Адъювантный менингококковый белок, связывающий фактор н

Адъювантный менингококковый белок, связывающий фактор н

Реферат

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США 61/162999 (поданной 24 марта 2009 г.), полное содержание которой, таким образом, приводится в настоящем документе в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области менингококковых вакцин, в частности вакцин, содержащих антиген fHBP.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Neisseria meningitidis (менингококк) представляет собой грамположительную сферическую бактерию. Существующие в настоящее время менингококковые вакцины при этом основаны на капсульных сахаридах. К ним относятся моновалентные конъюгатные вакцины против серогруппы С и 4-валентные конъюгатные смеси против серогрупп А, С, W135 и Y. В настоящее время не существует используемой вакцины, лицензированной для широкого применения против серогруппы В («MenB»).

Один из антигенов, который был предложен для применения в иммунизации против MenB, представляет собой белок, связывающий фактор Н (fHBP). Этот антиген также был назван белком «741» (SEQ ID 2535 и 2536 в ссылке 34), «NMB1870», «GNA1870» [ссылки 1-3], «Р2086», «LP2086» или «ORF2086» [4-6]. Белок был хорошо изучен. В природе он представляет собой липопротеин и экспрессируется во всех менингококковых серогруппах. Структура С-концевого иммунодоминантного домена fHbp («fHbpC») была определена посредством NMR [7]. Эта часть белка образует восьмицепочечную β-конформацию, цепи которой соединяются петлями вариабельной длины. Конформации предшествует короткая α-спираль и гибкий N-терминальный хвост.

Антиген fHBP представлен в трех различных вариантах [8], и, как было обнаружено, сыворотка, полученная против одного из данных семейств, является бактерицидной для этого самого семейства, но не активна против штаммов, которые экспрессируют одно из двух других семейств, т.е. существует перекрестный иммунитет внутри семейства, но нет перекрестного иммунитета между семействами. Поэтому в ссылке 8 предлагается объединить различные варианты fHBP в одну вакцинную композицию, таким образом повышая охват штаммов, либо в виде смеси отдельных белков, либо в виде слитого белка из различных вариантов (последние являются «тандемными белками»).

В ссылке 9 также сообщается о тандемном белке fHBP (страницы 18-19 ссылки 9). Этот тандемный белок очищали и смешивали с фосфатом алюминия в качестве адъюванта, но сообщается, что он не адсорбируется на адъюванте удовлетворительно. Желательна успешная адсорбция антигенов, и было обнаружено, что такие смешанные белки fHBP без труда адсорбируются при использовании в качестве адъюванта гидроксида алюминия.

При использовании гидроксида алюминия в качестве адъюванта, тем не менее, существует проблема в том, что он может разрушать некоторые антигены. Например, в ссылке 10 сообщается, что он может гидролизовать конъюгатные вакцины против H.influenzae типа В даже при низких температурах, что приводит к сниженной эффективности. Аналогично, в ссылке 11 сообщается о гидролизе капсульного сахарида Vi бактерии S.typhi при наличии гидроксида алюминия. Поэтому может быть желательным смешивать антигены, используя адъювант на основе фосфата алюминия, особенно если адъювантная вакцина может быть смешана (либо в процессе производства, либо во время применения) с антигеном, который может быть восприимчив к повреждению гидроксидом алюминия, например, конъюгированным бактериальным капсульным сахаридом.

Таким образом, желательно создать препаративные формы белка fHBP и, в частности, большого числа вариантов fHBP, в которых fHBP адсорбирует(ют)ся на адъюванте, но которым не требуется гидроксид алюминия.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения установили основные техники достижения эффективной адсорбции белков fHBP на адъювантах гидроксифосфатах алюминия. Применение гидроксифосфата алюминия может избавить от необходимости использовать гидроксид алюминия, и техники, предлагаемые авторами изобретения, позволяют избежать неэффективной адсорбции, описанной в ссылке 9. Техники адсорбции можно использовать, в частности, в отношении композиций, которые включают большое число вариантов fHBP.

В первом аспекте изобретения адсорбция fHBP происходит при величине рН, которая равна или ниже точки нулевого заряда (PZC) гидроксифосфата алюминия. Для данного адъюванта гидроксифосфата алюминия, поэтому, водная среда (например, буфер) выбиралась бы с величиной рН, равной или ниже PZC адъюванта. Напротив, для данной величины рН гидроксифосфат алюминия выбирался бы с той же или большей PZC. Этот выбор величины рН и PZC может создать иммуногенные композиции, в которых fHBP устойчиво адсорбируется на гидроксифосфате алюминия.

Во втором аспекте fHBP и адъювант гидроксифосфат алюминия выбирают так, чтобы fHBP имел изоэлектрическую точку (pI) в диапазоне от 5,0 до 7,0 (включительно), и PZC адъюванта выбирают в том же диапазоне. При достижении такого близкого совпадения характеристик антигена и адъюванта возможно получение устойчиво адсорбируемых композиций, даже если величина рН адсорбции выше PZC адъюванта. Устойчивой адсорбции содействует наличие буфера, который может поддерживать величину рН также в диапазоне от 5,0 до 7,0.

В третьем аспекте, если fHBP имеет изоэлектрическую точку выше PZC адъюванта гидроксифосфата алюминия, то буфер добавляют до доведения величины рН до диапазона в 1,2 единицы рН от PZC.

Таким образом, по первому аспекту изобретение относится к способу адсорбирования менингококкового антигена fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюминия, где адсорбция происходит при величине рН, которая равна или ниже точки нулевого заряда гидроксифосфата алюминия. Адсорбированный антиген fHBP может быть использован в качестве иммуногена. Адсорбция может быть осуществлена большим числом способов. Смешивание антигена fHBP, гидроксифосфата алюминия и буфера может осуществляться в любом подходящем порядке, либо объединяя все три компонента, взятые по отдельности, либо предварительно смешивая два компонента и затем смешивая предварительную смесь с третьим компонентом.

Изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей менингококковый антиген fHBP и адъювант гидроксифосфат алюминия, где адъювант гидроксифосфат алюминия имеет точку нулевого заряда, которая выше, чем величина рН иммуногенной композиции.

По второму аспекту изобретение относится к способу адсорбирования менингококкового антигена fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюминия, где (i) менингококковый антиген fHBP имеет изоэлектрическую точку между 5,0 и 7,0, (ii) адъювант гидроксифосфат алюминия имеет точку нулевого заряда между 5,0 и 7,0, и (iii) адсорбция антигенов fHBP происходит при величине рН между 5,0 и 7,0.

Изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей менингококковый антиген fHBP, адсорбированный на адъюванте гидроксифосфате алюминия, где (i) менингококковый антиген fHBP имеет изоэлектрическую точку между 5,0 и 7,0, (ii) адъювант гидроксифосфат алюминия имеет точку нулевого заряда между 5,0 и 7,0. Композиция обычно включает буфер для поддержания величины рН в диапазоне от 5,0 до 7,0.

По третьему аспекту изобретение относится к способу адсорбирования менингококкового антигена fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюминия, где (i) менингококковый антиген fHBP имеет изоэлектрическую точку, которая выше, чем точка нулевого заряда адъюванта, и (ii) адсорбция происходит при величине рН, которая находится в пределах 1,2 единиц рН от точки нулевого заряда адъюванта. Величина рН в процессе адсорбции предпочтительно достигается включением буфера, который поддерживает величину рН в пределах 1,2 единиц рН от точки нулевого заряда адъюванта.

Изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей менингококковый антиген fHBP, адсорбированный на адъюванте гидроксифосфате алюминия, где (i) менингококковый антиген fHBP имеет изоэлектрическую точку, которая выше, чем точка нулевого заряда адъюванта, и (ii) композиция имеет величину рН, которая находится в пределах 1,2 единиц рН от точки нулевого заряда адъюванта. Композиция может включать буфер, который поддерживает величину рН в пределах 1,2 единиц рН от PZC адъюванта.

Изобретение, в частности, можно использовать в отношении композиций, которые включают больше одного варианта fHBP. Как указано выше, ранее сообщалось, что такие композиции не адсорбируются удовлетворительно на адъювантах на основе алюминия с фосфатными группами.

Таким образом, изобретение относится к способу адсорбирования двух различных менингококковых антигенов fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюминия, где адсорбция обоих антигенов fHBP происходит при величине рН, которая равна или ниже точки нулевого заряда гидроксифосфата алюминия. Адсорбированные антигены fHBP могут быть использованы для иммунизации против менингококковой инфекции широкого спектра. Смешивание антигенов fHBP и гидроксифосфата алюминия (и буфера) может происходить в любом подходящем порядке.

Изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей два различных менингококковых антигена fHBP, оба из которых адсорбируются на адъюванте гидроксифосфате алюминия. Композиция обычно включает буфер для контролирования величины рН в процессе и/или после адсорбции.

Изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей два различных менингококковых антигена fHBP и адъювант гидроксифосфат алюминия, где адъювант гидроксифосфат алюминия имеет точку нулевого заряда, которая выше, чем величина рН иммуногенной композиции.

Изобретение также относится к способу адсорбирования двух различных менингококковых антигенов fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюминия, где (i) оба менингококковых антигена fHBP имеют изоэлектрическую точку между 5,0 и 7,0, (ii) адъювант гидроксифосфат алюминия имеет точку нулевого заряда между 5,0 и 7,0, и (iii) адсорбция обоих антигенов fHBP происходит при величине рН между 5,0 и 7,0. Адсорбция может происходить при наличии буфера.

Изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей два различных менингококковых антигена fHBP, оба адсорбируются на адъюванте гидроксифосфате алюминия, где (i) оба менингококковых антигена fHBP имеют изоэлектрическую точку между 5,0 и 7,0, (ii) адъювант гидроксифосфат алюминия имеет точку нулевого заряда между 5,0 и 7,0. Композиция обычно включает буфер для поддержания величины рН в диапазоне между 5,0 и 7,0.

Изобретение также относится к способу адсорбирования двух различных менингококковых антигенов fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюминия, где (i) оба менингококковых антигена fHBP имеют изоэлектрические точки, которые выше, чем точка нулевого заряда адъюванта, и (ii) адсорбция каждого антигена происходит при величине рН, которая находится в пределах 1,2 единиц рН от точки нулевого заряда адъюванта. Величина рН в процессе адсорбции предпочтительно достигается включением буфера, который поддерживает величину рН в пределах 1,2 единиц рН от точки нулевого заряда адъюванта.

Изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей два различных менингококковых антигена fHBP, оба они адсорбированы на адъюванте гидроксифосфате алюминия, где (i) каждый менингококковый антиген fHBP имеет изоэлектрическую точку, которая выше, чем точка нулевого заряда адъюванта, и (ii) композиция имеет величину рН, которая находится в пределах 1,2 единиц рН от точки нулевого заряда адъюванта.

Изобретение также относится к иммуногенной композиции, полученной любым из указанных выше способов.

В композициях по изобретению каждый антиген fHBP предпочтительно адсорбируется, по меньшей мере, на 85%, как более подробно описано ниже.

Белок(ки), связывающий(е) фактор Н

Композиции по изобретению включают по меньшей мере один менингококковый белок, связывающий фактор Н (fHBP). При включении в композицию двух различных fHBP они предпочтительно представляют собой различные варианты, как описано в ссылке 8. Различные fHBP будут создавать отличающиеся иммунные ответы, которые не являются полностью перекрестно реактивными и которые обеспечивают более широкий спектр покрытия штаммов в отношении менингококков.

При содержании в композиции одного варианта fHBP она может включать один из следующих пунктов:

(а) первый полипептид, содержащий первую аминокислотную последовательность, где первая аминокислотная последовательность содержит аминокислотную последовательность, (i) имеющую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 1, по меньшей мере, а% и/или (ii) состоящую из фрагмента, по меньшей мере, х последовательных аминокислот из SEQ ID NO: 1;

(b) второй полипептид, содержащий вторую аминокислотную последовательность, где вторая аминокислотная последовательность содержит аминокислотную последовательность, (i) имеющую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 2, по меньшей мере, b% и/или (ii) состоящую из фрагмента, по меньшей мере, y последовательных аминокислот из SEQ ID NO: 2;

(с) третий полипептид, содержащий третью аминокислотную последовательность, где третья аминокислотная последовательность содержит аминокислотную последовательность, (i) имеющую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 3, по меньшей мере, с% и/или (ii) состоящую из фрагмента, по меньшей мере, z последовательных аминокислот из SEQ ID NO: 3.

При содержании в композиции двух различных менингококковых антигенов fHBP она может включать комбинацию: (i) первого и второго полипептидов, определенных выше; (ii) первого и третьего полипептидов, определенных выше; или (iii) второго и третьего полипептидов, определенных выше. Предпочтительно сочетание первого и третьего полипептида. Предпочтительна комбинация, в которой каждый из двух различных менингококковых антигенов fHBP имеет величину pI между 5,0 и 7,0 и, в частности, если они оба имеют pI в диапазоне от 5,0 до 6,0 или в диапазоне от 5,2 до 6,2.

При содержании в композиции двух различных менингококковых антигенов fHBP, несмотря на то, что некоторые последовательности у них могут быть одинаковыми, первый, второй и третий полипептиды имеют различные аминокислотные последовательности fHBP.

Полипептид, содержащий первую аминокислотную последовательность, при введении индивидууму должен вызывать антительный ответ, содержащий антитела, которые связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим растущую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20 (MC58). В некоторых вариантах осуществления некоторые или все эти антитела не связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим растущую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, или менингококковым белком дикого типа, имеющим растущую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.

Полипептид, содержащий вторую аминокислотную последовательность, при введении индивидууму должен вызывать антительный ответ, содержащий антитела, которые связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим растущую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21 (2996). В некоторых вариантах осуществления некоторые или все эти антитела не связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим растущую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, или менингококковым белком дикого типа, имеющим растущую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.

Полипептид, содержащий третью аминокислотную последовательность, при введении индивидууму должен вызывать антительный ответ, содержащий антитела, которые связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим растущую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 (M1239). В некоторых вариантах осуществления некоторые или все эти антитела не связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим растущую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, или менингококковым белком дикого типа, имеющим растущую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.

В некоторых вариантах осуществления фрагмент, по меньшей мере, из х последовательных аминокислот SEQ ID NO: 1 не присутствует при этом в SEQ ID NO: 2 или в SEQ ID NO: 3. Аналогично, фрагмент, по меньшей мере, из y последовательных аминокислот SEQ ID NO: 2 может при этом не присутствовать в SEQ ID NO: 1 или в SEQ ID NO: 3. Аналогично, фрагмент, по меньшей мере, из z последовательных аминокислот SEQ ID NO: 3 может при этом не присутствовать в SEQ ID NO: 1 или в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления при выравнивании указанного фрагмента одной из SEQ ID NO: 1-3 в виде непрерывной последовательности относительно двух других SEQ ID NO идентичность между фрагментом и каждой из двух других SEQ ID NO составляет меньше, чем 75%, например, меньше, чем 70%, меньше, чем 65%, меньше, чем 60% и т.д.

Величина а составляет, по меньшей мере, 80, например, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или больше. Величина b составляет, по меньшей мере, 80, например, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или больше. Величина c составляет, по меньшей мере, 80, например, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или больше. Величины а, b и с могут быть одинаковыми или различными. В некоторых вариантах осуществления а, b и с идентичны.

Величина х составляет, по меньшей мере, 7, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250. Величина y составляет, по меньшей мере, 7, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250. Величина z составляет, по меньшей мере, 7, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250. Величины x, y и z могут быть одинаковыми или различными. В некоторых вариантах осуществления x, y и z идентичны.

Фрагменты предпочтительно содержат эпитоп из соответствующей последовательности SEQ ID NO. У других используемых фрагментов отсутствует одна или несколько аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или больше) с С-конца и/или одна или несколько аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или больше) с N-конца соответствующей SEQ ID NO, в то же время сохраняя по меньшей мере один из таких эпитопов.

Аминокислотные последовательности, используемые по изобретению, по сравнению с SEQ ID NO: 1, 2 или 3 могут включать одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) консервативных замен аминокислот, т.е. замен одной аминокислоты на другую, которая имеет родственную боковую цепь. Генетически кодируемые аминокислоты, как правило, подразделяют на четыре семейства: (1) кислотные, т.е. аспартат, глутамат; (2) основные, т.е. лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные, т.е. аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные, т.е. глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют вместе как ароматические аминокислоты. В целом, замена единичных аминокислот в пределах этих семейств не влияет существенно на биологическую активность. Полипептиды могут иметь одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) делеций единичных аминокислот относительно эталонной последовательности. Полипептиды также могут включать одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) инсерций (например, каждой 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) относительно эталонной последовательности.

Используемая первая аминокислотная последовательность имеет идентичность с SEQ ID NO: 1, по меньшей мере, 85% (например, >95% или 100%). Другая используемая первая аминокислотная последовательность имеет идентичность с SEQ ID NO: 4, по меньшей мере, 95% (например, >98% или 100%). Другая используемая первая аминокислотная последовательность имеет идентичность с SEQ ID NO: 5, по меньшей мере, 95% (например, >98% или 100%).

Используемая третья аминокислотная последовательность имеет идентичность с SEQ ID NO: 3, по меньшей мере, 85% (например, >95% или 100%). Другая используемая третья аминокислотная последовательность имеет идентичность с SEQ ID NO: 6, по меньшей мере, 95% (например, >98% или 100%).

В частности, можно использовать комбинации, содержащие смесь первой и третьей последовательностей на основе SEQ ID NO: 4 и 6 (или близких им вариантов). Другая используемая комбинация содержит смесь первой и третьей последовательностей на основе смеси SEQ ID NO: 5 и 6 (или близких им вариантов). Таким образом, композиция может содержать полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25.

При включении в композицию двух менингококковых антигенов fHBP она может представлять собой бивалентную композицию fHBP, или может присутствовать более двух различных антигенов fHBP, например, в трехвалентной или четырехвалентной композиции fHBP.

В некоторых вариантах осуществления полипептид(ы) fHBP липидируют, например, по N-концевому цистеину. В других вариантах осуществления, тем не менее, полипептид(ы) fHBP не липидируют. В отношении липидированных fHBP, липиды, присоединенные к цистеинам, обычно будут включать пальмитоиловые остатки, например, в виде трипальмитоил-S-глицерилцистеина (Pam3Cys), дипальмитоил-S-глицерилцистеина (Pam2Cys), N-ацетила (дипальмитоил-S-глицерилцистеина) и т.д. Примерами зрелых липидированных последовательностей fHBP являются SEQ ID NO: 23 (включающая SEQ ID NO: 4), SEQ ID NO: 24 (включающая SEQ ID NO: 5) и SEQ ID NO: 25 (включающая SEQ ID NO: 6).

Введение fHBP предпочтительно будет вызывать выработку антител, которые могут связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3. Преимущественные антигены fHBP для применения по изобретению после введения индивидууму могут вызывать выработку бактерицидных антител против менингококков.

Суммарное количество полипептида fHBP обычно должно находиться между 1 и 500 мкг/доза, например между 60 и 200 мкг/доза или между 120 и 500 мкг/мл. Для каждого полипептида fHBP в дозе вакцины для человека типично количество 20, 40, 50, 60, 80, 100 или 200 мкг. Таким образом, вакцина может быть смешана так, чтобы включить это количество каждого fHBP.

При содержании в композиции различных менингококковых антигенов fHBP они могут присутствовать в виде отдельных полипептидов, описанных выше (например, первого и второго полипептидов), или они могут присутствовать в виде части одного «гибридного» полипептида, т.е. когда по меньшей мере два (например, 2, 3, 4, 5 или больше) антигена fHBP экспрессируются в виде одной полипептидной цепи, как описано для менингококковых антигенов в ссылке 12.

Гибридный полипептид может содержать два или три пункта из следующих: первую аминокислотную последовательность, определенную выше; вторую аминокислотную последовательность, определенную выше; и/или третью аминокислотную последовательность, определенную выше.

Гибридные полипептиды могут быть представлены формулой NH₂-A-{-X-L-}_n-B-COOH, где: Х представляет собой первую, вторую или третью аминокислотную последовательность, определенную выше; L представляет собой необязательную линкерную аминокислотную последовательность; А представляет собой необязательную N-концевую аминокислотную последовательность; В представляет собой необязательную С-концевую аминокислотную последовательность; n представляет собой целое число 2 или больше (например, 2, 3, 4, 5, 6 и т.д.). Обычно n равняется 2 или 3, и присутствуют по меньшей мере две из первой, второй и третьей аминокислотных последовательностей.

При наличии у -Х-фрагмента в его форме дикого типа лидерной пептидной последовательности она может быть включена в гибридный белок или опущена. В некоторых вариантах осуществления лидерные пептиды должны быть удалены за исключением лидерных пептидов -Х-фрагмента, локализованного на N-конце гибридного белка, т.е. лидерный пептид фрагмента Х₁ должен быть сохранен, но лидерные пептиды фрагментов Х₂ … X_n должны быть опущены. Это равнозначно удалению всех лидерных пептидов и использованию лидерного пептида фрагмента Х₁ в качестве фрагмента -А-.

Для каждого n примера {-X-L} линкерная аминокислотная последовательность -L- может присутствовать или отсутствовать. Например, при n=2 гибрид может представлять собой NH₂-X₁-L₁-X₂-L₂-COOH, NH₂-X₁-X₂-COOH, NH₂-X₁-L₁-X₂-COOH, NH₂-X₁-X₂-L₂-COOH и т.д. Линкерная(ые) аминокислотная(ые) последовательность(и) -L- обычно будет(ут) короткой(ими) (например, 20 или меньше аминокислот, т.е. 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). К примерам относятся короткие пептидные последовательности, которые содействуют клонированию, полиглициновые линкеры (например, содержащие Gly_n, где n=2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше) и гистидиновые хвосты (т.е. His_n, где n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше). Другие подходящие линкерные аминокислотные последовательности будут очевидны специалисту в данной области. Используемым линкером является GSGGGG (SEQ ID NO: 15) или GSGSGGGG (SEQ ID NO: 16), причем дипептид Gly-Ser образуется из сайта рестрикции BamHI, таким образом содействуя клонированию и воздействию, и типичным полиглициновым линкером является тетрапептид (Gly)₄. Другим подходящим линкером, в частности для применения в качестве конечного L_n, является дипептид Leu-Glu.

-А- представляет собой необязательную N-концевую аминокислотную последовательность. Обычно она должна быть короткой (например, 40 или меньше аминокислот, т.е. 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). К примерам относятся лидерные последовательности для направленного транспорта белка или короткие пептидные последовательности, которые содействуют клонированию или очистке (например, гистидиновые хвосты, т.е. His_n, где n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше). Другие подходящие N-концевые аминокислотные последовательности будут очевидны специалистам в данной области. При отсутствии у Х₁ его собственного N-концевого метионина -А- предпочтительно представляет собой олигопептид (например, с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислотами), который создает N-концевой метионин, например, Met-Ala-Ser, или один остаток Met.

-В- представляет собой необязательную С-концевую аминокислотную последовательность. Обычно она должна быть короткой (например, 40 или меньше аминокислот, т.е. 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). К примерам относятся последовательности для направленного транспорта белка, короткие пептидные последовательности, которые содействуют клонированию или очистке (например, содержащие гистидиновые хвосты, т.е. His_n, где n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше, такие как SEQ ID NO: 17), или последовательности, которые усиливают стабильность белка. Другие подходящие С-концевые аминокислотные последовательности будут очевидны специалистам в данной области.

Адъюванты гидроксифосфаты алюминия и адсорбция

Композиции по изобретению включают адъювант гидроксифосфат алюминия. Такие адъюванты часто обозначаются для удобства как «фосфат алюминия» [13], несмотря на то, что гидроксифосфаты могут отличаться от строгого AlPO₄ наличием гидроксильных групп. Например, IR полоса спектра при 3164 см^-1 (например, при нагреве до 200°С) указывает на наличие структурных гидроксилов. Адъювант гидроксифосфат алюминия может содержать небольшое количество сульфата (т.е. гидроксифосфат-сульфат алюминия), а также может включать ионы натрия и/или хлорида [14]. Адъювант может быть получен осаждением.

Гидроксифосфат алюминия не является стехиометрическим соединением и его гидроксильный и фосфатный состав зависит от реактантов и условий осаждения. Этот гидроксильный/фосфатный состав влияет на точку нулевого заряда адъюванта (PZC; величина рН, при которой поверхность имеет нулевой заряд). PZC обратно пропорциональна степени замещения фосфата гидроксилом (молярное соотношение Р/Al). Замена фосфатных анионов гидроксильными анионами снижает PZC. Таким образом, PZC может быть изменена за счет изменения концентрации свободных фосфатных ионов в растворе (больше фосфата = более кислая PZC) или добавления буфера, такого как гистидиновый буфер (делает PZC более основной). Гидроксифосфаты алюминия по изобретению обычно имеют PZC между 5,0 и 6,6, например, между 5,4 и 6,2.

Молярное соотношение Р/Al адъюванта гидроксифосфата алюминия, как правило, будет находиться между 0,3 и 1,2, предпочтительно между 0,8 и 1,2 или между 0,85 и 1,0 и более предпочтительно около 0,9. Молярное соотношение Р/Al, по меньшей мере, 0,5 может привести к получению адъюванта с большим сроком годности.

Гидроксифосфат алюминия обычно будет аморфным (т.е. аморфным для рентгеновского излучения). Как правило, он будет дисперсным (например, пластинчатой морфологии, как видно на микрофотографиях, полученных с помощью трансмиссионного электронного микроскопа). Типичные диаметры пластин составляют 10-100 нм, и они образуют агрегаты размером 0,5-20 мкм (например, около 1-10 мкм). Для адъювантов гидроксифосфатов алюминия было сообщено об адсорбционной способности между 0,7-1,5 мг белка на мг Al⁺⁺⁺ при величине рН 7,4.

Характерный адъювант представляет собой аморфный гидроксифосфат алюминия с молярным соотношением Р/Al между 0,84 и 0,92, и этот адъювант может быть включен в количестве 0,6 мг Al³⁺/мл.

Концентрация Al⁺⁺⁺ в композиции для введения пациенту предпочтительно составляет меньше, чем 5 мг/мл, например, ≤4 мг/мл, ≤3 мг/мл, ≤2 мг/мл, ≤1 мг/мл и т.д. Предпочтительный диапазон составляет между 0,2 и 1 мг/мл. Предпочтительна максимальная концентрация Al⁺⁺⁺ 0,85 мг/доза.

В композиции по изобретению на гидроксифосфате алюминия адсорбируется, по меньшей мере, 85% (масс.) fHBP, например, ≥90%, ≥95% или даже 100%. Доля адсорбированного fHBP может контролироваться по изменению концентрации соли и/или величины рН в процессе смешивания, например, в целом, более высокая концентрация NaCl может снижать адсорбцию fHBP. Количество адсорбции для любой препаративной формы будет зависеть от сочетания параметров, к которым относятся PZC адъюванта, концентрация соли и величина рН в процессе смешивания, концентрация адъюванта, концентрация антигена и pI антигена. Вклад каждого из этих параметров в адсорбцию может быть без труда оценен. Степень адсорбции может быть определена сравнением суммарного количества антигена fHBP в композиции (например, измеренного перед адсорбцией, или измеренного по десорбции адсорбированного антигена) с количеством, которое остается в супернатанте после центрифугирования (например, см. главу 4 ссылки 15). Отсутствие детектируемого антигена в супернатанте после центрифугирования указывает на то, что произошла полная адсорбция, т.е. весь fHBP находится в осадке, который содержит нерастворимый адъювант и адсорбированное на нем содержимое.

Известно о применении в одной вакцине смесей различных солей алюминия, например, см. ссылку 16. Несмотря на то, что с fHBP могут быть использованы адъюванты, включая как гидроксифосфат, так и гидроксид алюминия, предпочтительно, чтобы композиция вообще не включала адъюванта гидроксида алюминия, поскольку, как описано выше, он может разрушать некоторые антигены, которые могут быть смешаны с fHBP (в частности, конъюгированные бактериальные капсульные сахариды).

По первому аспекту авторы изобретения обнаружили, что белки fHBP могут быть эффективно адсорбированы на адъюванте гидроксифосфате алюминия, если обеспечить, чтобы адсорбция происходила при величине рН, которая равна или ниже PZC адъюванта. Таким образом, может быть выбран адъювант с PZC, равной или выше желаемой величины рН смешивания, или иначе может быть выбрана величина рН, равная или ниже желательной PZC адъюванта. Адъювант и антиген объединяют при этих условиях, и происходит адсорбция. Величина рН не должна быть такой низкой, чтобы предотвратить адсорбцию или необратимо денатурировать fHBP. Таким образом, оптимально адсорбция происходит в 2 единицах рН (оптимально в 1,2 единицах рН) от PZC.

По второму аспекту авторы изобретения обнаружили, что белки fHBP могут быть эффективно адсорбированы на адъюванте гидроксифосфате алюминия, используя менингококковый антиген fHBP с изоэлектрической точкой между 5,0 и 7,0 и адъювант гидроксифосфат алюминия с точкой нулевого заряда также между 5,0 и 7,0. Адсорбция происходит при величине рН между 5,0 и 7,0, и рН может поддерживаться (перед, в процессе и/или после адсорбции) включением буфера для поддержания рН в диапазоне между 5,0 и 7,0. В диапазоне рН между 5,0 и 7,0 предпочтительный поддиапазон составляет от 5,0 до 6,0. Второй аспект не подходит для всех fHBP, поскольку некоторые из них (например, SEQ ID NO: 20) имеют pI вне требуемого диапазона, но подходящие fHBP могут быть выбраны без труда.

Изоэлектрическая точка fHBP может быть определена эмпирически с помощью техники, такой как изоэлектрическое фокусирование. Более принято, тем не менее, чтобы изоэлектрическая точка представляла собой теоретическую изоэлектрическую точку. Она может быть рассчитана, используя величины рКа аминокислот, описанные в ссылке 17, например, используя соответствующее средство ExPASy [18]. Например, растущая аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 20 имеет предполагаемую pI 7,72, тогда как SEQ ID NO: 21 и 22 имеют предполагаемые pI 5,87 и 6,15. Все зрелые последовательности SEQ ID NO: 23, 24 и 25 (содержащие SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно) имеют предполагаемую pI в соответствующем диапазоне: 5,46, 5,72 и 5,86, соответственно. Поправка на заблокированный N-концевой амин (например, при липидировании) снижает величину pI на около 0,1, но SEQ ID NO: 23, 24 и 25 все же имеют предполагаемые pI в диапазоне от 5,0 до 6,0. Предпочтительны комбинации, когда каждый отличный менингококковый антиген fHBP имеет pI между 5,0 и 7,0 и, в частности, когда они оба имеют pI в диапазоне от 5,0 до 6,0 или в диапазоне от 5,2 до 6,2.

Используемая комбинация антигенов fHBP с величинами pI в подходящем диапазоне может содержать смесь первой и третьей последовательностей на основе SEQ ID NO: 4 и 6 (или близких им вариантов) или смесь первой и третьей последовательностей на основе SEQ ID NO: 5 и 6 (или близких им вариантов). Дополнительные подробности таких совмещений антигенов предложены выше. Например, комбинация SEQ ID NO: 23 и 25 является особенно используемой, и эти два белка могут быть липидированы (как описано выше).

По третьему аспекту авторы изобретения обнаружили, что менингококковый антиген fHBP с величиной pI выше, чем PZC адъюванта гидроксифосфата алюминия, может быть эффективно адсорбирован при условии, если адсорбция будет происходить при величине рН в пределах 1,2 единиц рН от PZC. Адсорбция может происходить при величине рН выше или ниже PZC адъюванта, тем не менее рН не должен быть настолько предельным, чтобы необратимо разрушить fHBP. Величина рН в процессе адсорбции предпочтительно достигается включением буфера, который поддерживает рН в пределах 1,2 единиц рН от PZC адъюванта. При нахождении величины рН в пределах 1,2 единиц рН она может находиться в пределах 1 единицы рН или меньше, например, в пределах 0,8 единиц рН, в пределах 0,6 единиц рН или в пределах 0,5 единиц рН.

Порядок смешивания

Как указано выше, изобретение относится к способу адсорбирования менингококкового антигена fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюминия. Смешивание антигена(ов) fHBP, гидроксифосфата алюминия и любого буфера может происходить в любом подходящем порядке либо объединением всех компонентов, взятых по отдельности, либо предварительным смешиванием двух компонентов и затем смешиванием предварительной смеси с третьим компонентом.

Таким образом, например, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу получения иммуногенной композиции, содержащей менингококковый антиген fHBP, содержащему стадию объединения менингококкового антигена fHBP и адъюванта гидроксифосфата алюминия, где: (i) адъювант гидроксифосфат алюминия имеет точку нулевого заряда; и (ii) стадия объединения происходит при величине рН ниже, чем данная точка нулевого заряда, так что антиген fHBP адсорбируется на адъюванте.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу получения иммуногенной композиции, содержащей менингококковый антиген fHBP, содержащему стадию объединения менингококкового антигена fHBP и адъюванта гидроксифосфата алюминия, где: (i) адъювант гидроксифосфат алюминия имеет точку нулевого заряда; и (ii) композиция имеет величину рН ниже, чем данная точка нулевого заряда, так что антиген fHBP адсорбируется на адъюванте.

В другом варианте осуществления изобретение от