Комбинации менингококкового фактор н-связывающего белка и пневмококковых сахаридных конъюгатов

Комбинации менингококкового фактор н-связывающего белка и пневмококковых сахаридных конъюгатов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

2420-180441RU/011

Для данной заявки испрашивается приоритет в соответствии с предварительными патентными заявками США 61/163005 (поданной 24-го марта 2009 г.) и 61/270407 (поданной 7-го июля 2009 г.), полное содержание обеих из которых включено в данный документ посредством ссылок.

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к области комбинированных вакцин, в частности тех, которые содержат как конъюгированный пневмококковый капсульный сахарид, так и менингококковый антиген fHBP.

Уровень техники

Neisseria meningitidis (менингококк) представляет собой грамм-отрицательную сферическую бактерию. Современные менингококковые вакцины также основаны на капсульных сахаридах. Сюда относятся моновалентные конъюгированные вакцины против серогруппы C (MENJUGATE™, MENINGITEC™ и NEISVAC-C™) и 4-валентные смеси конъюгатов для серогрупп A, C, W135 и Y (MENACTRA™). На сегодняшний день не существует полезной вакцины, разрешенной для массового использования против серогруппы B («MenB»). В настоящее время усилия по созданию вакцины против MenB сфокусированы на использовании везикул внешней мембраны (например MENZB™, HEXAMEN™, NONAMEN™) или очищенных компонентов из внешней мембраны, таких как липоолигосахариды и белки внешней мембраны.

Streptococcus pneumoniae (пневмококк) представляет собой грамм-положительную сферическую бактерию. Современные пневмококковые вакцины основаны на капсульных сахаридах. Одобренными педиатрическими вакцинами являются: (a) PREVNAR™, представляющая собой 7-валентную смесь конъюгированных сахаридов из серотипов 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F и 23F, (b) SYNFLORIX™, 10-валентная смесь конъюгатов, которая также покрывает серотипы 1, 5 и 7F, а также (c) PREVNAR 13™, 13-валентная смесь конъюгатов, которая также покрывает серотипы 3, 6A и 19A. Известны также другие 9-валентные, 10-валентные, 11-валентные и 13-валентные комбинации конъюгатов. Те же 7 серотипов, соответствующих PREVNAR™, также были конъюгированы с везикулярным комплексом внешней мембраны («OMPC») из штамма серогруппы B менингококка [1].

В ссылке 2 раскрыта композиция для иммунизации против как пневмококка, так и MenB, полученная путем сочетания 13-валентной пневмококковой конъюгированной вакцины («13vPnC», Wyeth) с 9-валентной вакциной против везикул внешней мембраны MenB (NONAMEN™, NVI). Аналогичный комбинированный продукт обсуждается в ссылке 3.

Сохраняется потребность в дополнительных и усовершенствованных комбинированных вакцинах для защиты как от менингококка серогруппы B, так и от пневмококка.

Раскрытие изобретения

В отличие от композиций, раскрытых в ссылке 2, в которых использовали комбинацию из трех различных сконструированных везикул внешней мембраны, в основе антигена серогруппы B менингококка в композициях по настоящему изобретению лежит небольшое количество очищенных антигенов. Цель состоит в том, чтобы избежать присутствия в композиции сложных или неопределенных смесей антигенов MenB (например везикул внешней мембраны, использованных в ссылках 1 и 2). В частности, композиции по изобретению содержат очищенный менингококковый фактор H-связующий белковый антиген (fHBP). Установлено, что добавление пневмококковых конъюгатов к fHBP может усиливать антименингококковый ответ, а добавление fHBP к пневмококковым конъюгатам может усиливать анти-пневмококковый ответ.

Таким образом, изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей: (i) конъюгированный пневмококковый капсульный сахарид; и (ii) менингококковый фактор H-связующий белковый антиген (fHBP). Композиция предпочтительно не содержит везикулы внешней мембраны менингококка (включая как природные мембранные везикулы, образующиеся спонтанно в процессе роста бактерий и высвобождающиеся в культуральную среду, так и искусственные везикулы внешней мембраны, образующиеся, например в результате обработки менингококка детергентом или ультразвуком).

Предпочтительная композиция содержит: (i) алюминиево-фосфатный адъювант; (ii) конъюгированный пневмококковый капсульный сахарид от каждого из по меньшей мере серотипов 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F и 23F пневмококка, при этом каждый из указанных сахаридов конъюгирован с белком-носителем CRM197; и (iii) по меньшей мере два различных менингококковых фактор H-связующих белковых антигена, каждый из которых, по меньшей мере частично, адсорбирован на фосфате алюминия. Конъюгированный пневмококковый сахарид также может быть адсорбирован на фосфате алюминия. Композиция может содержать хлорид натрия и/или буфер.

Изобретение также относится к способу получения иммуногенной композиции по изобретению, включающему этапы: (i) смешивания по меньшей мере одного конъюгированного пневмококкового капсульного сахарида с алюминиево-фосфатным адъювантом с образованием смеси конъюгат/адъювант; и (ii) смешивания смеси конъюгат/адъювант с по меньшей мере одним менингококковым фактор H-связующим белком.

Изобретение также относится к способу получения иммуногенной композиции по изобретению, включающему этапы: (i) смешивания по меньшей мере одного конъюгированного пневмококкового капсульного сахарида с по меньшей мере одним менингококковым фактор H-связующим белком с образованием смеси антигенов; и (ii) смешивания смеси антигенов с алюминиево-фосфатным адъювантом.

Изобретение также относится к способу получения иммуногенной композиции по изобретению, включающему этапы: (i) смешивания по меньшей мере одного менингококкового фактор H-связующего белка с алюминиево-фосфатным адъювантом с образованием смеси белок/адъювант; и (ii) смешивания смеси белок/адъювант с по меньшей мере одним конъюгированным пневмококковым капсульным сахаридом.

В менее предпочтительном варианте осуществления изобретение также относится к способу получения иммуногенной композиции по изобретению, включающему этапы: (i) смешивания по меньшей мере одного менингококкового фактор H-связующего белка с алюминиево-фосфатным адъювантом с образованием смеси белок/адъювант; (ii) смешивания по меньшей мере одного конъюгированного пневмококкового капсульного сахарида с алюминиево-фосфатным адъювантом с образованием смеси конъюгат/адъювант; и (iii) смешивания смеси белок/адъювант и смеси конъюгат/адъювант.

Предпочтительно, способ по изобретению не включает этап смешивания алюминиево-гидроксидного адъюванта с любым из (i) менингококкового фактор H-связующего белка, (ii) алюминиево-фосфатного адъюванта, (iii) конъюгированного пневмококкового капсульного сахарида, (iv) смеси конъюгат/адъювант, (v) смеси антигенов или (vi) смеси белок/адъювант. Таким образом, гидроксид алюминия не добавляют в качестве компонента к иммуногенной композиции.

Конъюгированный пневмококковый капсульный сахарид(ы)

Композиции по изобретению содержат по меньшей мере один пневмококковый капсульный сахарид. Капсульный сахарид конъюгирован с белком-носителем.

Изобретение может включать капсульный сахарид из одного или нескольких различных серотипов пневмококка. Если композиция содержит сахаридные антигены из более чем одного серотипа, их предпочтительно получают отдельно, конъюгируют отдельно, а затем объединяют. Методы очистки пневмококковых капсульных сахаридов известны в данной области (см., например ссылку 4), и вакцины на основе очищенных сахаридов из 23 различных серотипов были известны на протяжении многих лет. Усовершенствования для этих методов также были описаны, например для серотипа 3 описаны в ссылке 5, или для серотипов 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F и 19A описаны в ссылке 6.

Пневмококковый капсульный сахарид(ы), как правило, выбирают из следующих серотипов: 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F и/или 33F. Таким образом, в целом, композиция может содержать капсульный сахарид из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или большего количества различных серотипов. Полезными являются композиции, содержащие по меньшей мере сахарид серотипа 6B.

Полезной комбинацией серотипов является 7-валентная комбинация, например включающая капсульный сахарид из каждого из серотипов 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F и 23F. Другой полезной комбинацией является 9-валентная комбинация, например включающая капсульный сахарид из каждого из серотипов 1, 4, 5, 6B, 9V, 14, 18C, 19F и 23F. Другой полезной комбинацией является 10-валентная комбинация, например включающая капсульный сахарид из каждого из серотипов 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F и 23F. 11-валентная комбинация может дополнительно включать сахарид из серотипа 3. В 12-валентной комбинации могут быть добавлены к 10-валентной смеси: серотипы 6A и 19A; 6A и 22F; 19A и 22F; 6A и 15B; 19A и 15B; или 22F и 15B. В 13-валентной комбинации могут быть добавлены к 11-валентной смеси: серотипы 19A и 22F; 8 и 12F; 8 и 15B; 8 и 19A; 8 и 22F; 12F и 15B; 12F и 19A; 12F и 22F; 15B и 19A; 15B и 22F; 6A и 19A, и так далее.

Таким образом, полезная 13-валентная комбинация включает капсульный сахарид из серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19 (или 19A), 19F и 23F, например полученный, как описано в ссылках 7-10. Одна из таких комбинаций включает сахарид серотипа 6B в концентрации примерно 8 мкг/мл и другие 12 сахаридов в концентрациях примерно 4 мкг/мл каждый. Другая такая комбинация включает сахариды серотипов 6A и 6B в концентрации примерно 8 мкг/мл каждый и другие 11 сахаридов - в концентрациях примерно 4 мкг/мл каждый. Подходящие белки-носители для конъюгатов включают бактериальные токсины, такие как дифтерийный или столбнячный токсин, либо анатоксины или их мутантные формы. Их обычно используют в конъюгированных вакцинах. Например полезна мутантная форма дифтерийного токсина CRM197 [11]. Другие подходящие белки-носители включают синтетические пептиды [12,13], белки теплового шока [14,15], белки коклюша [16,17], цитокины [18], лимфокины [18], гормоны [18], факторы роста [18], искусственные белки, включающие несколько человеческих CD4⁺ T-клеточных эпитопов из различных, полученных от патогенов антигенов [19], например N19 [20], белок D из H.influenzae [21-23], пневмолизин [24] или его нетоксичные производные [25], пневмококковый поверхностный белок PspA [26], белки системы поглощения железа [27], токсин A или B из C.difficile [28], рекомбинантный экзопротеин A Pseudomonas aeruginosa (rEPA) [29], и так далее. OMPC, использованный в ссылке 1, в данном документе исключен из списка возможных носителей для пневмококкового сахарида, поскольку он представляет собой везикул внешней мембраны менингококка.

Особенно полезными белками-носителями для пневмококковых конъюгированных вакцин являются CRM197, столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин и белок D H. influenzae. В PREVNAR™ используется CRM197. В 13-валентной смеси можно использовать CRM197 в качестве белка-носителя для каждого из 13 конъюгатов, и CRM197 может присутствовать в концентрации примерно 55-60 мкг/мл.

Если композиция содержит конъюгаты из более чем одного серотипа пневмококка, можно использовать один и тот же белок-носитель для каждого отдельного конъюгата, или использовать различные белки-носители. В обоих случаях, однако, смесь различных конъюгатов, как правило, получают, создавая конъюгат каждого серотипа отдельно, а затем смешивая их для получения смеси отдельных конъюгатов. В ссылке 30 описаны потенциальные преимущества при использовании различных белков-носителей в мультивалентных пневмококковых конъюгированных вакцинах, однако в продукте PREVNAR™ с успехом использован один и тот же носитель для каждого из семи различных серотипов.

Белок-носитель можно ковалентно конъюгировать с пневмококковым сахаридом напрямую или через линкер. Известны различные линкеры. Например присоединение может происходить через карбонил, который может быть образован в результате взаимодействия свободной гидроксильной группы модифицированного сахарида с GDI [31,32], с последующим взаимодействием с белком с образованием карбаматной связи. Можно использовать карбодиимидную конденсацию [33]. Можно использовать линкер адипиновой кислоты, который может быть образован путем соединения свободной -NH₂-группы (например введенной в сахарид аминированием) с адипиновой кислотой (с использованием, например диимидной активации), а затем присоединять белок к полученному промежуточному продукту сахарид-адипиновая кислота [34,35]. Другие линкеры включают β-пропионамидо [36], нитрофенилэтиламин [37], галоацильные галогениды [38], гликозидные связи [39], 6-аминокапроновую кислоту [40], N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) [41], дигидразид адипиновой кислоты ADH [42], C₄-C₁₂ фрагменты [43] и так далее.

Можно использовать конъюгацию с помощью восстановительного аминирования. Сахарид можно сначала окислять периодатом для введения альдегидной группы, которая затем может образовывать прямую ковалентную связь с белком-носителем путем восстановительного аминирования, например с ε-аминогруппой лизина. Если сахарид содержит несколько альдегидных групп в молекуле, тогда такой метод образования связей может приводить к получению перекрестно-сшитого продукта, в котором несколько альдегидов вступают в реакцию с несколькими аминами носителя. Такой метод перекрестно-сшивающей конъюгации особенно полезен для по меньшей мере серотипов 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F и 23F пневмококка.

Пневмококковый сахарид может представлять собой полноразмерный интактный сахарид, полученный из пневмококка, и/или может представлять собой фрагменты полноразмерных сахаридов, то есть сахариды могут быть короче, чем природные капсульные сахариды, встречающиеся у бактерий. Таким образом, сахариды могут быть деполимеризованы, при этом деполимеризация происходит во время или после очистки сахаридов, но до конъюгации. Деполимеризация уменьшает длину цепи сахаридов. Деполимеризацию можно использовать в целях обеспечения оптимальной длины цепи для иммуногенности и/или в целях уменьшения длины цепи для физической легкости обращения с сахаридами. Если используют более одного серотипа пневмококка, то можно использовать интактные сахариды для каждого серотипа, фрагменты для каждого серотипа, или использовать интактные сахариды для некоторых серотипов и фрагменты для других серотипов.

Если композиция содержит сахарид из любого из серотипов 4, 6B, 9V, 14, 19F и 23F, эти сахариды предпочтительно являются интактными. Напротив, если композиция содержит сахарид из серотипа 18C, этот сахарид предпочтительно является деполимеризованным.

Сахарид серотипа 3 также может быть деполимеризован. Например сахарид серотипа 3 можно подвергать кислотному гидролизу для деполимеризации [7], например с помощью уксусной кислоты. Полученные фрагменты можно окислять для активации (например периодатное окисление, возможно в присутствии двухвалентных катионов, например с MgCl₂), конъюгировать с носителем (например CRM197) в восстановительных условиях (например с использованием натрия цианоборгидрида), а затем (необязательно) любые непрореагировавшие альдегиды в сахариде можно блокировать (например с помощью боргидрида натрия) [7]. Конъюгацию можно выполнять на лиофилизированном материале, например после совместной лиофилизации активированного сахарида и носителя.

Сахарид серотипа 1 можно по меньшей мере частично де-O-ацетилировать, например путем обработки буфером со щелочным pH [8], например с использованием бикарбонатного/карбонатного буфера. Такие (частично) де-O-ацетилированные сахариды можно окислять для активации (например периодатное окисление), конъюгировать с носителем (например CRM197) в восстановительных условиях (например с использованием натрия цианоборгидрида), а затем (необязательно) любые непрореагировавшие альдегиды в сахариде можно блокировать (например с помощью боргидрида натрия) [8]. Конъюгацию можно выполнять на лиофилизированном материале, например после совместной лиофилизации активированного сахарида и носителя.

Сахарид серотипа 19A можно окислять для активации (например периодатное окисление), конъюгировать с носителем (например CRM197) в ДМСО в восстановительных условиях, а затем (необязательно) любые непрореагировавшие альдегиды в сахариде можно блокировать (например с помощью боргидрида натрия) [44]. Конъюгацию можно выполнять на лиофилизированном материале, например после совместной лиофилизации активированного сахарида и носителя.

Один или более конъюгатов пневмококковых капсульных сахаридов могут присутствовать в лиофилизированной форме.

В идеале, пневмококковые конъюгаты способны вызывать продукцию антикапсульных антител, которые связываются с соответствующим сахаридом, например вызывать продукцию антисахаридных антител на уровне ≥0,20 мкг/мл [45]. Антитела можно определять при помощи иммуноферментного анализа (ИФА) и/или измерения опсонофагоцитирующей активности (ОФА). Эффективность метода ИФА была многократно подтверждена, и показано, что существует связь между концентрацией антител и эффективностью вакцины.

Менингококковый фактор H-связующий белок(ки)

Композиции по изобретению содержат по меньшей мере один менингококковый фактор H-связующий белок (fHBP).

Антиген fHBP подробно охарактеризован. Его также называют белок «741» [SEQ ID NO:2535 и 2536 в ссылке 56], «NMB1870», «GNA1870» [ссылки 46-48], «P2086», «LP2086» или «ORF2086» [49-51]. Он представляет собой липопротеин и экспрессируется у всех серогрупп менингококка. Структура С-концевого иммунодоминантного домена («fHbpC») белка fHbp была определена методом ЯМР [52]. Эта часть белка образует β-цилиндр из восьми тяжей, которые связаны петлями различной длины. Цилиндру предшествует короткая α-спираль и гибкий N-концевой хвост.

Антиген fHBP включает три различных варианта [53], и установлено, что сыворотка, полученная против определенного семейства, является бактерицидной в отношении того же семейства, но не активной против штаммов, экспрессирующих один из остальных двух семейств, то есть существует внутрисемейственная перекрестная защита, но не межсемейственная перекрестная защита. Композиции по изобретению могут содержать один вариант fHBP, но предпочтительно содержат fHBP из двух или трех вариантов.

Если композиция содержит один вариант fHBP, она может содержать одно из следующего:

(a) первый полипептид, включающий первую аминокислотную последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность (i), имеющую по меньшей мере a% идентичности последовательности с SEQ ID NO:1 и/или (ii), состоящую из фрагмента из по меньшей мере x последовательных аминокислот из SEQ ID NO:1;

(b) второй полипептид, включающий вторую аминокислотную последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность (i), имеющую по меньшей мере b% идентичности последовательности с SEQ ID NO:2 и/или (ii), состоящую из фрагмента из по меньшей мере y последовательных аминокислот из SEQ ID NO:2;

(c) третий полипептид, включающий третью аминокислотную последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность (i), имеющую по меньшей мере c% идентичности последовательности с SEQ ID NO:3 и/или (ii), состоящую из фрагмента из по меньшей мере z последовательных аминокислот из SEQ ID NO:3.

Если композиция содержит два различных менингококковых антигена fHBP, она может содержать комбинацию: (i) первого и второго полипептидов, описанных выше; (ii) первого и третьего полипептидов, описанных выше; или (iii) второго и третьего полипептидов, описанных выше. Предпочтительной является комбинация первого и третьего полипептидов.

Если композиция содержит два различных менингококковых антигена fHBP, хотя они могут иметь некоторые общие последовательности, первый, второй и третий полипептиды обладают различными аминокислотными последовательностями fHBP.

Полипептид, включающий первую аминокислотную последовательность, при введении субъекту будет вызывать продукцию антител, включающих антитела, которые связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим формирующуюся аминокислотную последовательность SEQ ID NO:60 (MC58). В некоторых вариантах осуществления некоторые или все из этих антител не связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим формирующуюся аминокислотную последовательность SEQ ID NO:61 или с менингококковым белком дикого типа, имеющим формирующуюся аминокислотную последовательность SEQ ID NO:62.

Полипептид, включающий вторую аминокислотную последовательность, при введении субъекту будет вызывать продукцию антител, включающих антитела, которые связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим формирующуюся аминокислотную последовательность SEQ ID NO:61 (2996). В некоторых вариантах осуществления некоторые или все из этих антител не связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим формирующуюся аминокислотную последовательность SEQ ID NO:60 или с менингококковым белком дикого типа, имеющим формирующуюся аминокислотную последовательность SEQ ID NO:62.

Полипептид, включающий третью аминокислотную последовательность, при введении субъекту будет вызывать продукцию антител, включающих антитела, которые связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим формирующуюся аминокислотную последовательность SEQ ID NO:62 (M1239). В некоторых вариантах осуществления некоторые или все из этих антител не связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим формирующуюся аминокислотную последовательность SEQ ID NO:60 или с менингококковым белком дикого типа, имеющим формирующуюся аминокислотную последовательность SEQ ID NO:61.

В некоторых вариантах осуществления фрагмент из по меньшей мере x последовательных аминокислот из SEQ ID NO:1 не присутствует также в составе SEQ ID NO:2 или в составе SEQ ID NO:3. Аналогично, фрагмент из по меньшей мере y последовательных аминокислот из SEQ ID NO:2 не может присутствовать также в составе SEQ ID NO:1 или в составе SEQ ID NO:3. Аналогично, фрагмент из по меньшей мере z последовательных аминокислот из SEQ ID NO:3 не может присутствовать также в составе SEQ ID NO:1 или в составе SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления, если указанный фрагмент из одной из SEQ ID NO:1-3 выравнивают как непрерывную последовательность против двух других SEQ ID NOs, идентичность между фрагментом и каждой из двух других SEQ ID NOs составляет менее чем 75%, например менее чем 70%, менее чем 65%, менее чем 60% и так далее.

Значение a равно по меньшей мере 80, например 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или более. Значение b равно по меньшей мере 80, например 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или более. Значение c равно по меньшей мере 80, например 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или более. Значения a, b и c могут быть одинаковыми или разными. В некоторых вариантах осуществления a, b и c идентичны.

Значение x равно по меньшей мере 7, например 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250). Значение y равно по меньшей мере 7, например 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250). Значение z равно по меньшей мере 7, например 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250). Значения x, y и z могут быть одинаковыми или разными. В некоторых вариантах осуществления x, y и z идентичны.

Фрагменты предпочтительно содержат эпитоп из соответствующей последовательности SEQ ID NO:. В других полезных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца соответствующей SEQ ID NO:, при этом сохраняется по меньшей мере один ее эпитоп.

Аминокислотные последовательности по изобретению могут, по сравнению с SEQ ID NO:1, 2 или 3, содержать одну или несколько (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и так далее) консервативных аминокислотных замен, то есть замен одной аминокислоты на другую, имеющую родственную боковую цепь. Генетически закодированные аминокислоты в основном делятся на четыре семейства: (1) кислые, то есть аспартат, глутамат; (2) основные, то есть лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные, то есть аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные, то есть глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда совместно классифицируют как ароматические аминокислоты. Как правило, замена отдельных аминокислот внутри данных семейств не оказывает большого влияния на биологическую активность. Полипептиды могут иметь одну или более (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и так далее) одиночных аминокислотных делеций относительно контрольной последовательности. Полипептиды могут также содержать одну или более (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и так далее) вставок (например каждая по 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) относительно контрольной последовательности.

Полезная первая аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 85% идентичности (например >95 или 100%) с SEQ ID NO:1. Другая полезная первая аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичности (например >98 или 100%) с SEQ ID NO:66. Другая полезная первая аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичности (например >98 или 100%) с SEQ ID NO:67.

Полезная третья аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 85% идентичности (например >95 или 100%) с SEQ ID NO:3. Другая полезная третья аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичности (например >98 или 100%) с SEQ ID NO:68.

Комбинации, представляющие собой смесь первой и третьей последовательностей, имеющих в основе SEQ ID NO:66 и 68 (или их близкие варианты), особенно полезны. Другая полезная комбинация представляет собой смесь первой и третьей последовательностей, имеющих в основе смесь из SEQ ID NO:67 и 68 (или их близких вариантов). Таким образом, композиция может содержать полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:63, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:65.

В некоторых вариантах осуществления полипептид(ы) fHBP липидирован(ы), например на N-концевом остатке цистеина. Однако в других вариантах осуществления полипептид(ы) fHBP не липидированы. В случае липидированных fHBP, липиды, присоединенные к остаткам цистеина, как правило, включают пальмитоильные остатки, например такие как трипальмитоил-S-глицерилцистеин (Pam3Cys), дипальмитоил-S-глицерилцистеин (Pam2Cys), N-ацетил(дипальмитоил-S-глицерилцистеин) и так далее. Примерами зрелых липидированных последовательностей fHBP являются SEQ ID NO:63 (включая SEQ ID NO:66), SEQ ID NO:64 (включая SEQ ID NO:67) и SEQ ID NO:65 (включая SEQ ID NO:68).

Предпочтительно, введение fHBP будет вызывать продукцию антител, которые способны связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, 2 или 3. Предпочтительные антигены fHBP для использования по изобретению могут вызывать продукцию бактерицидных антименингококковых антител после введения субъекту.

Общее количество полипептида fHBP, как правило, составляет от 1 до 500 мкг/дозу, например от 60 до 200 или от 120 до 500 мкг/дозу.

Дополнительный антиген(ы)

В дополнение к конъюгированному пневмококковому капсульному сахариду(ам) и менингококковому фактор H-связующему белку(ам), композиции по изобретению могут содержать дополнительные антигены из менингококка, пневмококка и/или другого патогена(ов).

Менингококковые полипептидные антигены

В дополнение к содержанию менингококкового полипептидного антигена(ов) fHBP, композиция может содержать один или несколько дополнительных менингококковых полипептидных антигенов. Таким образом, композиция может содержать полипептидный антиген, выбранный из группы, состоящей из: 287, NadA, NspA, HmbR, NhhA, App и/или Omp85. Полезно, если данные антигены присутствуют в виде очищенных полипептидов, например рекомбинантных полипептидов. Предпочтительно, чтобы антиген вызывал продукцию бактерицидных антименингококковых антител после введения субъекту. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуногенные композиции либо содержат только один серологический подтип PorA менингококка, либо, предпочтительно, не содержат белка внешней мембраны PorA менингококка.

Композиция по изобретению может содержать антиген 287. Антиген 287 включен в опубликованную последовательность генома для штамма MC58 серогруппы B менингококка [54] как ген NMB2132 (регистрационный номер в GenBank GI:7227388; в данном документе SEQ ID NO:9). С тех пор были опубликованы последовательности антигена 287 из многих штаммов. Например аллельные формы 287 можно видеть на фиг.5 и 15 в ссылке 55, а также в примере 13 и на фиг.21 ссылки 56 (SEQ ID NO:3179-3184 - в них). Сообщалось также о различных иммуногенных фрагментах антигена 287. Предпочтительные антигены 287 для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:9; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:9, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:9. Наиболее полезные антигены 287 по изобретению могут вызывать продукцию антител, которые после введения субъекту способны связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9. Предпочтительные антигены 287 для использования по изобретению могут вызывать продукцию бактерицидных антименингококковых антител после введения субъекту.

Композиция по изобретению может содержать антиген NadA. Антиген NadA включен в опубликованную последовательность генома для штамма MC58 серогруппы B менингококка [54] как ген NMB1994 (регистрационный номер в GenBank GI:7227256; в данном документе SEQ ID NO:10). С тех пор были опубликованы последовательности антигена NadA из многих штаммов, и белковая активность как адгезина Neisseria убедительно доказана. Сообщалось также о различных иммуногенных фрагментах NadA. Предпочтительные антигены NadA для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:10; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:10, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:10. Наиболее полезные антигены NadA по изобретению могут вызывать продукцию антител, которые после введения субъекту способны связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10. Предпочтительные антигены NadA для использования по изобретению могут вызывать продукцию бактерицидных антименингококковых антител после введения субъекту. SEQ ID NO:6 представляет собой один из таких фрагментов.

Композиция по изобретению может содержать антиген NspA. Антиген NspA включен в опубликованную последовательность генома для штамма MC58 серогруппы B менингококка [54] как ген NMB0663 (регистрационный номер в GenBank GI:7225888; в данном документе SEQ ID NO:11). Антиген был ранее известен из ссылок 57 и 58. С тех пор были опубликованы последовательности антигена NspA из многих штаммов. Сообщалось также о различных иммуногенных фрагментах NspA. Предпочтительные антигены NspA для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:11; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:11, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:11. Наиболее полезные антигены NspA по изобретению могут вызывать продукцию антител, которые после введения субъекту способны связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:11. Предпочтительные антигены NspA для использования по изобретению могут вызывать продукцию бактерицидных антименингококковых антител после введения субъекту.

Композиции по изобретению могут содержать антиген HmbR менингококка. Полноразмерная последовательность HmbR включена в опубликованную последовательность генома для штамма MC58 серогруппы B менингококка [54] как ген NMB1668 (в данном документе SEQ ID NO:7). В ссылке 59 приведена последовательность HmbR из другого штамма (в данном документе SEQ ID NO:8). SEQ ID NO:7 и 8 различаются по длине на 1 аминокислоту и имеют 94,2% идентичности. По изобретению можно использовать полипептид, содержащий полноразмерную последовательность HmbR, однако часто используют полипептид, содержащий частичную последовательность HmbR. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления последовательность HmbR, использованная по изобретению, может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере i% идентичности последовательности с SEQ ID NO:7, где значение i равно 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или более. В других вариантах осуществления последовательность HmbR, использованная по изобретению, может содержать фрагмент из по меньшей мере j последовательных аминокислот из SEQ ID NO:7, где значение j равно 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более. В других вариантах осуществления последовательность HmbR, использованная по изобретению, может содержать аминокислотную последовательность (i), имеющую по меньшей мере i% идентичности последовательности с SEQ ID NO:7 и/или (ii), содержащую фрагмент из по меньшей мере j последовательных аминокислот из SEQ ID NO:7. Предпочтительные фрагменты из j аминокислот содержат эпитоп из SEQ ID NO:7. Такие эпитопы, как правило, включают аминокислоты, которые расположены на поверхности HmbR. Полезные эпитопы включают эпитопы с аминокислотами, вовлеченными в связывание HmbR с гемоглобином, поскольку антитела, которые связываются с этими эпитопами, могут блокировать способность бактерий связываться с гемоглобином хозяина. Топология HmbR и его важнейшие функциональные остатки исследованы в ссылке 60. Наиболее полезные антигены HmbR по изобретению могут вызывать продукцию антител, которые после введения субъекту способны связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:7. Предпочтительные антигены NspA для использования по изобретению могут вызывать продукцию бактерицидных антименингококковых антител после введения субъекту.

Композиция по изобретению может содержать антиген NhhA. Антиген NhhA включен в опубликованную последовательность генома для штамма MC58 серогруппы B менингококка [54] как ген NMB0992 (регистрационный номер в GenBank GI:7226232; в данном документе SEQ ID NO:12). С тех пор были опубликованы последовательности антигена NhhA из многих штаммов, например в ссылках 55 и 61, и сообщалось о различных иммуногенных фрагментах NhhA. Он также известен как Hsf. Предпочтительные антигены NhhA для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:12; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:12, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:12. Наиболее полезные антигены NhhA по изобретению могут вызывать продукцию антител, которые после введения субъекту способны связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12. Предпочтительные антигены NhhA для использования по изобретению могут вызывать продукцию бактерицидных антименингококковых антител после введения субъекту.

Композиция по изобретению может содержать антиген App. Антиген App включен в опубликованную последовательность генома для штамма MC58 серогруппы B менингококка [54] как ген NMB1985 (регистрационный номер в GenBank GI:7227246; в данном документе SEQ ID NO:13). С тех пор были опубликованы последовательности антигена App из многих штаммов. Сообщалось также о различных иммуногенных фрагментах App. Предпочтительные антигены App для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:13; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:13, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:13. Наиболее полезные антигены App по изобретению мог