jr. и др., Immunobiology., 5-е изд., изд-во Garland Publishing, 2001). Присутствующий тип тяжелой цепи определяет класс антитела; указанные цепи обнаружены в антителах типа IgA, IgD, IgE, IgG и IgM соответственно (Rhoades R.A., Pflanzer R.G., Human Physiology, 4-е изд., изд-во Thomson Learning, 2002). Различные тяжелые цепи отличаются по размеру и составу; α и γ содержат примерно 450 аминокислот, а µ и ε состоят примерно из 550 аминокислот.

Каждая тяжелая цепь содержит две области, т.е. константную область и вариабельную область. Константная область является идентичной во всех антителах одного и того же изотипа, но отличается в антителах различного изотипа. Тяжелые цепи γ, α и δ содержат константную область, которая состоит из трех константных доменов СН1, СН2 и СН3 (выстроены в ряд), и шарнирную область, которая придает гибкость (Woof J., Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc.89-99); тяжелые цепи µ и ε содержат константную область, которая состоит из четырех константных доменов СН1, СН2, СН3 и СН4 (Janeway С.A., Jr. и др., Immunobiology., 5-е изд., изд-во Garland Publishing, 2001). Вариабельная область тяжелой цепи отличается у антител, которые продуцируются различными В-клетками, но является одинаковой у всех антител, продуцируемых индивидуальной В-клеткой или B-клеточным клоном. Вариабельная область каждой тяжелой цепи антитела содержит примерно 110 аминокислот и состоит из одного домена.

У млекопитающих известно только два типа легких цепей, которые обозначают как лямбда (λ) и каппа (κ). Легкая цепь состоит из двух последовательно расположенных доменов: один константный домен CL и один вариабельный домен VL. Примерная длина легкой цепи составляет 211-217 аминокислот. Предпочтительно легкая цепь представляет собой легкую каппа (κ)-цепь, а константный домен CL предпочтительно представляет собой C-каппа (κ).

Понятия «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» в контексте настоящего описания относятся к препарату молекул антител одинакового аминокислотного состава.

«Антитела» согласно изобретению могут представлять собой антитела любого класса (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, предпочтительно IgG или IgE) или подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2, предпочтительно IgG1), при этом оба антитела, из которых выводят двухвалентное биспецифическое антитело, предлагаемое в изобретение, имеют Fc-область одного и того же подкласса (например, IgG1, IgG4 и т.п., предпочтительно IgG1), предпочтительно одного и того же аллотипа (например, кавказского).

Понятие «Fc-область (фрагмент) антитела» хорошо известно специалистам в данной области и ее определяют на основе расщепления антител папаином. Антитела, предлагаемые в изобретении, содержат в качестве Fc-области предпочтительно Fc-область, полученную из человеческого антитела, и предпочтительно все другие части человеческих константных областей. Fc-область антитела непосредственно участвует в активации комплемента, C1q-связывании, С3-активации и связывании Fc-рецептора. В то время как влияние антитела на систему комплемента зависит от определенных условий, связывание с C1q обусловлено определенными сайтами связывания в Fc-области. Указанные сайты связывания известны в данной области и описаны, например, у Lukas T.J. и др., J. Immunol. 127, 1981, cc.2555-2560; Brunhouse R. и Cebra J.J., Mol. Immunol. 16, 1979, cc.907-917; Burton D.R. и др., Nature 288, 1980, cc.338-344; Thommesen J.E. и др., Mol. Immunol. 37, 2000, cc.995-1004; Idusogie E.E. и др., J. Immunol. 164, 2000, cc.4178-4184; Hezareh М. и др., J. Virol. 75, 2001, cc.12161-12168; Morgan А. и др., Immunology 86, 1995, cc.319-324; и ЕР 0307434. Указанные сайты связывания представляют собой, например, L234, L235, D270, N297, Е318, K320, K322, Р331 и Р329 (нумерация дана согласно нумерации EU Кэбота, см. ниже). Антитела подклассов IgG1, IgG2 и IgG3, как правило, характеризуются способностью к активации комплемента, C1q-связыванию и С3-активации, в то время как IgG4 не активируют систему комплемента, не связываются с C1q и не активируют С3. Предпочтительно Fc-область представляет собой человеческую Fc-область.

Понятие «химерное антитело» относится к антителу, содержащему вариабельную область, т.е. связывающую область, полученную из одного источника или из одних и тех же видов, и по меньшей мере часть константной области, полученную из другого источника или других видов, и его, как правило, получают с использованием методов рекомбинантой ДНК. Предпочтительными являются химерные антитела, которые содержат мышиную вариабельную область и человеческую константную область. Другими предпочтительными формами «химерных антител», подпадающих под объем настоящего изобретения, являются антитела, константная область которых модифицирована или изменена по сравнению с исходным антителом с целью получения свойств, предлагаемых в изобретении, прежде всего касательно связывания C1q и/или связывания Fc-рецептора (FcR). Такие химерные антитела обозначают также как «антитела переключенного класса». Химерные антитела являются продуктом экспрессии генов иммуноглобулинов, содержащих сегменты ДНК, которые кодируют вариабельные области иммуноглобулинов, и сегменты ДНК, которые кодируют константные области иммуноглобулинов. Методы получения химерных антител включают обычные методы рекомбинантной ДНК и генной трансфекции, которые хорошо известны в данной области (см., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, cc.6851-6855; US 5202238 и US 5204244).

Понятие «гуманизированное антитело» относится к антителам, в которых каркасные или «гипервариабельные участки» (CDR) модифицированы так, что они содержат CDR иммуноглобулина другой специфичности по сравнению со специфичностью родительского иммуноглобулина. В предпочтительном варианте осуществления изобретения для получения «гуманизированного антитела» мышиный CDR трансплантируют в каркасный участок человеческого антитела (см., например, Riechmann L. и др., Nature 332, 1988, cc.323-327; и Neuberger M.S. и др., Nature 314, 1985, cc.268-270). Особенно предпочтительные CDR соответствуют CDR, которые представляют собой последовательности, распознающие антигены, указанные выше для химерных антител. Другими формами «гуманизированных антител», подпадающих под объем настоящего изобретения, являются антитела, константная область которых дополнительно модифицирована или изменена по сравнению с исходным антителом с целью получения свойств, предлагаемых в изобретении, прежде всего касательно связывания C1q и/или связывания Fc-рецептора (FcR).

Понятие «человеческое антитело» в контексте настоящего описания относится к антителам, вариабельные и константные области которых выведены из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Человеческие антитела хорошо известны в данной области (van Dijk M.A. и van de Winkel J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 2001, cc.368-374). Человеческие антитела можно получать также в трансгенных животных (например, мышах), которые в результате иммунизации могут продуцировать полный спектр или определенную часть человеческих антител при отсутствии производства эндогенного иммуноглобулина. Перенос набора генов иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии в такую мутантную зародышевую линию мышей должен приводить к производству человеческих антител после антигенной стимуляции (см., например, Jakobovits А., и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, cc.2551-2555; Jakobovits А. и др., Nature 362, 1993, cc.255-258; Bruggemann M. и др., Year Immunol. 7, 1993, cc.33-40). Человеческие антитела можно получать также с помощью фаговых дисплейных библиотек (Hoogenboom H.R. и Winter, G., J. Mol. Biol. 227, 1992, cc.381-388; Marks J.D. и др., J. Mol. Biol. 222, 1991, cc.581-597). Для получения человеческих моноклональных антител можно использовать также методы Cole с соавторами и Boerner с соавторами (Cole и др., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, под ред. Alan R. Liss, 1985, с.77; и Boerner Р., и др., J. Immunol. 147, 1991, cc.86-95). Как уже было отмечено для химерных и гуманизированных антител, предлагаемых в изобретении, понятие «человеческое антитело» включает также такие антитела, константная область которых модифицирована с целью получения свойств, предлагаемых в изобретении, прежде всего касательно связывания C1q и/или связывания FcR, например, путем «переключения класса», т.е. замены или мутации Fc-областей (например, IgG1 на IgG4 и/или IgG1/IgG4-мутация).

Понятие «рекомбинантное человеческое антитело» в контексте настоящего описания относится ко всем человеческим антителам, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с помощью методов рекомбинации, например к антителам, выделенным из клетки-хозяина, такой как NS0- или СНО-клетка, или из животного (например, мыши), которое является трансгенным из-за присутствия человеческих генов иммуноглобулинов или антител, экспрессируемых с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора, которым трансфектирована клетка-хозяин. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельную и константную области, которые находятся в преобразованной форме. Рекомбинантные человеческие антитела, предлагаемые в изобретении, подвергают соматической гипермутации in vivo. Таким образом, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и выведены из последовательностей VH и VL человеческой зародышевой линии и родственных им линий, могут не существовать в естественных условиях в спектре зародышевой линии человеческих антител in vivo.

Понятие «вариабельная область (домен)» (вариабельный домен легкой цепи (VL), вариабельная область тяжелой цепи (VH)) в контексте настоящего описания относится к областям каждой из пары легких и тяжелой цепей, которые участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном. Домены вариабельных человеческих легких и тяжелых цепей имеют одинаковую общую структуру, и каждый домен содержит четыре каркасных участка (FR), последовательности которых являются весьма консервативными, связанных тремя «гипервариабельными участками» (или определяющими комплементарность участками, CDR). Каркасные участки адаптированы к β-складчатой конформации, а CDR могут образовывать петли, соединяющие β-складчатую структуру. CDR в каждой цепи сохраняют их трехмерную структуру с помощью каркасных участков и образуют вместе с CDR из других цепей антигенсвязывающий центр. CDR3-участки тяжелой и легкой цепей антитела играют особенно важную роль в специфичности связывания/аффинности антител, предлагаемых в изобретении, и поэтому являются дополнительным объектом изобретения.

Понятия «гипервариабельный участок» или «антигенсвязывающий центр антитела» в контексте настоящего описания относятся к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывания антигена. Гипервариабельный участок содержит аминокислотные остатки из «определяющих комплементарность участков» или «CDR». «Каркасные» или «FR»-участки представляют собой участки вариабельной области, отличные от указанных в настоящем описании остатков гипервариабельного участка. Таким образом, легкие и тяжелые цепи антитела содержат в направлении от N- к С-концу участки FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. CDR каждой цепи разделены аминокислотами указанного каркасного участка. В частности, CDR3 тяжелой цепи представляют собой участок, который вносит наибольший вклад в связывание с антигеном. CDR- и FR-участки определяют с помощью стандартной номенклатуры Кэбота (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

«Константные области (домены)» тяжелой цепи и легкой цепи не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, но обладают различными эффекторными функциями. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей антитела или иммуноглобулины подразделяют на указанные выше классы.

Понятие «двухвалентное биспецифическое антитело» в контексте настоящего описания относится к антителу, как оно описано выше, в котором каждая из двух пар, включающая тяжелую цепь и легкую цепь (HC/LC), специфически связывается с различным антигеном, т.е. первая тяжелая и первая легкая цепи (полученные из антитела к первому антигену) специфически связываются обе с первым антигеном, а вторая тяжелая и вторая легкая цепи (полученные из антитела ко второму антигену) специфически связываются обе со вторым антигеном (как показано на фиг.2); указанные двухвалентные биспецифические антитела обладают способностью специфически связываться одновременно с двумя различными антигенами и не более чем с двумя антигенами, в отличие, во-первых, от моноспецифического антитела, которое обладает способностью связываться только с одним антигеном, и, во-вторых, от четырехвалентного тетраспецифического антитела, которое обладает способностью связываться одновременно с четырьмя молекулами антигенов.

Согласно изобретению соотношение между требуемым двухвалентным биспецифическим антителом и нежелательными побочными продуктами можно улучшать путем замены некоторых доменов только в одной паре, включающей тяжелую цепь и легкую цепь (HC/LC). Хотя первая из двух HC/LC-пар, полученная из антитела, которое специфически связывается с первым антигеном, остается практически не измененной, вторую из двух HC/LC-пар, полученную из антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном, изменяют с помощью следующей замены:

легкая цепь: замена вариабельного домена VL легкой цепи на вариабельный домен VH тяжелой цепи указанного антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном, и константного домена CL легкой цепи на константный домен СН1 тяжелой цепи указанного антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном,

тяжелая цепь: замена вариабельного домена VH тяжелой цепи на вариабельный домен VL легкой цепи указанного антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном, и константного домена СН1 тяжелой цепи на константный домен CL легкой цепи указанного антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном.

Таким образом, образовавшиеся двухвалентные биспецифические антитела представляют собой искусственные антитела, которые содержат

а) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося с первым антигеном; и

б) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном,

где указанная легкая цепь (антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном) содержит вариабельный домен VH вместо VL и константный домен СН1 вместо CL,

где указанная тяжелая цепь (антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном) содержит вариабельный домен VL вместо VH и константный домен CL вместо СН1.

Согласно еще одному объекту изобретения указанное улучшенное соотношение между требуемым двухвалентным биспецифическим антителом и нежелательными побочными продуктами можно дополнительно улучшать с помощью одного из указанных ниже двух альтернативных подходов.

А) Первый альтернативный подход (см. фиг.3)

СН3-домены указанного двухвалентного биспецифического антитела, предлагаемого в изобретении, можно изменять с помощью технологии «knob-into-holes», которая описана подробно на нескольких примерах, например в WO 96/027011, Ridgway J.B. и др., Protein Eng 9, 1996, cc.617-621; и у Merchant A.M. и др., Nat Biotechnol 16, 1998, cc.677-681. При использовании этого метода взаимодействующие поверхности двух СН3-доменов изменяют с целью повышения гетеродимеризации обеих тяжелых цепей, содержащих эти два СН3-домена. Каждый из двух СН3-доменов (двух тяжелых цепей) может представлять собой «выступ», а другой представлять собой «впадину». Введение дисульфидного мостика стабилизирует гетеродимеры (Merchant A.M, и др., Nature Biotech 16, 1998, cc.677-681; Atwell S., Ridgway J.B., Wells J.A., Carter P., J Mol Biol 270, 1997, cc.26-35) и повышает выход продукта.

Таким образом, согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения СН3-домены двухвалентного биспецифического антитела, в котором первый СН3-домен и второй СН3-домен каждый соприкасается друг с другом на поверхности раздела, которая представляет собой исходную поверхность раздела между СН3-доменами антитела, изменяют с помощью технологии «knob-into-holes», включая дополнительную стабилизацию путем интродукции дисульфидного мостика в СН3-домены (как описано в WO 96/027011, Ridgway J.B. и др., Protein Eng 9, 1996, cc.617-621; Merchant A.M и др., Nature Biotech 16, 1998, cc.677-681; и Atwell S., Ridgway J.B., Wells J.A., Carter P., J Mol Biol 270, 1997, cc.26-35) для активации формирования двухвалентного биспецифического антитела.

Таким образом, согласно одному из объектов изобретения двухвалентное биспецифическое антитело отличается тем, что СН3-домен одной тяжелой цепи и СН3-домен другой тяжелой цепи каждый соприкасаются друг с другом на поверхности раздела, которая представляет собой исходную поверхность раздела между СН3-доменами антитела; при этом поверхность раздела изменяют для активации формирования двухвалентного биспецифического антитела, где изменение отличается тем, что:

а) изменяют СН3-домен одной тяжелой цепи так, что на исходной поверхности раздела СН3-домена одной тяжелой цепи, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела СН3-домена второй тяжелой цепи в двухвалентном биспецифическом антителе, аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, который имеет большую по объему боковую цепь, создавая тем самым выпуклость на поверхности раздела СН3-домена одной тяжелой цепи, которая может помещаться в полость на поверхности раздела СН3-домена другой тяжелой цепи, и

б) изменяют СН3-домен другой тяжелой цепи так, что на исходной поверхности раздела второго СН3-домена, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела первого СН3-домена в двухвалентном биспецифическом антителе, аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, который имеет меньшую по объему боковую цепь, создавая тем самым полость на поверхности раздела второго СН3-домена, в которую может помещаться выпуклость на поверхности раздела первого СН3-домена.

Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, который имеет большую по объему боковую цепь, выбирают из группы, включающей аргинин (R), фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W).

Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, который имеет меньшую по объему боковую цепь, выбирают из группы, включающей аланин (А), серии (S), треонин (Т), валин (V).

Согласно одному из объектов изобретения оба СН3-домена дополнительно изменяют путем интродукции цистеина (С) в качестве аминокислоты в соответствующих положениях каждого СН3-домена так, чтобы мог образоваться дисульфидный мостик между обоими СН3-доменами.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения оба СН3-домена изменяют, используя остатки R409D; K370E (K409D) в качестве образующих «выступ» остатков и D399K; E357K в качестве образующих «впадину» остатков, как описано, например, в ЕР 1870459А1.

Или

Б) Второй альтернативный подход (см. фиг.4)

Этот подход предусматривает замену СН3-домена константной области одной тяжелой цепи на СН1-домен константной области тяжелой цепи; и замену СН3-домена константной области другой тяжелой цепи на CL-домен константной области легкой цепи.

CH1-домен константной области тяжелой цепи, на который заменяют СН3-домен тяжелой цепи, может представлять собой домен любого Ig-класса (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM) или подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2).

CL-домен константной области легкой цепи, на который заменяют СН3-домен тяжелой цепи, может быть лямбда- (λ) или каппа- (κ) типа, предпочтительно каппа- (κ) типа.

Таким образом, одним из предпочтительных вариантов осуществления изобретения является двухвалентное биспецифическое антитело, которое содержит:

а) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося с первым антигеном; и

б) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном, в котором вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга

и

в котором константные домены CL и СН1 заменены друг на друга, и необязательно

в) СН3-домен одной тяжелой цепи и СН3-домен другой тяжелой цепи, каждый из которых соприкасается друг с другом на поверхности раздела, которая представляет собой исходную поверхность раздела между СН3-доменами антитела; при этом поверхность раздела изменяют для активации формирования двухвалентного биспецифического антитела, где изменение отличается тем, что:

ва) изменяют СН3-домен одной тяжелой цепи так, что на исходной поверхности раздела СН3-домена одной тяжелой цепи, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела СН3-домена второй тяжелой цепи в двухвалентном биспецифическом антителе, аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, который имеет большую по объему боковую цепь, создавая тем самым выпуклость на поверхности раздела СН3-домена одной тяжелой цепи, которая может помещаться в полость на поверхности раздела СН3-домена другой тяжелой цепи,

и

вб) изменяют СН3-домен другой тяжелой цепи так, что на исходной поверхности раздела второго СН3-домена, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела первого СН3-домена в двухвалентном биспецифическом антителе, аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, который имеет меньшую по объему боковую цепь, создавая тем самым полость на поверхности раздела второго СН3-домена, в которую может помещаться выпуклость на поверхности раздела первого СН3-домена;

или

г) СН3-домен константной области одной тяжелой цепи заменяют на СН1-домен константной области тяжелой цепи; и СН3-домен константной области другой тяжелой цепи заменяют на CL-домен константной области легкой цепи.

Понятия «антиген» или «молекула антигена» в контексте настоящего описания применяют взаимозаменяемо, и они относятся ко всем молекулам, которые могут специфически связываться антителом. Двухвалентное биспецифическое антитело специфически связывается с первым антигеном и вторым отличным от первого антигеном. Понятие «антигены» в контексте настоящего описания включают, например, белки, различные эпитопы белков (в качестве различных антигенов согласно изобретению) и полисахариды. Они главным образом включают части (покрытия, капсулы, клеточные оболочки, жгутики, фимбрии и токсины) бактерий, вирусов и других микроорганизмов. Липиды и нуклеиновые кислоты являются антигенами только при их объединении с белками и полисахаридами. Не относящиеся к микробам экзогенные (чужеродные) антигены могут включать пыльцу, белок яиц и белки из трансплантированных тканей или органов или антигены, находящиеся на поверхности трансфузируемых кровяных клеток. Предпочтительно антиген выбирают из группы, включающей цитокины, белки клеточной поверхности, ферменты и рецепторы цитокинов, белков клеточной поверхности, ферментов и другие рецепторы.

Опухолевые антигены представляют собой антигены, которые презентуются молекулами ГКГ I или ГКГ II на поверхности опухолевых клеток. Иногда эти антигены презентуются опухолевыми клетками и никогда здоровыми клетками. В этом случае их называют специфическими для опухоли антигенами (TSA), и они, как правило, являются результатом специфической для опухоли мутации. Более распространенными являются антигены, которые презентуются опухолевыми клетками и здоровыми клетками, и их называют ассоциированными с опухолью антигенами (ТАА). Цитотоксические Т-лимфоциты, которые распознают эти антигены, могут обладать способностью разрушать опухолевые клетки до их пролиферации или метастазирования. Опухолевые антигены могут находиться также на поверхности опухоли в форме измененного в результате мутации рецептора, в этом случае они должны распознаваться В-клетками.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения по меньшей мере один из двух различных антигенов (первый и второй антиген), с которым двухвалентное биспецифическое антитело специфически связывается, представляет собой опухолевый антиген.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения оба различных антигена (первый и второй антиген), с которыми двухвалентное биспецифическое антитело специфически связывается, представляют собой опухолевые антигены; в этом случае первый и второй антиген могут представлять собой также два различных эпитопа одного и того же специфического для опухоли белка.

В другом предпочтительном варианте осуществления