Тканеспецифические биомаркеры старения

Тканеспецифические биомаркеры старения

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент США серийный No. 61/209854, зарегистрированной 11 марта 2009, раскрытие которой включено в настоящий документ путем отсылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение в целом относится к области поддержки с помощью питания здоровья и продолжительности жизни животных. В особенности изобретение обеспечивает способы разработки тканеспецифических универсальных биомаркеров старения у животных, а также наборы надежных биомаркеров идентифицируемых этими способами и применение тканеспецифических универсальных биомаркеров старения для идентификации питательных веществ и других функциональных ингредиентов или агентов, обладающих омолаживающими свойствами у животных.

Уровень техники

Было показано, что ограничение в потреблении калорий в количествах, существенно ниже уровня ad libitum, увеличивает продолжительность жизни, снижает или откладывает наступление многих возрастных состояний, улучшает устойчивость к стрессу и замедляет функциональное ухудшение здоровья у многих видов животных, включая млекопитающих, таких как грызуны и приматы (см., например, D.K. Ingram et al. (2004) Ann. N.Y. Acad. Sci. 1019: 412-423). Безусловно, проводили клинические испытания для оценки влияния на увеличение продолжительности жизни в результате ограничений в потреблении калорий (CR) у людей. Но у людей, также как и у животных, кажется маловероятным, что CR представляет собой эффективную стратегию для увеличения продолжительности жизни для большинства индивидуумов из-за степени и продолжительности необходимых ограничений. По этой причине исследование было сосредоточено на идентификации веществ, например, фармацевтических агентов, питательных веществ и им подобных, способных имитировать эффект CR без существенного изменения в пищевом рационе.

Усилия были направлены на поиск агентов, которые могут имитировать один или несколько физиологических или биохимических эффектов CR (см., например, Ingram et al., 2004, supra) или которые могут имитировать профиль генной экспрессии, ассоциированных с CR в определенных тканях и органах (например, Spindler, U.S. Patent 6,406,853; U.S. Patent Pub. 2003/0124540). В связи с последним, были раскрыты способы анализа генов, ассоциированных с CR, и скрининга CR-миметиков, на основании профиля генной экспрессии (Spindler et al., публикация патента США 2004/0180003, 2004/0191775 и 2005/0013776; Pan et al., публикация патента США 2007/0231371).

Несмотря на доступность изложенных выше подходов, сохраняется необходимость в более надежных, быстрых и менее дорогостоящих способах скрининга агентов, способных замедлить или обратить процесс старения, препятствовать преждевременному старению и увеличить продолжительности жизни. Настоящее изобретение отвечает этому требованию.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следовательно, цель настоящего изобретения заключается в обеспечении способов идентификации надежных и универсально применимых маркеров экспрессии генов старения в выбранных тканях и в обеспечении наборов надежных и универсально применимых маркеров экспрессии генов, идентифицируемых этими способами.

Другая цель изобретения заключается в обеспечении одного или нескольких генов или сегментов гена, которые дифференциально экспрессируются в выбранных тканях старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами.

Дополнительная цель изобретения заключается в обеспечении набора, включающего множество полинуклеотидов, которые дифференциально экспрессируются в выбранных тканях старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами.

Другая цель изобретения заключается в обеспечении композиций из двух или нескольких полинуклеотидных или полипептидных зондов, подходящих для детекции экспрессии генов, дифференциально экспрессируемых в выбранных тканях старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами и устройств, таких как чипы, содержащие зонды на подложке.

Дополнительная цель изобретения заключается в обеспечении способов детекции дифференциальной экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в выбранных тканях старых субъектов, по сравнению с молодыми субъектами или стандартным контрольным образцом.

Другая цель изобретения заключается в обеспечении способа измерения эффекта тестируемого вещества на профиле экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в выбранных тканях старых субъектов, по сравнению с молодыми субъектами или стандартным контрольным образцом.

Одну или несколько из этих целей достигают, применяя новые способы идентификации тканеспецифических биомаркеров старения и новые комбинации полинуклеотидов или полипептидов, представляющих собой гены и сегменты гена, которые дифференциально экспрессируются в выбранных тканях старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами. Полинуклеотиды применяют для получения композиций, зондов, устройств, основанных на зондах, и способов определения статуса полинуклеотидов, дифференциально экспрессируемых в выбранных тканях старых субъектов, по сравнению с молодыми субъектами или стандартным контрольным образцом, которые полезны для достижения вышеуказанных целей, например, для прогнозирования и диагностирования возрастных состояний в выбранных тканях и скрининга веществ для определения того, действительно ли они обладают омолаживающим эффектом в определенных тканях. Также обеспечивают разнообразные наборы, включающие комбинации зондов, устройства, в которых применены зонды, и вещества, а также различные компьютерные программы, содержащие информацию по применению, и средства коммуникации для передачи информации, имеющей отношение к дифференциально экспрессируемым генам и способам их применения.

Другие и дополнительные цели, признаки и преимущества изобретения легко понятны специалистам в этой области техники.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Для применения в настоящем документе, диапазоны указаны в сокращенном виде, для того, чтобы избежать необходимости приводить длинный вариант и описывать все, без исключения, величины внутри диапазона. В зависимости от ситуации может быть выбрана любая подходящая величина внутри диапазона, подходящая в качестве верхнего значения, нижнего значения или границы диапазона. Ясно, что все без исключения, целые или дробные числа между любыми диапазонами или интервалами, приведенными в этой заявке, включены в эту заявку.

Используемое здесь и в прилагаемой формуле изобретения слово в единственном числе включает множественное число и, наоборот, кроме тех случаев, когда контекст ясно указывает на иное. Например, ссылка на «животное», «способ» или «вещество» включает множество таких «животных», «способов» или «веществ». Сходным образом, слова «включают», «включает» и «включающий» следует интерпретировать скорее включительно, чем исключительно.

Термин «животное» означает человека или другое животное, включая птиц, крупный рогатый скот, собак, лошадей, кошек, коз, мышей, овец и свиней. Если термин применяют в контексте сравнения исследуемых субъектов, то животные, которых сравнивают, представляют собой животных одних и тех же видов и, при возможности, одной и той же расы или породы. «Животное-компаньон» представляет собой любое домашнее животное и включает, без ограничения, кошек, собак, кроликов, морских свинок, хорьков, хомяков, мышей, песчанок, лошадей, коров, коз, овец, ослов, свиней и им подобных. Предпочтительно, животное представляет собой человека или животное-компаньона, такое как собака или кошка.

Термин «антитело» означает любой иммуноглобулин, который связывается со специфическим антигеном, и включает антитела IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Термин включает поликлональные, моноклональные, моновалентные, гуманизированные антитела, гетероконъюгаты, композиции антител с полиэпитопной специфичностью, химерные, биспецифичные антитела, диатела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител, такие как Fab, Fab', F(ab')2 и Fv или другие антигенсвязывающие фрагменты.

Термин «панель» означает упорядоченное расположение, по меньшей мере, двух зондов на подложке. По меньшей мере, один зонд представляет собой контрольный или стандартный зонд, и, по меньшей мере, один зонд представляет собой диагностический зонд. Размещение от примерно двух до примерно 40000 зондов на подложке гарантирует, что размер и интенсивность сигнала от каждого меченого комплекса, сформированного между зондом и полинуклеотидом или полипептидом образца, индивидуально различимы.

Термин «комплекс связывания» означает комплекс, формирующийся, когда полипептид в образце специфически связывается (как определено в этой заявке) с партнером по связыванию, таким как антитело или его функциональный фрагмент.

Термин «ограничение в калориях» или «ограничение в калорийности» означает любой режим питания с низким содержанием калорий, без недоедания. В целом, ограничение касается общего содержания калорий, получаемых из углеводов, жиров и белков. Ограничение обычно составляет, хотя не ограничивается, примерно от 25% до примерно 40% от калорийности потребляемой пищи по сравнению с калорийностью потребления ad libitum.

Термин «пищевая добавка» означает продукт, который предназначен для потребления в дополнении к нормальной диете животного. Пищевые добавки могут находиться в любой форме, например, в твердой, жидкой форме, в форме геля, таблеток, капсул, порошка и им подобных. Предпочтительно, их обеспечивают в подходящих лекарственных формах. В некоторых воплощениях их обеспечивают в упаковках для крупных потребителей, таких как нерасфасованные порошки или жидкости. В других воплощениях, добавки обеспечивают крупными партиями для включения в другие пищевые продукты, такие как сухие завтраки, лакомства, батончики с добавками, напитки и им подобные.

Термин «дифференциальная экспрессия» или «дифференциально экспрессируемый» означает увеличенную или повышенную экспрессию гена или означает ослабленную или сниженную экспрессию гена, которую детектируют по отсутствию, присутствию или, по меньшей мере, двукратному изменению в количестве транскрибируемой информационной РНК или транслируемого белка в образце.

Термин «эффективное количество» означает количество соединения, материала, композиции, лекарственного средства или другого материала, которое эффективно для достижения определенного биологического результата, такого как обращение или замедление старения в выбранной ткани, как описано в этой заявке.

Термин «пища» или «пищевая композиция» означает композицию, которая предназначена для поглощения животным, включая человека, и обеспечивает его питание. Использованное в этой заявке определение «пищевой продукт, разработанный для потребления человеком», представляет собой любую композицию, специфически предназначенную для поглощения человеком. «Корма для животных» представляют собой композиции, предназначенные для потребления домашними животными, предпочтительно, животными-компаньонами. «Полный и сбалансированный по питательным веществам корм для животных» представляет собой такой корм, который содержит все известные необходимые питательные вещества для предполагаемого получателя или потребителя корма, в подходящих количествах и пропорциях, основанных, например, на рекомендациях признанных авторитетов в области питания животных-компаньонов. Такие корма, следовательно, способны служить в качестве единственного источника пищевого рациона для поддержания жизни или стимуляции продуктивности, без добавления дополнительных питательных источников. Композиции сбалансированного по питательным веществам корма для животных широко известны и широко применяются в этой области техники.

Термин «фрагмент» означает (1) олигонуклеотидную или полинуклеотидную последовательность, которая представляет собой часть полной последовательности и которая обладает такой же или сходной активностью при определенном применении, как и полная полинуклеотидная последовательность; или (2) пептидная или полипептидная последовательность, которая представляет собой часть полной последовательности и которая обладает такой же или сходной активностью при специфическом применении, как и полная полипептидная последовательность. Такие фрагменты могут включать любое число нуклеотидов или аминокислот, которые считаются подходящими для специфического применения. Обычно, олигонуклеотидные или полинуклеотидные фрагменты содержат, по меньшей мере, примерно 10, 50, 100 или 1000 нуклеотидов, и полипептидные фрагменты содержат, по меньшей мере, примерно 4, 10, 20 или 50 последовательных аминокислот из полной последовательности. Термин охватывает варианты фрагментов полинуклеотидов и полипептидов.

Термин «ген» или «гены» означает полный или частичные сегмент ДНК, вовлеченный в продуцирование полипептида, включая участки, предшествующие кодирующей области и следующие за ней (лидерный и трейлерный) и промежуточные последовательности (интроны) между индивидуальными кодирующими сегментами (экзонами). Термин охватывает любую последовательность ДНК, которая гибридизуется с комплементарной цепью, кодирующей последовательности гена.

Термин «генный продукт» означает продукт транскрипции гена, такой как мРНК или ее производные (например, кДНК), или трансляции генного транскрипта. Термин «генный продукт» обычно означает продукт трансляции, который представляет собой белок. Термин «генный продукт» может быть применен взаимозаменяемо с термином «белок» в этой заявке.

Термин «гомолог» означает (1) полинуклеотид, включая полинуклеотиды из одинаковых или разных видов животных, имеющий более чем 30%, 50%, 70% или 90% сходства в последовательности с полинуклеотидом сравнения и имеющий одинаковые или существенно сходные свойства и демонстрирующий одинаковую или существенно сходную с полинуклеотидом сравнения функцию, или обладающий способностью специфически гибридизоваться с полинуклеотидом сравнения в жестких условиях; или (2) полипептид, включая полипептиды из одинаковых или разных видов животных, имеющий более чем 30%, 50%, 70% или 90% сходства в последовательности с полипептидом сравнения и имеющий одинаковые или существенно сходные свойства и демонстрирующий одинаковую или существенно сходную с полипептидом сравнения функцию, или обладающий способностью специфически связываться с полипептидом сравнения. При отсылке к фрагментам полноразмерной кодирующей последовательности, функция этих фрагментов может просто заключаться в кодировании выбранной части полипептида определенной последовательность или, соответственно, быть сходной последовательностью для гибридизации с другим полинуклеотидным фрагментом, кодирующим этот полипептид. При отсылке к фрагментам полипептида, функция этих фрагментов может просто заключаться в формировании эпитопа, подходящего для генерации антитела. Сходства в последовательности двух полипептидных последовательностей или двух полинуклеотидных последовательностей определяют, применяя способы, известные специалистам в этой области техники, например, алгоритм Karlin и Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268 (1990)). Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). Для получения выравниваний с разрывами для целей сравнения, может быть применена программа Gapped Blast, как описано у Altschul et al. (Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). При применении программ BLAST и Gapped BLAST, применяют параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). Смотри .

Термин «гибридизационный комплекс» означает комплекс, который формируется между полинуклеотидами образца, когда пурины одного полинуклеотида образуют водородные связи с пиримидинами комплементарного полинуклеотида, например, пар оснований 5'-A-G-T-C-3' с 3'-T-C-A-G-5'. Степень комплементарности и применение аналогов нуклеотидов определяют эффективность и жесткость условий реакции гибридизации.

Термин «совместно» означает, что лекарственный препарат, пищу или другое вещество вводят животному (1) вместе, в композиции, в частности, в пищевой композиции или (2) отдельно, с одинаковой или разной частотой, применяя одинаковые или разные пути введения за примерно одинаковое время или периодически. «Периодически» означает, что вещество вводят по схеме применения, приемлемой для специфического вещества. «Примерно одинаковое время» обычно означает, что вещество (пища или лекарственный препарат) вводят в одинаковое время или в течение примерно 72 часов друг от друга. «Совместно» специфически включает схемы введения, при которых вещества, такие как лекарственные препараты, вводят в течение указанного периода, а композиции изобретения вводят в течение неопределенного периода времени.

Термин «индивидуальный», при ссылке на животное, означает индивидуальное животное любого вида или типа. Этот термин может быть применен взаимозаменяемо с термином «субъект».

Термин «долгожительство» обычно означает продолжительность жизни за пределами средней прогнозируемой продолжительности жизни для определенного вида или для определенной линии, породы или этнической группы внутри этого вида, если существуют различия внутри вида. «Улучшенная продолжительность жизни» или «увеличенная продолжительность жизни» означает любое существенное удлинение продолжительности жизни определенного животного за пределами средней прогнозируемой продолжительности жизни для вида, к которому животное принадлежит.

Термин «полинуклеотид» или «олигонуклеотид» означает полимер нуклеотидов. Термин охватывает молекулы ДНК и РНК (включая кДНК и мРНК), как одноцепочечные, так и двухцепочечные, и, если одноцепочечные, то с комплементарной последовательностью как в линейной, так в кольцевой форме. Термин также охватывает фрагменты, варианты, гомологи и аллели, как подходящие для последовательностей, которые имеют одинаковые или существенно сходные свойства и демонстрируют одинаковую или существенно сходную с оригинальной последовательностью функцию. В особенности, термин охватывает гомологи из различных видов, например, из мыши и собаки или кошки. Последовательности могут быть полностью комплементарны (без ошибочно спаренных оснований) при выравнивании или могут иметь вплоть до примерно 30% ошибочно спаренных оснований в последовательности. Предпочтительно, для полинуклеотидов, цепь содержит от примерно 50 до 10000 нуклеотидов, более предпочтительно от примерно 150 до 3500 нуклеотидов. Предпочтительно, для олигонуклеотидов, цепь содержит от примерно 2 до 100 нуклеотидов, более предпочтительно от примерно 6 до 30 нуклеотидов. Точный размер полинуклеотида или олигонуклеотида будет зависеть от различных факторов и от конкретного приложения и применения полинуклеотида или олигонуклеотида. Термин включает нуклеотидные полимеры, которые синтезируют, и которые изолируют и очищают из природных источников. Термин «полинуклеотид» включает термин «олигонуклеотид».

Термин «полипептид», «пептид» или «белок» означает полимер аминокислот. Термин охватывает природные и неприродные (синтетические) полимеры и полимеры, в которых одна или несколько аминокислот заменены искусственными химическими миметиками. Термин также охватывает фрагменты, варианты и гомологи, которые имеют одинаковые или существенно сходные свойства и демонстрируют одинаковую или существенно сходную с оригинальной последовательностью функцию. Термин охватывает полимеры любой длины, предпочтительно полимеры, содержащие от примерно 2 до 1000 аминокислот, более предпочтительно от примерно 5 до 500 аминокислот. Термин включает полимеры аминокислот, которые синтезируют и которые изолируют и очищают из природных источников.

Термин «зонд» означает (1) олигонуклеотид или полинуклеотид, как РНК, так и ДНК, или природный в виде очищенного после ферментативного расщепления полинуклеотида, или полученный с помощью синтеза, который способен к отжигу с полинуклеотидом с последовательностями, комплементарными зонду, или способен специфически гибридизоваться с ним, или (2) соединение или вещество, включая пептид или полипептид, способные специфически связываться с определенным белком или фрагментом белка с существенным исключением других белков или фрагментов белков. Олигонуклеотидный или полинуклеотидный зонд может быть как одноцепочечный, так и двухцепочечный. Точная длина зонда будет зависеть от многих факторов, включая температуру, источник и применение. Например, для диагностического применения, в зависимости от сложности целевой последовательности, олигонуклеотидный зонд обычно содержит примерно от 10 до 100, от 15 до 50 или от 15 до 25 нуклеотидов. В некоторых диагностических приложениях, полинуклеотидный зонд содержит примерно 100-1000, 300-600 нуклеотидов, предпочтительно примерно 300 нуклеотидов. Зонды в этой заявке выбирают так, чтобы они были «в значительной степени» комплементарны разным нитям определенной последовательности-мишени. Это означает, что зонды должны быть в достаточной мере комплементарны для специфической гибридизации или отжига с их соответствующими последовательностями-мишенями в заранее заданном наборе условий. Следовательно, последовательность-зонд не должна быть полностью комплементарна последовательности мишени. Например, некомплементарный нуклеотидный фрагмент может быть присоединен к 5'- или 3'-концу зонда, тогда как оставшаяся последовательность зонда будет комплементарной последовательности-мишени. Альтернативно, некомплементарные основания или более длинные последовательности могут быть включены в последовательность зонда, если последовательность-зонд в достаточной степени комплементарна последовательности полинуклеотида-мишени для специфического отжига с полинуклеотидом-мишенью. Пептид или полипептидный зонд может представлять собой любую молекулу, с которой белок или пептид специфически связывается, включая ДНК (для ДНК-связывающих белков), антитела, рецепторы клеточной мембраны, пептиды, кофакторы, лектины, сахара, полисахариды, клетки, клеточные мембраны, органеллы и мембраны органелл.

Термин «образец» означает любую ткань или жидкость животного, содержащие, например, полинуклеотиды, полипептиды, антитела, метаболиты и им подобных, включая клетки и другие ткани, содержащие ДНК и РНК. Примеры включают жировую ткань, кровь, хрящ, соединительную ткань, эпителиальную ткань, лимфоидную ткань, мышцы, нервы, мокроту и им подобные. Образец может быть твердым или жидким и может представлять собой ДНК, РНК, кДНК, жидкости организма, такие как кровь или моча, клетки, клеточные препараты или растворимые фракции или аликвоты их среды, хромосомы, органеллы и им подобные.

Термин «разовая упаковка» означает, что компоненты набора физически собраны в один или несколько контейнеров или связаны с ним и рассматриваются как единица для производства, распространения, продажи или применения. Контейнеры включают, но не ограничиваются, мешки, коробки, бутылки, упаковки в термоусадочной пленке, скрепленные металлическими скрепками или иным образом зафиксированные компоненты или их комбинации. Разовая упаковка может представлять собой контейнеры с индивидуальными пищевыми композициями, физически присоединенными так, чтобы их рассматривали как единицу для производства, распространения, продажи или применения.

Термин «специфически связывается» означает специальное и точное взаимодействие между двумя молекулами, которое зависит от их структуры, в частности, от боковых групп их молекул. Например, интеркаляция регуляторного белка в большую бороздку молекулы ДНК, образование водородных связей вдоль углеродного скелета между двумя одноцепочечными нуклеиновыми кислотами или связывание между эпитопом белка и агонистом, антагонистом или антителом.

Термин «специфически гибридизуется» означает ассоциацию двух одноцепочечных полинуклеотидов, имеющих в достаточной мере комплементарные последовательности (иногда определяемых как «в значительной степени комплементарные»), так чтобы произошла гибридизация в заранее определенных условиях, обычно применяемых в этой области техники. Например, термин может означать гибридизацию полинуклеотидного зонда с в значительной степени комплементарной последовательностью, которая содержится в молекуле одноцепочечной ДНК или РНК, в соответствии с аспектом изобретения, с существенным исключением гибридизации полинуклеотидного зонда с одноцепочечными полинуклеотидами некомплементарной последовательности.

Термин «стандарт» означает (1) контрольный образец, который содержит ткань из субъекта, которому было введено контрольное вещество или вещество сравнения или не было введено никакого вещества, в сравнении с образцом, который содержит ткань из субъекта, которому было введено тестируемое вещество, например, для определения, вызывает ли тестируемое вещество дифференциальную экспрессию гена, приобретенную в контексте его применения.

Термин «жесткие условия» означает (1) гибридизацию в 50% (объем/объем) формамиде с 0,1% бычьим сывороточным альбумином, 0,1% Фиколлом, 0,1% поливинилпирролидоном, 50 мМ натрий-фосфатном буфере при pH 6,5 с 750 мМ NaCl, 75 мМ цитрата натрия при 42°C, (2) гибридизация в 50% формамиде, 5х SSC (0,75 М NaCl, 0,075 М цитрат натрия), 50 мМ фосфате натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфате натрия, 5х растворе Денхардта, обработанной ультразвуком ДНК из молок лососевых (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% сульфате декстрана при 42°C; с промывками при 42°C в 0,2 х SSC и 0,1% SDS или с промывками с 0,015 М NaCl, 0,0015 М цитратом натрия, 0,1% Na₂SO₄ при 50°C или сходными процедурами, с применением такой же низкой ионной силы и высокой температуры, таких же агентов для промывок и похожих денатурирующих агентов.

Термин «тканеспецифический маркер» или «тканеспецифических биомаркер», применяемый в этой заявке, означает гены и продукты их экспрессии, которые дифференциально экспрессируются в выбранной ткани старого субъекта в сравнении с молодым субъектом. Термин «тканеспецифический» предназначен для того, чтобы охватить ткани и органы. Например, выбранная ткань может быть гладкомышечной тканью из сердца, и тканеспецифические маркеры могут быть обозначены как «специфические для сердца». В другом примере, выбранная ткань может быть жировой тканью, которая может быть не связана с каким-либо определенным органом. Специалисту ясны эти термины в том виде, как их применяют в контексте на всем протяжении описания.

Термин «вариант» означает (1) полинуклеотидную последовательность, содержащую любую замену, изменение, модификацию, замещение, делецию или вставку одного или нескольких нуклеотидов из полинуклеотидной последовательности или в нее, и которая имеет одинаковые или существенно сходные свойства и демонстрирует одинаковую или существенно сходную с оригинальной последовательностью функцию; и (2) полипептидную последовательность, содержащую любую замену, изменение, модификацию, замещение, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот из полипептидной последовательности или в нее, и которая имеет одинаковые или существенно сходные свойства и демонстрирует одинаковую или существенно сходную с оригинальной последовательностью функцию. Термин, следовательно, включает полиморфизм единичных нуклеотидов (SNP) и аллельные варианты и включает консервативные и неконсервативные замены аминокислот в полипептидах. Термин также охватывает получение производных полинуклеотида или полипептида химическим способом и замену нуклеотидов или аминокислот нуклеотидами или аминокислотами, которые не встречаются в природе.

Термин «виртуальная упаковка» означает, что компоненты набора связаны с помощью руководств на одном или нескольких физических или виртуальных компонентах набора, инструктирующих пользователя, как получить другие компоненты, например, в пакете, содержащем один компонент и руководства, предписывающие пользователю обратиться к веб-сайту, прослушать записанное сообщение, просмотреть визуальное сообщение или обратиться к составителю или инструктору для получения указаний по применению набора.

«Молодой» обычно означает взрослого молодого индивидуума, т.е., вышедшего из пубертатного периода или подросткового возраста, что будет определяться видом или линией, породой или этнической группой внутри вида, в соответствии с известными параметрами. Термин «пожилой» или «старый», используемый в этой заявке, означает индивидуума, который физически или хронологически находится в рамках последних 30% своей средней прогнозируемой продолжительности жизни, что обусловлено видом или линией, породой или этнической группой внутри вида, в соответствии с известными параметрами.

Способы и композиции и другие преимущества, раскрытые в этой заявке, не ограничены определенной методологией, протоколами и реагентами, описанными в этой заявке, поскольку, как ясно специалисту, они могут изменяться. Кроме того, терминология, примененная в этой заявке, предназначена для целей описания только конкретных воплощений и не предназначена для ограничения и не ограничивает объем того, что раскрыто или заявлено.

Если не указано иное, то все технические и научные термины, термины области техники и аббревиатуры, примененные в этой заявке, имеют значении, общепринятые для понимания специалистом среднего уровня компетенции в области(областях) техники изобретения или в области(областях) техники, где этот термин применяют. Хотя любые композиции, способы, изделия или другие средства или материалы, похожие или эквивалентные, описанным в этой заявке, могут быть применены в практике изобретения, в этой заявке описаны предпочтительные композиции, способы, изделия или другие средства или материалы.

Все патенты, патентные заявки, публикации и другие ссылки, процитированные в этой заявке или на которые ссылаются в этой заявке, включены в эту заявку путем отсылки в той степени, в которой это позволяется регулирующим законодательством. Обсуждение этих ссылок предназначено только для суммирования сделанных в них утверждений. Не делается никакого допущения, что любые такие патенты, патентные заявки, публикации или ссылки или любая их часть относятся к релевантному материалу или к известному уровню техники. Право оспаривать верность и пертинентность любого утверждения, что такие патенты, патентные заявки, публикации и другие ссылки являются релевантным материалом или входят в уровень техники, специфически сохраняется.

Изобретение

Частично, настоящее изобретение возникло из способа для идентификации надежных маркеров экспрессии генов старения в выбранных тканях, разработанного авторами. Способ включает стадию скрининга для поиска дифференциально экспрессирующегося гена в выбранных тканях в большинстве линий, пород или этнических групп у вида, и применяют такой критерий, что кандидат на маркер экспрессии гена должен дифференциально экспрессироваться в большинстве линий, пород или этнических групп, среди которых проводят скрининг. Применяя этот и, необязательно, один или несколько вторичных критериев скрининга, были идентифицированы наборы надежных маркеров экспрессии генов старения в нескольких выбранных тканях.

В некоторых воплощениях изобретения, маркеры применяют для измерения экспрессии, по меньшей мере, одного дифференциально экспрессируемого гена. В предпочтительных воплощениях, маркеры применяют для измерения экспрессии двух или нескольких дифференциально экспрессируемых генов. Измерение экспрессии двух или нескольких дифференциально экспрессируемых генов обеспечивает паттерн экспрессирующихся генов или профиль генной экспрессии для выбранной ткани. Более предпочтительно, может быть проведено измерение множества дифференциально экспрессируемых генов в нескольких выбранных тканях, что обеспечивает дополнительную информацию о паттерне экспрессирующихся генов или профиле генной экспрессии.

В различных воплощениях изобретения, изменения в экспрессии гена могут быть измерены с помощью одного или обоих из следующих способов: (1) измерение транскрипции путем обнаружения мРНК, продуцируемой определенным геном; и (2) измерение трансляции путем обнаружения белка, продуцируемого определенным транскриптом.

Сниженная или увеличенная экспрессия может быть измерена на уровне РНК, с помощью любого способа, хорошо известного в этой области техники для количественного определения полинуклеотидов, такого как, например, PCR (включая, без ограничения, RT-PCR и qPCR), защита от РНКазы, нозерн-блоттинг, микроэррей(чип), макроэррей(чип) и другие способы гибридизация. Гены, которые исследуют или испытывают в соответствии с изобретением, обычно находятся в форме мРНК или обратно транскрибированной мРНК. Гены могут быть клонированы и/или амплифицированы. Клонирование само по себе, похоже, не оказывает влияния на репрезентативность генов в популяции. Однако может быть предпочтительно в качестве источника применять полиА+РНК, поскольку для ее применения требуется меньшее число технологических операций.

Таким образом, в одном из аспектов изобретение обеспечивает способы идентификации маркеров экспрессии генов старения в выбранной ткани. Способы включают отбор одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в ткани у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, с применением такого критерия, что ген дифференциально экспрессируется в выбранной ткани в большом количестве линий, пород или этнических групп видов, предпочтительно, на заранее заданном уровне значимости (например, p<0,10, p<0,05 или p<0,01). В некоторых воплощениях, ген дифференциально экспрессируется в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более линиях, породах или этнических группах. В других воплощениях устанавливают такой критерий, что ген дифференциально экспрессируется в большинстве протестированных линий, пород или этнических групп и может быть усилен так, чтобы ген должен дифференциально экспрессироваться, по меньшей мере, в 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% протестированных линий, пород или этнических групп.

Способ может быть применен на практике в линиях, породах или этнических группах любого вида. В конкретных воплощениях, вид представляет собой млекопитающее и, в особенности, человека или животное-компаньона, такое как собака или кошка, или других животных-компаньонов, как определены выше.

Ткань, которую выбирают для практического применения способа, может представлять собой любую ткань или орган, включая, но, не ограничиваясь, жировую ткань, мочевой пузырь, кровь, кость, костный мозг, пищеварительный тракт, мозг и центральную нервную систему, молочную железу, бронхи, хрящ, ободочную и прямую кишку, соединительную ткань, эндокринную систему, глаз, женские репродуктивные органы, железы, сердце, кишечник, почку, печень, легкое и назальную/бронхиальную систему, лимфатический узел и лимфоидные органы, мужские репродуктивные органы, ротовую полость и язык, нервную ткань, отличную от мозга/ЦНС, поджелудочную железу, брюшную полость, селезенку и желудок. В примерах осуществления изобретения ткань выбирают из сердца, мышц, мозга или жировой ткани.

Описанный выше способ может включать дополнительные критерии идентификации надежных маркеров старения в выбранных тканях. Например, способ может дополнительно включать тот критерий, что дифференциальная экспрессия гена, дифференциально экспрессируемого у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, по меньшей мере, частично обращается путем ограничения в калорийности. Способ также может дополнительно включать тот критерий, что известно или предполагается, что ген, дифференциально экспрессируемый у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, ассоциирован с одной или несколькими связанными со старением физиологическими функциями. Функциональность генного продукта может быть определена экспериментально или по доступной специалисту литературе.

Описанные выше способы применяют для идентификации биомаркеров старения в выбранных тканях. Соответственно, в еще одном аспекте изобретения обеспечивают комбинации, включающие множество полинуклеотидов или экспрессируемых