Комбинации, включающие сахарид пневмококка серотипа 14

Комбинации, включающие сахарид пневмококка серотипа 14

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка претендует на приоритет предварительной заявки на патент США № 61/162996 (подана 24 марта 2009 г.), содержание которой полностью включено в настоящий документ путем ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области комбинированных вакцин, в частности вакцин, содержащих капсулярный сахарид пневмококка серотипа 14 и липоолигосахаридный компонент (например, из Neisseria meningitis).

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Streptococcus pneumoniae, также известный как пневмококк, представляет собой грамположительную сферическую бактерию. Современные пневмококковые вакцины основаны на капсулярных сахаридах. Разрешенные к применению педиатрические вакцины представляют собой (a) PREVNAR™ - 7-валентную смесь конъюгированных сахаридов серотипов 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F и 23F, (b) SYNFLORIX™ - десятивалентную смесь конъюгатов, также эффективную в отношении серотипов 1, 5 и 7F, и (с) PREVNAR 13™ - 13-валентную смесь конъюгатов, также эффективную в отношении серотипов 3, 6А и 19А. Также известны другие 9-, 10-, 11- и 13-валентные комбинации конъюгатов.

Neisseria meningitis, также известная как менингококк, представляет собой грамотрицательную сферическую бактерию. Современные менингококковые вакцины также основаны на капсулярных сахаридах. Эти вакцины включают моновалентные конюъгатные вакцины против серогруппы С (MENJUGATE™, MENINGITEC™ и NEISVAC-C™) и 4-валентные смеси конъюгатов против серогрупп А, С, W135 и Y (MENACTRA™). В настоящее время нет разрешенной вакцины общего назначения против серогруппы В («MenB»). В текущих исследованиях, направленных на создание вакцины MenB, используются везикулы внешней мембраны (например, MENZB™, HEXAMEN™, NONAMEN™) или очищенные компоненты внешней мембраны, такие как липоолигосахариды и белки внешней мембраны. В последнее время в фокус внимания попали вакцины MenB на основе везикул внешней мембраны, (OMV). Так, например, у Novartis Vaccines, GlaxoSmithKline и RIVM/NVI есть продукты на основе везикул.

В ссылке 1 раскрывается композиция для иммунизации против пневмококка и MenB, полученная путем комбинирования 13-валентной пневмококковой конъюгированной вакцины («13vPnC»; PREVNAR 13™ производства Wyeth) с 9-валентной вакциной на основе везикул внешней мембраны MenB (NONAMEN™ производства NVI).

Существует потребность в новых улучшенных комбинированных вакцинах для защиты как от менингококка серогруппы B, так и пневмококка.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Автор обнаружил недостатки комбинированной вакцины согласно ссылке 1. Вакцина 13vPnC включает капсулярный сахарид пневмококка серотипа 14 (CS14), а везикулы компонента MenB включают липоолигосахаридный компонент (LOS, также обозначается LPS) внешней мембраны бактерии. Автор пришел к выводу, что LOS (по меньшей мере LOS менингококков иммунотипов L2, L3, L4 и L7) и CS14 содержат одну и ту же тетрасахаридную структуру Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc. Этот тетрасахарид, известный как лакто-N-неотетраоза (LNnT), присутствует также у человека, в частности в грудном молоке, а также в виде концевой части лакто-N-неотетраозил церамида (также известного как параглобозид), который является биосинтетическим предшественником гликосфинголипидов групп крови ABH и P₁, а также некоторых ганглиозидов. Несмотря на то, что в человеческих тканях in vivo эпитоп LNnT обычно закрыт концевым остатком сиаловой кислоты (также присутствует в MenB, но не в CS14), в некоторых случаях (например, при пониженной температуре) он становится доступным для иммунной системы; связывание антитела с этим эпитопом ведет к гемолизу. Эта доступность приводит к аутоиммунной реакции, известной как болезнь холодовых агглютининов или AIHA (аутоиммунная гемолитическая анемия).

Автор пришел к выводу, что присутствие структуры LNnT как в LOS MenB, так и в CS14 означает, что введение любого из этих антигенов пациенту потенциально может приводить к повышению уровня антител протв LNnT. При одновременном введении этих двух антигенов существует риск очень сильного повышения уровня антител против LNnT, особенно если антигены вводят вместе с адъювантом вакцины. Таким образом, введение комбинированной вакцины, включающей как LOS MenB, так и CS14, несет в себе высокий риск индукции AIHA у пациентов, в особенности при введении вакцины в зимнее время. Изобретение направлено на снижение риска путем ограничения иммуногенного эффекта эпитопов LNnT в таких вакцинах и представляет различные способы снижения риска продуцирования аутореактивных антител при одновременном введении антигенов MenB и пневмококка.

В первом аспекте разрушают эпитоп LNnT в составе LOS, или CS14, или в обоих. Таким образом, в изобретении представлена иммуногенная композиция, содержащая липоолигосахарид менингококка (LOS) и капсулярный сахарид пневмококка серотипа 14 (CS14), где LOS и/или CS14 не включает (не включают) тетрасахарид Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc. Иммуногенная композиция обычно также включает адъювант. Если эпитоп присутствует в составе одного из LOS и CS14, предпочтительно, если он отсутствует в составе LOS.

Во втором аспекте эпитоп LNnT сохраняют в составе как LOS, так и CS14, но вакцина не содержит адъюванта. Таким образом, в изобретении представлена безадъювантная иммуногенная композиция, содержащая липоолигосахарид менингококка (LOS) и капсулярный сахарид пневмококка серотипа 14 (CS14), где как LOS, так и CS14 включают тетрасахарид Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc. Например, может использоваться LOS менингококка иммунотипа L2 или L3 (или их смесь).

В третьем аспекте эпитоп LNnT сохраняют в составе как LOS, так и CS14, однако их дозировка уменьшена. Таким образом, в изобретении представлена иммуногенная композиция, содержащая липоолигосахарид менингококка (LOS) и капсулярный сахарид пневмококка серотипа 14 (CS14), где (i) как LOS, так и CS14 включают тетрасахарид Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, (ii) концентрация LOS меньше 5 мкг/мл, и (iii) концентрация CS14 меньше 5 мкг/мл.

В четвертом аспекте вакцину против MenB и пневмококка типа 14 получают с использованием LNnT-содержащих LOS против MenB и белкового антигена против пневмококка. Таким образом, в настоящем изобретении представлена иммуногенная композиция, содержащая липоолигосахарид менингококка (LOS) и полипептидный антиген пневмококка, где (i) LOS включает тетрасахарид Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, (ii) полипептид пневмококка может вызывать иммунный ответ, эффективный против пневмококка серотипа 14, и (iii) композиция не включает капсулярного сахарида пневмококка.

В пятом аспекте вакцину против MenB и пневмококка типа 14 получают с использованием капсулярного сахарида CS14, содержащего LNnT, и антигена против MenB, отличного от LOS. Таким образом, в изобретении представлена иммуногенная композиция, содержащая полипептид менингококка и капсулярный сахарид пневмококка серотипа 14, где (i) капсулярный сахарид включает тетрасахарид Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, (ii) полипептид менингококка может вызывать иммунный ответ, эффективный против менингококка серогруппы B, и (iii) композиция не включает липоолигосахарида менингококка.

В некоторых воплощениях изобретения иммуногенные композиции включают не более одного сероподтипа PorA менингококка, например, они могут не включать белок внешней мембраны PorA.

Липоолигосахарид менингококка

LOS менингококка представляет собой глюкозаминовый фосфолипид, находящийся во внешнем слое внешней мембраны бактерии. Он делится на липид А и коровый олигосахарид, причем липид А служит гидрофобным якорем в мембране. Гетерогенность олигосахаридного кора обеспечивает структурное и антигенное разнообразие различных штаммов менингококка, на основании которого штаммы делятся на 12 иммунотипов (L1-L12). На фигуре 1 показаны коровые сахариды иммунотипа L3. α-Цепь, связанная с Hep^I (гептозой), содержит тетрасахарид LNnT и кэп сиаловой кислоты. Такая же структура наблюдается у иммунотипов L7 и L9. Иммунотипы L2 и L4 содержат такую же α-цепь, как и L3, но другие β- и/или γ-цепи, связанные с Hep^II. Остаток KDO¹ (2-кето-3-дезоксиоктулозоновой кислоты) прикреплен к липиду А LOS и также часто связан со вторым остатком KDO (на фигуре 1 обозначен как KDO^II).

α-Цепи L2 и L3 содержат тетрасахарид LNnT. При использовании в изобретении LOS, не содержащего тетрасахарида LNnT, может использоваться LOS другого иммунотипа (например, L1, L4, L5, L6 или L8). Однако в некоторых воплощениях желательно сохранить эпитопы L2 и/или L3 (отличные от их эпитопов LNnT). Этого можно достигнуть, используя мутантные штаммы, не способные синтезировать тетрасахарид LNnT в составе α-цепи. Известно, что такого результата можно достигнуть с помощью нокаута ферментов, осуществляющих соответствующие присоединения в ходе биосинтеза (см., например, ссылки 2-7). Например, нокаут фермента LgtB предотвращает присоединение терминальной галактозы LNnT, а также дальнейшее присоединение терминальной сиаловой кислоты к α-цепи. Нокаут фермента LgtA предотвращает присоединение N-ацетилглюкозамина LNnT и все дальнейшие присоединения. Нокаут LgtA может сопровождаться нокаутом LgtC, если рассматриваемый штамм содержит ген lgtC (например, штамм MC58 менингококка серогруппы В с иммунотипом L3 состоит из lgtA, lgtB и lgtE и не содержит lgtC и lgtD). Сходным образом, нокаут LgtE и/или фермента GalE предотвращает присоединение внутренней галактозы, а нокаут LgtF предотвращает присоединение глюкозы к остатку Hep^I. Любой из этих нокаутов может использоваться по отдельности или в комбинации для разрушения тетрасахарида LNnT в штамме иммунотипа L2, L3, L4, L7 или L9. Предпочтителен нокаут по меньшей мере LgtB, поскольку в результате его получается LOS, сохраняющий полезную иммуногенность, но не включающий эпитопа LNnT.

Помимо мутаций, разрушающих эпитоп LNnT, нокаут гена galE также приводит к образованию полезного модифицированного LOS, и сходным образом возможно нокаутировать ген трансферазы жирных кислот липида А [8]. От LOS можно отщепить по меньшей мере одну первичную О-связанную жирную кислоту [9]. Также можно использовать LOS c меньшим числом вторичных ацильных цепей на молекулу LOS [10]. Обычно LOS включает по меньшей мере структуру GlcNac-Hep₂-фосфоэтаноламин-KDO₂-липид А [11]. LOS может включать трисахарид GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, но не включать тетрасахарид LNnT.

Композиции согласно изобретению могут включать LOS в различных формах. LOS может использоваться в очищенном виде сам по себе. Он может быть конъюгирован с белком-носителем. Он может присутствовать в составе везикул внешней мембраны менингококка. Он может быть конъюгирован с везикулами внешней мембраны менингококка.

Конъюгация LOS может осуществляться через липид А или через любую другую подходящую группу в его составе, например, через остатки KDO. Такое альтернативное связывание необходимо при отсутствии липида А в составе LOS. Техники конъюгации LOS известны, например, из ссылок 9, 11, 12, 13 и т.д. Предпочтительные белки-носители для этих конъюгатов представляют собой бактериальные токсины, такие как дифтерийный или столбнячный токсины, или их токсоиды, или мутанты. Они обычно используются в конъюгированных вакцинах. Пригоден мутант CRM₁₉₇ дифтерийного токсина [14]. Другие пригодные белки-носители включают белковый комплекс внешней мембраны N. meningitides [15], синтетические пептиды [16, 17], белки теплового шока [18, 19], белки коклюша [20, 21], цитокины [22], лимфокины [22], гормоны [22], факторы роста [22], искусственные белки, содержащие множественные эпитопы CD4+ T-клеток человека из различных антигенов патогенного происхождения [23], такие как N19 [24], белок D H. influenzae [25-27], пневмолизин [28] или его нетоксичные производные [29], поверхностный белок пневмококка PspA [30], белки усвоения железа [31], токсины А или В С. difficile [32], рекомбинантный экзопротеин А (rEPA) Pseudomonas aeruginosa [33] и т.д.

LOS могут находиться в составе везикулы. Такие везикулы включают любые протеолипосомные везикулы, полученные путем разрыва или блеббинга внешней мембраны менингококка с образованием везикул, включающих белковые компоненты и LOS внешней мембраны. Таким образом, термин включает OMV (иногда называемые «блебами»), микровезикулы («MV», [34]) и «нативные OMV» («NOMV», [35]).

MV и NOMV представляют собой природные мембранные везикулы, спонтанно образующиеся в процессе роста бактерий и высвобождаемые в культуральную среду. MV можно получать путем культивирования Neisseria в жидкой питательной среде, отделения целых клеток от меньших по размеру MV в жидкой питательной среде (например, с помощью фильтрации или центрифугирования на низкой скорости для осаждения только клеток, но не меньших по размеру везикул) и дальнейшего сбора MV из среды без клеток (например, с помощью фильтрации, дифференциальной преципитации или агрегации MV, с помощью центрифугирования на высокой скорости для осаждения MV). Штаммы, используемые для получения MV, могут в общем выбираться в зависимости от количества MV, продуцируемых в культуре, например, в ссылках 36 и 37 описана Neisseria, продуцирующая большое количество MV.

OMV, получаемые искусственно из бактерий, можно получать с использованием детергента (например, дезоксихолата) или без (см. например, ссылку 38). Техники образования OMV включают обработку бактерий детергентом на основе солей желчных кислот (например, солей литохолиевой кислоты, хенодезоксихолиевой кислоты, урсодезоксихолиевой кислоты, дезоксихолиевой кислоты, холиевой кислоты, урсохолиевой кислоты и т.д.; для обработки Neisseria предпочтителен дезоксихолат натрия [39 и 40] при значении pH, достаточно высоком, для того чтобы детергент не выпадал в осадок [41]. Другие техники могут применяться практически в отсутствие детергента [38] с использованием таких техник, как соникация, гомогенизация, микрофлюидизация, кавитация, осмотический шок, размалывание, френч-пресс, перемешивание и т.д. При использовании способов без детергента или с низкой концентрацией детергента могут сохраняться полезные антигены, такие как NspA [38]. Таким образом, в способе может использоваться буфер для экстракции OMV с 0,5% дезоксихолата или меньше, например примерно 0,2%, примерно 0,1%, <0,05% или 0.

Полезный процесс получения OMV, описанный в ссылке 42, включает ультрафильтрацию неочищенных OMV, а не центрифугирование на высокой скорости. Процесс может включать стадию ультрацентрифугирования после ультрафильтрации.

Везикулы для использования в настоящем изобретении могут быть получены из любого штамма менингококка. Как правило, везикулы получают из штамма серогруппы B, однако возможно получить их и из серогрупп, отличных от B (например, в ссылке 41 описан процесс для серогруппы А), таких как A, C, W135 или Y. Штамм может принадлежать к любому серотипу (например, 1, 2а, 2b, 4, 14, 15, 16 и т.д.), любому сероподтипу и любому иммунотипу (например, L1; L2; L3; L3,3,7; L10 и т.д.). Менингококки могут принадлежать к любой подходящей линии, включая гиперинвазивные и гипервирулентные, например, к одному из следующих семи гипервирулентных линий: подгруппа I; подгруппа III; подгруппа IV-1; комплекс ET-5; комплекс ET-37; кластер А4; линия 3. Эти линии определяют с помощью мультилокусного ферментативного электрофореза (MLEE), но также для классификации менингококков можно использовать мультилокусное секвенирование-типирование (MLST) [43], например, комплекс ET-37 представляет собой комплекс ST-11 по данным MLST, комплекс ET-5 представляет собой комплекс ST-32 (ET-5), линия 3 представляет собой ST-41/44 и т.д. Везикулы можно получать из штаммов одного из следующих подтипов: P1.2; P1.2,5; P1.4; P1.5; P1.5,2; P1.5,c; P1.5c,10; P1.7,16; P1.7,16b; P1.7h,4; P1.9; P1.15; P1.9,15; P1.12,13; P1.13; P1.14; P1.21,16; P1.22,14.

Везикулы для использования в настоящем изобретении можно получать из штаммов менингококка дикого типа или мутантных штаммов менингококка. Например, в ссылке 44 описано получение везикул из N. meningitidis с модифицированным геном fur. В ссылке 51 показано, что одновременно с нокаутом porA и cps экспрессия nspA должна быть повышена. Дополнительные нокаутные мутанты N. meningitidis для получения OMV раскрыты в ссылках 3, 51 и 52. В ссылке 45 раскрыты везикулы с повышенным fHBP. В ссылке 46 раскрыто конструирование везикул из штаммов, модифицированных для экспрессии различных подтипов PorA. В настоящем изобретении могут использоваться эти или другие мутанты.

Таким образом, штамм, используемый в настоящем изобретении, в некоторых воплощениях может экспрессировать более одного подтипа PorA. Ранее были сконструированы 6-валентные и 9-валентные штаммы в отношении PorA. Штамм может экспрессировать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 подтипов PorA: P1.7,16; P1.5-1,2-2; P1.19,15-1; P1.5-2,10; P1.12-1,13; P1.7-2,4; P1.22,14; P1.7-1,1 и/или P1.18-1,3,6. Однако в других воплощениях может использоваться штамм с пониженной экспрессией PorA, например, в котором количество PorA уменьшено на по меньшей мере 20% (например, на ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90%, ≥95% и т.д.) относительно уровня дикого типа (например, относительно штамма Н44/76, или PorA может быть нокаутирован, как описано в ссылке 51).

Предпочтительно, было показано, что везикулы, полученные из штамма менингококка LgtB^-ve, усиливают ответ на CS14 в комбинированном препарате.

LOS могут быть получены из штамма (например, генетически сконструированного штамма менингококка), имеющего постоянный (т.е. без фазовой вариации) иммунотип LOS, как описано в ссылке 47. Например, постоянными могут быть иммунотипы LOS L2 и L3. Такие штаммы могут менять свой иммунотип более чем в 2 раза реже (даже в 50 раз), чем исходный штамм дикого типа. В ссылке 47 раскрывается, как получить такой результат путем модификации продуктов генов lgtA и/или lgtC.

В некоторых воплощениях у штамма может наблюдаться повышенная экспрессия определенных белков (относительно соответствующего штамма дикого типа). Например, у штамма может наблюдаться повышенная экспрессия NspA, белка 287 [48], fHBP [45], TbpA и/или TbpB [49], Cu,Zn-зависимой супероксиддисмутазы [49] и т.д.

В некоторых воплощениях штамм может содержать одну или более мутаций, приводящих к нокауту или повышенной экспрессии, описанных в ссылках 3 и 50-52. Гены, подходящие для даун-регуляции и/или для нокаута, включают: (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc,PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB [50]; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB [51]; (c) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB [52]; и (d) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorB, SiaD, SynA, SynB и/или SynC [3].

При использовании мутантного штамма в некоторых воплощениях он может обладать одной или более или всеми следующими характеристиками, необязательно помимо мутаций, разрушающих LNnT: (i) повышенный TbpA; (ii) повышенный NhhA; (iii) повышенный Omp85; (iv) повышенный LbpA; (v) повышенный NspA; (vi) нокаутированный PorA; (vii) пониженный или нокаутированный FrpB; (viii) пониженный или нокаутированный Opa; (ix) пониженный или нокаутированный Opc; (x) делетированный комплекс генов cpx.

Предпочтительно, если LOS в составе везикулы может быть обработан определенным образом с целью связывания LOS и белковых компонентов в везикуле («внутрипузырьковая» конъюгация [3]).

LOS может быть О-ацетилирован по остатку GlcNAc, присоединенному к его остатку гептозы II, например, для L3 [53].

Иммуногенная композиция может включать более одного типа LOS, например, LOS менингококков иммунотипов L2 и L3. Например, могут использоваться комбинации LOS, описанные в ссылке 54.

В некоторых воплощениях LOS может присутствовать в композиции в концентрации менее чем 5 мкг/мл, например, ≤4 мкг/мл, ≤3 мкг/мл, ≤2 мкг/мл, ≤1 мкг/мл. Такая низкая концентрация может использоваться, если в CS14 сохраняется эпитоп LNnT.

Антиген LOS может предпочтительно индуцировать бактерицидные антитела против менингококка после введения субъекту.

Капсулярный сахарид пневмококка серотипа 14

Композиции согласно изобретению включают капсулярный сахарид пневмококка серотипа 14 (CS14). В ссылке 55 показано, что CS14 содержит повторяющуюся структуру, приведенную на фигуре 2.

Сахарид CS14, используемый в изобретении, обычно включает повторяющиеся единицы дикого типа, однако в некоторых воплощениях может быть модифицирован для исключения тетрасахарида Galβ-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc. Такая модификация может осуществляться путем нокаута одного или более значимых ферментов биосинтеза или химического и/или ферментативного воздействия на сахарид для модификации одного или более из четырех остатков в составе тетрасахарида. Например, эндо-β-галактозидаза, очищенная из культуральных супернатантов Cytophaga keratolytica, катализирует гидролиз связей галактоза β(1→4) глюкоза чувствительных полисахаридов, включая CS14.

CS14 может быть N-ацетилирован. Как описано в ссылке 56, например, он может быть N-ацетилирован на более чем 50%, 60%, 70%, 80% или 90%.

Обычно CS14 включают в композицию в виде конъюгата. Подходящие белки-носители для таких конъюгатов описаны выше, например, бактериальные токсины, такие как дифтерийный или столбнячный токсины, или их токсоиды или мутанты, такие как CRM₁₉₇, белковый комплекс внешней мембраны N. meningitidis, синтетические пептиды, белки теплового шока, белки коклюша, цитокины, лимфокины, гормоны, факторы роста, искусственные белки, включающие множественные эпитопы CD4⁺ T-клеток различных антигенов патогенного происхождения, таких как N19, белок D H. influenzae, пневмолизин или его нетоксичные производные, поверхностный белок пневмококка PspA, белки усвоения железа, токсин А или В C. difficile, rEPA и т.д. Особенно пригодны в роли белков-носителей CS14: CRM197, токсоид столбняка, токсоид дифтерии и белок D H. influenzae. В особенности пригоден CRM197, как показано в PREVNAR™.

Молекула-носитель может быть ковалентно конъюгирована к CS14 напрямую или посредством линкера. Известны различные линкеры, например линкер на основе адипиновой кислоты, который может образовываться путем спаривания свободной группы -NH₂ (например, введенной в сахарид с помощью аминирования) с адипиновой кислотой (например, с использованием диимидной активации) и дальнейшего спаривания белка с полученным промежуточным продуктом сахарида-адипиновой кислоты [57, 58]. Другой предпочтительный тип связи представляет собой карбонильный линкер, который может образовываться посредством реакции свободной гидроксильной группы модифицированного сахарида с CDI [59, 60] с последующей реакцией с белком с образованием карбаматной связи. Другие линкеры включают β-пропионамидо [61], нитрофенил-этиламин [62], галоацил галидов [63], гликозидных связей [64], 6-аминокапроновой кислоты [65], N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)-пропионата (SPDP) [66], дигидразида адипиновой кислоты ADH [67], групп С₄-С₁₂ [68] и т.д. Также может использоваться карбодиимидная конденсация [69].

Может использоваться конъюгация CS14 путем восстановительного аминирования. Сахарид вначале может быть окислен периодатом для введения альдегидной группы, которая затем может образовывать прямую ковалентную связь с белком-носителем путем восстановительного аминирования, например, с ε-аминогруппой лизина. Если сахарид включает множественные альдегидные группы в одной молекуле, такая техника связывания может привести к образованию продукта с поперечными сшивками, где множественные альдегиды реагируют с множественными аминами носителя.

Сахарид CS14 может содержать полноразмерный интактный сахарид, полученный из пневмококка, и/или может содержать фрагменты полноразмерных сахаридов, т.е. более коротких сахаридов, чем нативные капсулярные сахариды, встречающиеся у бактерий. Таким образом, сахариды могут быть деполимеризованы, причем деполимеризация может происходить во время или после очистки сахарида, но до конъюгации. Деполимеризация уменьшает длину цепи сахаридов. Деполимеризация может использоваться для достижения длины цепи, оптимальной для иммуногенности, и/или для уменьшения длины цепи для физической управляемости сахаридов. Как видно из PREVNAR™, предпочтителен интактный CS14.

В некоторых воплощениях CS14 присутствует в композиции в концентрации менее чем 5 мкг/мл, например, ≤4 мкг/мл, ≤3 мкг/мл, ≤2 мкг/мл, ≤ 1мкг/мл. Такая низкая концентрация может использоваться, если в CS14 сохраняется эпитоп LNnT. Удобна концентрация примерно 4 мкг/мл.

Антиген CS14 может предпочтительно индуцировать антикапсулярные антитела, связывающиеся с CS14, например индуцировать уровень антител против CS14 ≥0,20 мг/мл [70]. Уровень антител можно оценить с помощью иммуноферментного анализа (EIA) и/или опсонофагоцитарной активности (OPA). Эффективность способа EIA была многократно подтверждена, и существует связь между концентрацией антител и эффективностью вакцины.

Альтернативные менингококковые антигены

В некоторых воплощениях настоящего изобретения композиция включает капсулярный сахарид CS14, содержащий LNnT, и антиген против MenB, отличный от LOS. Альтернативы LOS включают полипетидные антигены, такие как fHBP, 287, NadA, NspA, HmbR, NhhA, App и/или Omp85. Полезно, если эти антигены присутствуют в виде очищенных полипептидов, например рекомбинантных полипептидов.

Менингококковый антиген может предпочтительно индуцировать бактерицидные антитела против менингококка после введения субъекту.

Фактор fHBP (белок, связывающий фактор H)

Композиция согласно изобретению может содержать антиген fHBP. Антиген fHBP детально описан. Он также известен как белок «741» [SEQ ID NO:2535 и 2536 в ссылке 81], «NMB1870», «GNA1870» [ссылки 71-73], «P2086», «LP2086» или «ORF2086» [74-76]. Он представляет собой натуральный липопротеин и экспрессируется менингококками всех серогрупп. Структура С-концевого иммунодоминантного домена (fHbpC) была определена с помощью NMR [77]. Эта часть белка образует 8-нитевой β-бочонок, нити которого соединены петлями различной длины. Бочонку предшествует короткая α-спираль и гибкий N-концевой хвост.

Существуют три различных варианта антигена fHBP [78], и известно, что сыворотка против определенного семейства обладает бактерицидными свойствами против членов этого семейства, но не активна в отношении штаммов, экспрессирующих одно из двух других семейств, т.е. существует перекрестная защита внутри семейства, но не между семействами. В настоящем изобретении может использоваться единственный вариант fHBP, но полезно включать fHBP из двух или трех вариантов.

Если в изобретении используется один вариант fHBP, композиция может включать полипептид, содержащий: (a) аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на a% SEQ ID NO:1, и/или содержащий аминокислотную последовательность, состоящую из фрагмента из по меньшей мере x последовательных аминокислот из SEQ ID NO:1; или (b) аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на b% SEQ ID NO:2, и/или содержащий аминокислотную последовательность, состоящую из фрагмента из по меньшей мере y последовательных аминокислот из SEQ ID NO:2; или (c) аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на с% SEQ ID NO:3, и/или содержащий аминокислотную последовательность, состоящую из фрагмента из по меньшей мере z последовательных аминокислот из SEQ ID NO:3.

Если в изобретении используется fHBP из двух или трех вариантов, композиция может включать комбинацию двух или трех различных fHBP, выбираемых из: (а) первого полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на a% SEQ ID NO:1, и/или содержащего аминокислотную последовательность, состоящую из фрагмента из по меньшей мере x последовательных аминокислот из SEQ ID NO:1; (b) второго полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на b% SEQ ID NO:2, и/или содержащего аминокислотную последовательность, состоящую из фрагмента из по меньшей мере y последовательных аминокислот из SEQ ID NO:2; и/или (c) третьего полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на с% SEQ ID NO:3, и/или содержащего аминокислотную последовательность, состоящую из фрагмента из по меньшей мере z последовательных аминокислот из SEQ ID NO:3.

Если в изобретении используется fHBP из двух вариантов, композиция может включать как: (а) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на a% SEQ ID NO:1, и/или содержащий аминокислотную последовательность, состоящую из фрагмента из по меньшей мере x последовательных аминокислот из SEQ ID NO:1; так и (b) второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на b% SEQ ID NO:2, и/или содержащий аминокислотную последовательность, состоящую из фрагмента из по меньшей мере y последовательных аминокислот из SEQ ID NO:2. Первый и второй полипептиды имеют разные аминокислотные последовательности.

Если в изобретении используется fHBP из двух вариантов, композиция может включать как: (а) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на a% SEQ ID NO:1, и/или содержащий аминокислотную последовательность, состоящую из фрагмента из по меньшей мере x последовательных аминокислот из SEQ ID NO:1; так и (b) второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на с% SEQ ID NO:3, и/или содержащий аминокислотную последовательность, состоящую из фрагмента из по меньшей мере z последовательных аминокислот из SEQ ID NO:3. Первый и второй полипептиды имеют разные аминокислотные последовательности.

Параметр а равен по меньшей мере 85, например, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 или более. Параметр b равен по меньшей мере 85, например, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 или более. Параметр c равен по меньшей мере 85, например, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 или более. Величины a, b и с не зависят друг от друга.

Параметр x равен по меньшей мере 7, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250). Параметр y равен по меньшей мере 7, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250). Параметр z равен по меньшей мере 7, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250). Величины x, y, и z не зависят друг от друга. Фрагменты SEQ ID NO:1, 2 и 3 предпочтительно содержат эпитоп соответствующей SEQ ID.

Пригодная композиция может включать полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90% SEQ ID NO:3 (например, по меньшей мере на 93%), и/или содержащий аминокислотную последовательность, состоящую из фрагмента из по меньшей мере 40 последовательных аминокислот из SEQ ID NO:3.

В некоторых воплощениях к полипептиду (полипептидам) fHBP могут быть присоединяться липиды, например, через N-концевой цистеин, обычно с образованием трипальмитоил-S-глицерилцистеина. В других воплощениях липиды могут не присоединяться.

Введение fHBP предпочтительно индуцирует антитела, способные связываться с полипептидом менингококка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, 2 или 3. Предпочтительные антигены fHBP для использования в настоящем изобретении могут индуцировать бактерицидные антитела против менингококка после введения субъекту.

Независимо от того, присутствует ли один или несколько полипептидов fHBP, общая доза fHBP может лежать в пределах от 60 мкг на дозу до 200 мкг на дозу.

287

Композиция согласно изобретению может включать антиген 287. Антиген 287 включен в опубликованную последовательность генома штамма менингококка MC58 серогруппы В [79] как ген NMB2132 (номер доступа в GenBank GI:7227388; SEQ ID NO:9 в настоящем документе). На сегодняшний день опубликованы последовательности антигена 287 из многих штаммов. Например, аллельные формы 287 приведены на фигурах 5 и 15 в ссылке 80 и в примере 13 и на фигуре 21 в ссылке 81 (SEQ ID NO:3179-3184 в ней). Также были описаны различные иммуногенные фрагменты антигена 287.

Предпочтительные антигены 287 для использования в настоящем изобретении содержат аминокислотную последовательность: (a) идентичную на 50% или более (например, на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) SEQ ID NO:9; и/или (b) содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот из SEQ ID NO:9, где n равно или больше 7 (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:9.

Наиболее пригодные антигены 287 согласно изобретению могут индуцировать антитела, которые после введения субъекту могут связываться с полипептидом менингококка, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9. Предпочтительные антигены 287 для использования в настоящем изобретении могут индуцировать бактерицидные антитела против менингококка после введения субъекту.

NadA (адгезин А Neisseria)

Композиция согласно изобретению может включать антиген NadA. NadA включен в опубликованную последовательность генома штамма менингококка MC58 серогруппы В [79] как ген NMB1994 (номер доступа в GenBank GI:7227256; SEQ ID NO:10 в настоящем документе). На сегодняшний день опубликованы последовательности антигена NadA из многих штаммов и детально описана активность белка в качестве адгезина Neisseria. Также были описаны различные иммуногенные фрагменты NadA.

Предпочтительные антигены NadA для использования в настоящем изобретении содержат аминокислотную последовательность: (a) идентичную на 50% или более (например, на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) SEQ ID NO:10; и/или (b) содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот из SEQ ID NO:10, где n равно или больше 7 (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:10.

Наиболее пригодные антигены NadA согласно изобретению могут индуцировать антитела, которые после введения субъекту могут связываться с полипептидом менингококка, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10. Предпочтительные антигены NadA для использования в настоящем изобретении могут индуцировать бактерицидные антитела против менингококка после введения субъекту. SEQ ID NO:6 представляет собой один такой фрагмент.

NspA (поверхностный белок А Neisseria)

Композиция согласно изобретению может включать антиген NspA. NspA включен в опубликованную последовательность генома штамма менингококка MC58 серогруппы В [79] как ген NMB0663 (номер доступа в GenBank GI:7225888; SEQ ID NO:11 в настоящем документе). Ранее антиген был описан в ссылках 82 и 83. На сегодняшний день опубликованы последовательности антигена NspA из многих штаммов. Также были описаны различные иммуногенные фрагменты NspA.

Предпочтительные антигены NspA для использования в настоящем изобретении содержат аминокислотную последовательность: (a) идентичную на 50% или более (например, на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) SEQ ID NO:11; и/или (b) содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот из SEQ ID NO:11, где n равно или больше 7 (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:11.

Наиболее пригодные антигены NspA согласно изобретению могут индуцировать антитела, которые после введения субъекту могут связываться с полипептидом менингококка, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:11. Предпочтительные антигены NspA для использования в настоящем изобретении могут индуцировать бактерицидные антитела против менингококка после введения субъекту.

HmbR

Композиции согласно изобретению могут включать антиген HmbR менингококка. Последовательность полноразмерного HmbR включена в опубликованную последовательность генома штамма менингококка MC58 серогруппы В [79] как ген NMB1668 (SEQ ID NO:7 в настоящем документе). В ссылке 84 приведена последовательность HmbR из другого штамма (SEQ ID NO:8 в настоящем документе). SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8 различаются под длине на 1 аминокислоту и идентичны на 94,2%.

В изобретении может использоваться полипептид, соответствующий полноразмерной последовательности HmbR, однако часто может использоваться полипептид, соответствующий частичной последовательности HmbR. Таким образом, в некоторых воплощениях последовательность HmbR, используемая согласно изобретению, может включать аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на i% SEQ ID NO:7, где i равно 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или более. В других воплощениях последовательность HmbR, используемая согласно изобретению, может содержать фрагмент из по меньшей мере j последовательных аминокислот из SEQ ID NO:7, где j равно 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более. В других воплощениях последовательность HmbR, используемая согласно изобретению, может включать аминокислотную последовательность, (i) идентичную по меньшей мере на i% SEQ ID NO:7 и/или (ii) содержащую фрагмент из по меньшей мере j последовательных аминокислот из SEQ ID NO:7.

Предпочтительные фрагменты из j аминокислот содержат эпитоп из SEQ ID NO:7. Такие эпитопы обычно содержат аминокислоты, расположенные на поверхности HmbR. Полезные эпитопы включают эпитопы с аминокислотами, участв