Способы селекции эукариотических клеток, экспрессирующих гетерологичный белок

Способы селекции эукариотических клеток, экспрессирующих гетерологичный белок

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому способу селекции эукариотических клеток-хозяев, в частности клеток-хозяев млекопитающих, экспрессирующих целевой продукт. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу эффективного получения целевого продукта на высоком уровне.

Предпосылки создания изобретения

Способность клонировать и экспрессировать в больших количествах целевые продукты, например рекомбинантные пептиды и белки, приобрела особенно важное значение. Способность получения белков с высокой степенью очистки имеет важное значение в фармацевтической промышленности и биотехнологии, например, для получения белковых фармацевтических средств, а также при проведении фундаментальных исследований, например, по кристаллизации белков при выявлении их трехмерной структуры. Белки, которые трудно получить в большом количестве, могут быть подвергнуты сверхэкспрессии в клетке-хозяине, а затем выделены и очищены.

Выбор системы экспрессии для получения рекомбинантных белков зависит от многих факторов, включая особенности роста клеток, уровни экспрессии, внеклеточную и внутриклеточную экспрессию, посттрансляционные модификации и биологическое действие целевого белка, а также результаты регуляции и экономические соображения, связанные с получением белков терапевтического назначения. Принципиальные преимущества клеток млекопитающих относительно других систем экспрессии, например, бактерий или грибов, заключаются в способности производить должную укладку белка, сложное N-связанное гликозилирование и аутентичное O-связанное гликозилирование, а также широкий спектр других посттрансляционных модификаций. Благодаря описанным преимуществам эукариотические клетки, и особенно клетки млекопитающих, в настоящее время являются системой экспрессии для получения сложных терапевтических белков, например моноклональных антител, причем такая система экспрессии является системой выбора.

Наиболее общий подход к получению клеток-хозяев с высоким уровнем экспрессии (также называемых высокоэффективными продуцентами) заключается в выработке соответствующего вектора экспрессии для экспрессии целевого продукта на первой стадии. Вектор экспрессии вызывает экспрессию полинуклеотида, кодирующего целевой продукт, в клетке-хозяине и обеспечивает по меньшей мере один селективный маркер для получения линии рекомбинантных клеток. Основные элементы векторов экспрессии млекопитающих обычно включают конститутивный или индуцибельный промотор, способный к интенсивной транскрипции; сигналы оптимизированного процессинга иРНК и трансляции, которые обычно включают последовательность Kozak, кодон терминации трансляции, сигналы расщепления иРНК и полиаденилирования, терминатор транскрипции и селективные маркеры для получения стабильных линий клеток и для генной амплификации; кроме того, прокариотическое начало репликации и селективные маркеры для размножения вектора в бактериях могут быть обеспечены вектором экспрессии.

В предшествующие годы исследования были сосредоточены на конструировании улучшенных векторов для генной экспрессии в клетках-хозяевах. Однако, несмотря на изобилие доступных векторов, интенсивное получение на высоком уровне полипептида/белка в клетках млекопитающих по-прежнему осложнено.

Один из применяемых методов получения линий высокопродуктивных клеток, экспрессирующих на высоком уровне целевой продукт, заключается в стабильной трансфекции клеток-хозяев. Однако стабильная интеграция в геном происходит редко, и только небольшая клеточная субпопуляция стабильно трансфецированных клеток представлена высокопродуктивными клетками. Соответственно осуществление такого отбора осложнено.

Селективные маркеры и системы селекции широко используют в генной инженерии, методах рекомбинации ДНК и в выработке рекомбинантных продуктов для получения клеток-хозяев, экспрессирующих целевой продукт на высоком уровне. Соответствующие системы также применимы для создания и идентификации стабильно трансфецированных клонов. Главная цель применения соответствующих селективных маркеров и систем отбора заключается в интродукции селективного гена, который под воздействием селективных условий роста позволяет идентифицировать клетки, способные к выработке на высоком уровне интродуцированного селективного маркера и соответственно рекомбинантного целевого продукта. Повышение уровня экспрессии продукта может быть достигнуто, например, амплификацией гена с применением линии клеток, например, дефицитных по ферменту, например, по дигидрофолатредуктазе (ДГФР) или глутаминсинтетазе (ГС), вместе с векторами экспрессии, содержащими гены, кодирующие такие селективные маркерные ферменты и агенты, например, метотрексат (МТК), который ингибирует ДГФР, и метионин сульфоксамин (МСА), который ингибирует ГС.

Одна из известных систем отбора, которую обычно используют в предшествующем уровне техники, представляет систему отбора дигидрофолатредуктазы/МТК. Дигидрофолатредуктаза (ДГФР) катализирует НАДФ - зависимое восстановление дигидрофолиевой кислоты до тетрагидрофолиевой кислоты (ТГФ). Затем ТГФ внутренне конвертирует в 10-формил-ДГФ и 5,10-метилен-ДГФ, которые используются в биосинтезе de novo пуринов и тимидилата, соответственно. ДГФ представляет побочный продукт каталитического действия тимидилатсинтазы (ТС), которая катализирует конверсию дезоксиуридинмонофосфата (дУМФ) в дезокситимидин монофосфат (дТМФ) в ходе 5,10-метилен-ТГФ-зависимой реакции. Таким образом, ДГФР принципиально важен для рециклирования кофакторов ТГФ, существенных для биосинтеза пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, которые необходимы для репликации ДНК. Таким образом, клетки (например, клетки СНО), которые утратили ген ДГФР (т.е. за счет направленной делеции в геноме), могут применяться в качестве реципиентов для трансфекции гена ДГФР в среде, не содержащей нуклеотидов. После трансфекции клетки могут подвергаться воздействию постепенно повышающихся концентраций антифолата МТК, наиболее сильного ингибитора ДГФР (Kd=1 пМ), тем самым заставляя клетки вырабатывать повышенные уровни ДГФР. После многочисленных кругов отбора селективный маркер ДГФР часто подвергается существенной амплификации. Кроме того, более чувствительные мутантные формы соответствующих селективных маркеров могут применяться вместе с клетками-хозяевами дикого типа. В другом варианте мутантный мышиный фермент ДГФР с большей устойчивостью, т.е. менее чувствительный к МТК, или другие мутантные формы ДГФР также активно использовались в качестве доминантного селективного маркера, который заметно повышает приобретенный высокий уровень устойчивости к МТК в трансфецированных клетках. Однако главный недостаток системы отбора ДГФР/МТК, используемой в предшествующем уровне техники, заключается в том, что такой метод использует мутагенный цитотоксический агент, МТК, который может в особенно высоких концентрациях изменить генотип реципиентных клеток. Это часто приводит к популяциям МТК-устойчивых клеток, у которых пет экспрессии целевого гена-мишени из-за утраты функциональных мутаций, например, в восстановленном переносчике фолата (ВПФ)/или утраты экспрессии гена ВПФ, причем в обоих случаях упраздняется потребление МТК. Однако необходимы повышенные/высокие концентрации МТК для достижения достаточно строгих условий отбора для выделения клеток-хозяев, вырабатывающих целевой продукт на достаточно высоком уровне.

Становится очевидным, что система отбора высокой точности имеет принципиальное значение для обогащения высокопродуцирующих клеток из популяции трансфецированных клеток. Чем выше точность системы отбора, тем ниже число низкоактивных продуцентов после процесса отбора и выше вероятность обнаружения очень редких чрезвычайно продуктивных клонов в трансфецированной популяции клеток.

Таким образом, задача, решаемая в настоящем изобретении, заключалась в разработке системы строгого отбора клеток-хозяев, вырабатывающих целевой продукт на высоком уровне, а также способов получения целевого продукта на достаточно высоком уровне. В частности, настоящее изобретение предусматривает систему строгого отбора, которая требует меньших количеств токсических агентов, в частности МТК. Кроме того, задача, решаемая в настоящем изобретении, заключалась в разработке способа получения целевого продукта на высоком уровне продуктивности.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к системе отбора для отбора клеток-хозяев, экспрессирующих на высоком уровне целевой продукт, и к получению соответствующих продуктов, в частности, полипептидов, например, антител.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу отбора по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей целевой продукт, который включает по меньшей мере следующие стадии:

(а) получения множества эукариотических клеток-хозяев, жизнеспособность которых зависит от потребления фолата, причем указанные эукариотические клетки-хозяева включают по меньшей мере

(i) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, и

(ii) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий фермент ДГФР,

(б) культивирования указанного множества эукариотических клеток-хозяев в селективной культуральной среде, включающей по меньшей мере ингибитор ДГФР и фолат в предельно допустимой концентрации, и

(в) отбора по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей целевой продукт.

Настоящее изобретение также относится к способу получения целевого продукта, включающему культивирование клетки-хозяина, выбранной согласно настоящему изобретению, в таких условиях, которые допускают экспрессию целевого продукта.

В настоящем изобретении также предусмотрена селективная культуральная среда, включающая по меньшей мере ингибитор ДГФР и фолат в предельно допустимой концентрации, которая может применяться в способе отбора по настоящему изобретению. Понятие «селективная культуральная среда» означает среду для культивирования клеток, применимую для отбора клеток-хозяев.

Другие объекты, свойства, преимущества и признаки настоящего описания могут стать ясны специалистам в данной области из последующего описания и прилагаемой формулы изобретения. Однако следует учитывать, что последующее описание, прилагаемая формула изобретения и конкретные примеры, хотя и указывают на предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, приводятся только в качестве иллюстрации. Различные изменения и модификации в рамках охвата настоящего изобретения и в духе настоящего изобретения станут легко понятны специалистам в данной области после ознакомления с последующим описанием.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к системе отбора, в которой используют ДГФР в качестве селективного маркера, которая нуждается в пониженной концентрации токсических агентов, например, антифолата МТК, но по-прежнему обеспечивает строгие селективные условия, достаточные для выявления высокопродуктивных клеток-хозяев.

Один из объектов настоящего изобретения представляет способ отбора по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей целевой продукт, включающий по меньшей мере следующие стадии:

(а) получения множества эукариотических клеток-хозяев, жизнеспособность которых зависит от потребления фолата, причем указанные эукариотические клетки-хозяева включают по меньшей мере

(i) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, и

(ii) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий фермент ДГФР,

(б) культивирования указанного множества эукариотических клеток-хозяев в селективной культуральной среде, включающей по меньшей мере ингибитор ДГФР и фолат в предельно допустимой концентрации,

(в) отбор по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей целевой продукт.

Понятие «полинуклеотид» означает полимер из нуклеотидов, которые обычно связаны друг с другом через дезоксирибозу или рибозу, и является ДНК или РНК в зависимости от контекста. Понятие «полинуклеотид» не подразумевает каких-либо ограничений по размеру, а также охватывает полинуклеотиды, включающие модификации, в частности модифицированные нуклеотиды.

Понятие «целевой продукт» означает продукт, экспрессируемый в указанной клетке-хозяине. Целевой продукт может быть, например, полипептидом или полинуклеотидом, например, РНК. Предпочтительно целевой продукт является полипептидом, в частности молекулой иммуноглобулина. Другие примеры целевых продуктов подробно описаны ниже.

Понятие «интродуцированный полинуклеотид» означает последовательность полинуклеотида, интродуцированную в клетку-хозяина, например, с помощью методов рекомбинации, например, трансфекции. Клетка-хозяин может включать или не включать эндогенный полинуклеотид, который соответственно является идентичным интродуцированному полинуклеотиду. Интродукция может быть достигнута, например, трансфекцией соответствующего вектора, который может интегрировать в геном клетки-хозяина (стабильная трансфекция). Соответствующие векторы экспрессии, допускающие интродукцию полинуклеотидов в клетку-хозяина, подробно описаны выше. В случае неинсертированной в геном гетерологичной нуклеиновой кислоты гетерологичная нуклеиновая кислота может быть утрачена на более поздней стадии, например, если клетка претерпевает митоз (временная трансфекция). Соответствующие векторы также могут поддерживаться в клетке-хозяине без интеграции в геном, например, путем эписомальной репликации. Однако в предшествующем уровне техники также известны другие методы интродукции полинуклеотида в клетку-хозяина, которые подробно описаны ниже.

Понятие «ингибитор ДГФР» означает соединение, которое ингибирует действие дигидрофолатредуктазы (ДГФР). Соответствующий ингибитор может, например, конкурировать с субстратом ДГФР за связывание с ДГФР. Соответствующие ингибиторы ДГФР являются, например, антифолатами, например, метотрексатом (МТК). К другим примерам относятся, но ими не ограничиваются, триметрексат глюкуронат (нейтрексин), триметоприм, пириметамин и пеметрексед.

Понятие «отбор» или «селекция» в контексте настоящего изобретения, в частности, относится к способу применения селективного отбора и селективных культуральных условий для отбора и соответственно получения клеток-хозяев, которые содержат инкорпорированный вектор или комбинацию векторов по настоящему изобретению. Таким образом, успешно трансфецированные клетки-хозяева могут быть выделены из популяции трансфецированных клеток-хозяев и/или обогащены в такой популяции.

Клетки-хозяева, в которые не был включен вектор или комбинация векторов по настоящему изобретению, предпочтительно погибают или отстают в росте в селективных культуральных условиях по сравнению с клетками-хозяевами, в которые были успешно инкорпорированы вектор или комбинация векторов по настоящему изобретению. Во время отбора клетки-хозяева, в которые были успешно инкорпорированы вектор или комбинация векторов по настоящему изобретению, могут быть обогащены в качестве совокупности трансфецированных клеток-хозяев из популяции трансфецированных клеток-хозяев. Отдельные клетки-хозяева также могут быть выделены из популяции трансфецированных клеток-хозяев во время отбора (например, селекции клонов). Соответствующие варианты осуществления методов отбора для получения успешно трансфецированных клеток-хозяев (например, сортировка методом FACS или методом серийных разведений) известны в предшествующем уровне техники и соответственно не требуют подробного описания.

Понятие «предельно допустимая концентрация фолата» относится к концентрации фолатов в селективной культуральной среде, которая обеспечивает селективное давление на клетку-хозяина. Соответственно фолаты не включают в селективную культуральную среду в избытке, тем самым обеспечивая селективное давление на клетки-хозяева. Фолат, включенный в селективную культуральную среду в предельно допустимой концентрации, может потребляться и процессироваться клеткой-хозяином. Фолаты и, в частности, производные фолата, которые не могут процессироваться клеткой-хозяином, не могут участвовать в селективном давлении и, соответственно, не влияют на предельно допустимую концентрацию. Соответствующие диапазоны концентраций описаны ниже.

Понятие «полипептид» относится к молекуле, представляющей полимер из аминокислот, связанных друг с другом пептидной связью (связями). К полипептидам относятся полипептиды какой-либо длины, в том числе белки (например, содержащие более 50 аминокислот) и пептиды (например, содержащие более 2-49 аминокислот). К полипептидам относятся белки и/или пептиды какого-либо действия или биологической активности. Соответствующие примеры приведены ниже.

Неожиданно было обнаружено, что система отбора для получения рекомбинантных эукариотических клеток, способных вырабатывать целевой продукт, может быть основана на ограниченной доступности фолатов в селективной культуральной среде вместе с применением ДГФР в качестве селективного маркера. Система имеет широкое применение, т.е. она применима к эукариотическим клеткам-хозяевам, жизнеспособность которых зависит от потребления фолата. Выше было описано, что в предшествующем уровне техники были вынуждены использовать довольно высокие концентрации антифолата/МТК для того, чтобы достичь достаточно высокого давления на амплификацию гена и соответственно для достижения повышения продуктивности целевого продукта. Это является недостатком, поскольку антифолаты, например, МТК, токсичны и могут генетически изменить клетку-хозяина. Подход по настоящему изобретению, основанный на комбинированном применении селективного маркера ДГФР при предельно допустимой концентрации фолатов в селективной культуральной среде, обладает преимуществом, поскольку точность отбора существенно повышена даже при низких концентрациях ингибитора ДГФР. Таким образом, при использовании системы отбора по настоящему изобретению получают высокоэффективные продуценты даже при низких концентрациях ингибитора ДГФР (например, МТК) в селективной культуральной среде. Таким образом, требуются низкие концентрации ингибитора ДГФР и соответственно низкие концентрации токсического агента при использовании подходов, изложенных в настоящем изобретении, по сравнению с подходами в предшествующем уровне техники для обеспечения строгих условий отбора, которые позволяют идентифицировать клоны высокопродуктивных клеток. Из-за уникальной конструкции обеспечивается очень строгая система отбора, позволяющая обогащать высокопродуктивные клетки из популяции трансфецированных клеток-хозяев. Такая высокая строгость системы отбора по настоящему изобретению снижает число низко активных продуцентов в популяции после отбора в популяции и повышает вероятность обнаружения очень редких чрезвычайно высокопродуктивных клонов.

Селективная культуральная среда может включать один или несколько типов фолата. Фолат по настоящему изобретению может, например, быть окисленным фолатом (т.е. фолиевой кислотой), или восстановленным фолатом, или их производным. В общем фолат может применяться в настоящем применении до тех пор, пока такой фолат может быть в состоянии поступать в эукариотические клетку, предпочтительно с помощью функционального связанного с мембраной рецептора фолата. Окисленный фолат, т.е. фолиевая кислота, а также восстановленные производные фолиевой кислоты, называемые восстановленными фолатами или тетрагидрофолатами (ТГФ), представляют группу витаминов В-9, которые являются важными кофакторами и/или коферментами биосинтеза пуринов, тимидилата и определенных аминокислот в эукариотических клетках, в частности в клетках млекопитающих. Кофакторы ТГФ являются особенно принципиальными для репликации ДНК и соответственно клеточной пролиферации. Конкретно кофакторы ТГФ функционируют в качестве доноров одноуглеродных блоков в сериях взаимосвязанных метаболических путей, вовлеченных de novo в биосинтез пуринов и тимидилата, аминокислот, а также в метаболизм метильной группы, включая метилирование островков CpG в ДНК. Конкретно кофакторы ТГФ, включающие 10-формил-ТГФ (10-СНО-ТГФ), включают одноуглеродные блоки в две ключевые de novo реакции формилтрансферазы, вовлеченные de novo в биосинтез пуринов. Предпочтительным примером окисленного фолата является фолиевая кислота. Предпочтительными примерами восстановленных фолатов являются 5-метил-тетрагидрофолиевая кислота, 5-формил-тетрагидрофолиевая кислота, 10-формил-тетрагидрофолиевая кислота и 5,10-метилен-тетрагидрофолиевая кислота.

Концентрация фолата в селективной среде зависит, в частности, от применяемых эукариотических клеток-хозяев. Применимой является концентрация фолата 500 нМ или менее, 250 нМ или менее, 150 нМ или менее, 100 нМ или менее, 75 нМ или менее, 50 нМ или менее, 25 нМ или менее, 15 нМ или менее или даже 10 нМ или менее, например, 7,5 нМ или менее. К соответствующим диапазонам относятся 0,1-500 нМ, 0,1-250 нМ, 5 или 10-250 нМ, предпочтительно 1-150 нМ, 5 или 10-150 нМ, 1-100 нМ, 5 или 10-100 нМ и более предпочтительны 1-50 нМ, 2,5-50 нМ, 10-50 нМ или 12,5-50 нМ. Такие концентрации особенно применимы при использовании в качестве фолата фолиевой кислоты.

Соответствующие концентрации являются предельно допустимыми концентрациями с точки зрения настоящего изобретения и таким образом применимы для обеспечения селективного давления на клетки-хозяева. Снижение концентрации обеспечивает селективное давление до тех пор, пока клетки остаются жизнеспособными. Описанные диапазоны концентраций особенно применимы для использования клеток СНО в качестве клеток-хозяев.

Концентрация ингибитора ДГФР, используемая в селективной культуралыюй среде, также зависит от применяемой эукариотической клетки-хозяина. Концентрация ингибитора ДГФР 500 нМ или менее, 400 нМ или менее, 300 нМ или менее, 250 нМ или менее, 200 нМ или менее, 150 нМ или менее полезна в том случае, если поддерживающая концентрация ингибитора ДГФР в селективной среде понижена. Однако предпочтительно селективная среда включает по меньшей мере 10 нМ ингибитора ДГФР. Предпочтительные концентрации антифолата, предпочтительно МТК, составляют 1-500 нМ, предпочтительно 10-200 нМ, 10-150 нМ и более предпочтительно 10-100 нМ. Соответствующие концентрации в селективной культуральной среде особенно применимы для клеток СНО.

Предпочтительные концентрации и диапазоны концентраций фолата и антифолата, описанные выше, могут комбинироваться друг с другом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения применяют селективную культуральную среду, которая включает ингибитор ДГФР, предпочтительно МТК, в концентрации 200 нМ или менее, предпочтительно 150 нМ или менее, предпочтительно 100 нМ или менее, и фолат, предпочтительно фолиевую кислоту, в концентрации менее 100 нМ, предпочтительно менее 75 нМ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фолат в концентрации 12,5-50 нМ применяют в концентрации с антифолатом в концентрации 10-100 нМ. Предпочтительно в качестве фолата и антифолата применяют фолиевую кислоту и МТК.

Допустимые концентрации фолиевой кислоты и МТК могут зависеть друг от друга; предпочтительная комбинация состоит из фолиевой кислоты в концентрации 2,5-75 нМ, 2,5-50 нМ или 12,5-50 нМ в сочетании с МТК в концентрации 10-500 нМ, предпочтительно 10-100 нМ. Такие концентрации особенно предпочтительны при применении клеток ДГФР+(плюс).

Описанные выше концентрации особенно применимы для суспензии линий быстро растущих клеток, которые обладают предпочтительным фенотипом для коммерческого получения линий клеток. Однако разные линии клеток могут обладать разными потребностями в потреблении фолиевой кислоты. Кроме того, предельные/селективные концентрации могут варьировать в зависимости от применяемого фолата, соответственно антифолата. Таким образом, предельно допустимые концентрации фолата, особенно фолиевой кислоты, и антифолата, особенно МТК, а также соответствующие соотношения фолиевой кислоты к МТК, могут быть разными для разных линий клеток. Однако соответствующие концентрации могут быть легко экспериментально определены специалистом.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетки-хозяева предварительно культивируют в культуральной среде без фолата или в культуральной среде, включающей предельно допустимую концентрацию фолата перед трансфекцией и/или отбором. Соответствующие предельно допустимые концентрации фолата описаны выше. Предпочтительно указанная культуральная среда для предварительного культивирования клеток-хозяев включает фолаты, в частности фолиевую кислоту, в концентрации 50 нМ или менее.

Экспрессия инкорпорированного селективного маркера ДГФР обеспечивает селективное преимущество при селективных культуральных условиях клеткам-хозяевам. Например, клетки-хозяева (например, клетки СНО), утратившие ген ДГФР (например, путем нацеленной геномной делеции, также называемые клетками-хозяевами ДГФР^-), могут применяться в качестве реципиентов для трансфекции гена ДГФР в качестве гена селективного маркера в среде, не содержащей нуклеотидов. Однако также возможно применение клеток-хозяев, которые экспрессируют эндогенно ДГФР (клетки-хозяева ДГФР⁺ (плюс)) при проведении отбора ДГФР, если применяют соответствующие селективные культуральные условия. После трансфекции полинуклеотидами по настоящему изобретению клетки могут быть подвергнуты воздействию постепенно повышающихся концентраций ингибиторов ДГФР. Одним из примеров ингибиторов ДГФР являются антифолаты, например МТК, который представляет мощный ингибитор ДГФР (Kd=1 пМ). Содержание в среде антифолата, например, МТК, заставляет клетки вырабатывать повышенные уровни ДГФР для выживания. При многих кругах отбора селективный маркер ДГФР часто претерпевает существенную генную амплификацию для достижения этого.

Из предшествующего уровня техники известно несколько соответствующих генов ДГФР, которые могут применяться вместе с настоящим изобретением. ДГФР может быть ферментом ДГФР дикого типа или его функциональным вариантом или производным. К понятию «вариант» или «производное» относятся ферменты ДГФР, имеющие один или несколько изменений в аминокислотных последовательностях (например, делеций, замещений или добавлений), касающихся аминокислотной последовательности соответствующего фермента ДГФР, гибридные белки, включающие фермент ДГФР или его функциональный фрагмент, и ферменты ДГФР, которые были модифицированы для обеспечения дополнительной структуры и/или функции, а также функциональные фрагменты указанных соединений, которые по-прежнему обладают по меньшей мере одной функцией фермента ДГФР. Могут применяться ферменты/варианты ДГФР в качестве селективного маркера, которые более или менее чувствительны к МТК по сравнению с ферментом ДГФР дикого типа. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения используемый фермент ДГФР более чувствителен к антифолатам, например, МТК, чем соответствующий фермент дикого типа ДГФР и/или фермент ДГФР, эндогенно экспрессированный клеткой-хозяином в случае, если экспрессия происходит. Фермент ДГФР может быть получен от какого-либо вида до тех пор, пока он будет функциональным в рамках настоящего изобретения, т.е. совместимым с используемой клеткой-хозяином. Например, мутантный ДГФР мыши с существенной устойчивостью к МТК широко применялся в качестве доминантного селективного маркера, который явно повышает приобретение высокого уровня МТК-резистентности в клетках-трансфектантах. Предпочтительно используют фермент ДГФР, который менее восприимчив и, таким образом, менее чувствителен к ингибитору ДГФР, например, МТК, чем фермент ДГФР, эндогенно экспрессируемый в клетке-хозяине ДГФР (плюс).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения интрон или его фрагмент помещен с 3'-конца открытой рамки считывания гена ДГФР. Это оказывает благоприятное воздействие на степень экспрессии/амплификации конструкции. Интрон, используемый в кассетах экспрессии ДГФР, приводит к меньшему нефункциональному варианту гена ДГФР (Grillari и др., J. Biotechnol. 87, 2001, сс.59-65). В результате уровень экспрессии гена ДГФР снижается и может таким образом дополнительно повысить точность системы отбора. Соответственно клетка-хозяин может включать интродуцированный полинуклеотид, кодирующий фермент ДГФР, который включает интрон, локализованный с 3'-конца кодирующей последовательности ДГФР. Другие методы, применяющие интрон для снижения уровня экспрессии гена ДГФР, описаны в EP 0724639 и также могут применяться.

В отличие от большинства прокариот, растений и грибов, которые синтезируют свои собственные фолаты, млекопитающие и другие виды эукариот не имеют биосинтеза кофактора ТГФ и, следовательно, должны получать их из экзогенных источников, обычно из культуральной среды. В настоящее время известны три независимые транспортные системы для опосредования потребления фолатов и антифолатов клетками млекопитающих, а именно восстановленный переносчик фолата (ВПФ); протонсопряженный переносчик фолата (ПСПФ, также обозначаемый SLC46A) и рецепторы фолата (РФ).

Эукариотическую клетку-хозяина предпочтительно выбирают из группы, состоящей из клеток млекопитающего, насекомых, растений и грибов. Клетки грибов и растительные клетки могут быть прототрофами по фалату (т.е. такие клетки могут автономно синтезировать собственные фолаты, необходимые для выживаемости клеток, т.е. для роста и пролиферации клеток). Настоящее изобретение особенно предусматривает такие грибные и растительные клетки, которые являются ауксотрофами по фолатам или могут стать таковыми. Они могут сформироваться, например, в результате генетических манипуляций, т.е. над теми клетками, которые в настоящее время не могут синтезировать достаточных количеств фолатов, требуемых для жизнеспособности клеток. Например, способность таких грибных или растительных клеток эндогенно синтезировать фолаты, например, по соответствующему метаболическому пути, может быть инактивирована, например, за счет разрушения гена или генного сайленсинга соответствующих генов-мишеней или подавления ключевых ферментов и др. Предпочтительно клетки-хозяева являются клетками млекопитающих. Указанные клетки млекопитающих могут быть выбраны из группы, включающей клетки грызунов, клетки человека и клетки обезьян. Особенно предпочтительны клетки грызунов, предпочтительно выбранные из группы, состоящей из клеток СНО, клеток ВНК, клеток NSO, фибробластов мыши ЗТЗ и клеток SP2/0. Наиболее предпочтительными клетками грызунов являются клетки СНО. Также предпочтительны клетки человека, которые предпочтительно выбраны из группы, состоящей из клеток НЕК293, клеток MCF-7, клеток PerС6 и клеток HeLa. Также предпочтительны клетки обезьян, которые предпочтительно выбраны из группы, состоящей из клеток COS-1, COS-7 и клеток Vero. Клеткой-хозяином предпочтительно является клетка ДГФР (плюс), особенно клетка ДГФР⁺(плюс) СНО.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, и полинуклеотид, кодирующий фермент ДГФР, интодуцированы с помощью по меньшей мере одного вектора экспрессии. Соответствующие методы интродукции соответствующего вектора экспрессии описаны ниже и включают, например, трансфекцию.

Понятие «вектор экспрессии» по настоящему изобретению относится к полинуклеотиду, способному нести по меньшей мере один фрагмент чужеродной нуклеиновой кислоты. Вектор функционирует в качестве молекулярного носителя, доставляющего фрагменты соответствующих полинуклеотидов нуклеиновых кислот в клетку-хозяина. Он включает по меньшей мере одну кассету экспрессии, включающую регуляторные последовательности для надлежащей экспрессии инкорпорированного в него полинуклеотида. Полинуклеотиды (например, кодирующие целевой продукт или селективные маркеры) могут быть инсертированы в кассету (кассеты) экспрессии вектора экспрессии для экспрессии с него. Вектор экспрессии по настоящему изобретению может быть в кольцевой или линеаризованной форме. Понятие «вектор экспрессии» также включает искусственные хромосомы или близкие соответствующие полинуклеотиды, допускающие перенос фрагментов чужеродной нуклеиновой кислоты.

Полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, и полинуклеотид, кодирующий фермент ДГФР, может быть локализован на одном и том же или на разных векторах экспрессии. Применение вектора экспрессии, несущего оба полинуклеотида, обладает преимуществом, заключающимся в том, что только один вектор экспрессии требуется интродуцировать в клетку-хозяина. Кроме того, в особенности при создании линии со стабильной экспрессией, более вероятно, что полинуклеотиды интегрированы в геном вместе и, соответственно, экспрессируются с близким выходом. Однако также возможно в рамках охвата настоящего изобретения применение комбинации по меньшей мере двух векторов экспрессии для трансфекции, причем соответствующие полинуклеотиды локализованы в разных векторах экспрессии. Указанную комбинацию векторов экспрессии затем трансфецируют в клетку-хозяина.

Эукариотическая клетка-хозяин может включать по меньшей мере один дополнительный интродуцированный полинуклеотид, кодирующий другой целевой продукт. Такой вариант осуществления настоящего изобретения особенно применим для экспрессии молекул иммуноглобулина. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин включает по меньшей мере два интродуцированных полинуклеотида, каждый из которых кодирует целевой продукт, причем по меньшей мере один полинуклеотид кодирует тяжелую цепь молекулы иммуноглобулина или ее функциональный фрагмент, а другой полинуклеотид кодирует легкую цепь молекулы иммуноглобулина или ее функциональный фрагмент. Соответствующие полинуклеотиды могут быть интродуцированы с помощью соответствующего вектора экспрессии. Указанные полипуклеотиды, кодирующие тяжелую и легкую цепи молекулы иммуноглобулина (или ее функциональный фрагмент), могут быть локализованы на одном и том же или на разных векторах экспрессии при использовании комбинации по меньшей мере двух векторов экспрессии.

Клетка-хозяин и соответственно вектор экспрессии для интродукции полинуклеотидов в указанную клетку-хозяина могут дополнительно включать один или несколько дополнительных полинуклеотидов, кодирующих один или несколько дополнительных селективных маркеров. Соответственно в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения совместный отбор, в котором применяют систему по настоящему изобретению вместе с одной или несколькими другими системами отбора (например, системами отбора по устойчивости к антибиотикам, например, neo/G418), может применяться для дополнительного улучшения процесса. Помимо других дополнительных селективных эукариотических маркеров, допускающих отбор эукариотических клеток-маркеров, также могут применяться прокариотические селективные маркеры, которые допускают отбор в эукариотических клетках-хозяевах. Примерами соответствующих прокариотических селективных маркеров являются маркеры, которые обеспечивают устойчивость к антибиотикам, например, к ампициллину, канамицину, тетрациклину и/или хлорамфениколу.

Векторы, применяемые для интродукции полинуклеотидов в клетки-хозяева, обычно содержат элементы контроля транскрипции, применимые для стимуляции транскрипции, например, промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, сигналы временной остановки или терминации транскрипции в качестве элемента кассеты экспрессии. Если требуемым продуктом является белок, соответствующие элементы контроля трансляции предпочтительно включены в вектор и оперативно связаны с полинуклеотидами, подвергаемыми экспрессии, например, 5'-нетранслируемые области,