Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения

Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ

По заявке, не являющейся временной, поданной согласно 37 CFR §1.53(b), испрашивается приоритет согласно 35 USC §119(e) по временной заявке США с серийным номером No. 60/950088, поданной 16 июля 2007 года, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям, подходящим для лечения гемопоэтической опухоли у млекопитающих, и к способам применения этих композиций.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Злокачественные опухоли (рак) являются второй из ведущих причин смертности в США, после заболеваний сердца (Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43:7 (1993)). Злокачественная опухоль характеризуется повышением количества аномальных, или неопластических, клеток, происходящих из нормальной ткани, которые пролиферируют с образованием опухолевой массы, инвазией этих неопластических опухолевых клеток в соседние ткани, и образованием злокачественных клеток, которые в конечном итоге распространяются через кровь или лимфатическую систему в региональные лимфатические узлы и в отдаленные участки в результате процесса, называемого метастазированием. В злокачественном состоянии клетка пролиферирует в условиях, при которых нормальные клетки не растут. Злокачественная опухоль проявляется множеством форм, характеризующихся различными степенями инвазивности и агрессивности.

Злокачественные опухоли, которые вовлекают клетки, образованные в ходе гемопоэза - процесса, посредством которого образуются клеточные элементы крови, такие как лимфоциты, лейкоциты, тромбоциты, эритроциты и естественные киллеры - называют гемопоэтическими злокачественными опухолями. Лимфоциты, которые могут находиться в крови и лимфатической ткани и являются важными для иммунного ответа, подразделяют на два основных класса лимфоцитов: B-лимфоциты (B-клетки) и T-лимфоциты (T-клетки), которые опосредуют гуморальный и клеточно-опосредуемый иммунитет, соответственно.

B-клетки созревают в костном мозге и покидают костный мозг, экспрессируя связывающее антиген антитело на их клеточной поверхности. Когда наивная B-клетка впервые встречает антиген, к которому ее мембраносвязанное антитело является специфичным, клетка начинает быстро делиться и ее потомство дифференцируется в B-клетки памяти и эффекторные клетки, называемые "плазматическими клетками". B-клетки памяти обладают большей продолжительностью жизни и продолжают экспрессировать мембраносвязанное антитело с той же специфичностью, что и исходная родительская клетка. Плазматические клетки не продуцируют мембраносвязанное антитело, вместо этого, они продуцируют антитело в форме, которая может секретироваться. Секретируемые антитела являются основной эффекторной молекулой для гуморального иммунитета.

Связанные с B-клетками нарушения включают, но не ограничиваются ими, злокачественную лимфому (неходжкинскую лимфому, NHL), множественную миелому (MM) и хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL, B-клеточный лейкоз (CD5+ B-лимфоциты). Неходжскинские лимфомы (NHL), гетерогенная группа злокачественных опухолей, главным образом, возникающих из B-лимфоцитов, составляют приблизительно 4% от всех вновь диагностируемых опухолей (Jemal, A. et al., CA-Cancer J Clin., 52: 23-47 (2002)). Агрессивная NHL составляет приблизительно 30-40% взрослой NHL (Harris, N.L. et al., Hematol. J., 1:53-66 (2001)) и включает диффузную B-крупноклеточную лимфому (DLBCL), лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), периферическую T-клеточную лимфому и анапластическую крупноклеточную лимфому. Комбинированная химиотерапия первой линии обеспечивает излечение менее чем половины пациентов с агрессивной NHL, и большинство пациентов в конечном итоге погибают от этого заболевания (Fischer, R.I., Semin. Oncol., 27 (suppl 12): 2-8 (2000)).

T-клетки созревают в тимусе, который обеспечивает окружающую среду для пролиферации и дифференцировки незрелых T-клеток. В ходе созревания T-клеток, T-клетки претерпевают реаранжировки генов, в результате которых образуется T-клеточный рецептор, и положительную и отрицательную селекцию, которая помогает определить фенотип клеточной поверхности зрелой T-клетки. Характерными маркерами клеточной поверхности зрелых T-клеток являются комплекс CD3:T-клеточный рецептор и один из корецепторов, CD4 или CD8.

В попытках найти эффективные клеточные мишени для терапии злокачественных опухолей исследователи проводили поиск в целях идентификации трансмембранных или иным образом ассоциированных с мембраной полипептидов, которые специфично экспрессируются на поверхности одного или нескольких конкретного типа(ов) злокачественных клеток по сравнению с одной или несколькими нормальной незлокачественной клеткой(ами). Часто, такие ассоциированные с мембраной полипептиды в большем количестве экспрессируются на поверхности злокачественных клеток по сравнению с поверхностью незлокачественных клеток. Идентификация таких ассоциированных с опухолью антигенных полипептидов клеточной поверхности обеспечила возможность специфического нацеливания злокачественных клеток на уничтожение посредством терапии на основе антител. В этом отношении, отмечается, что было выяснено, что терапия на основе антител является высоко эффективной при лечении определенных злокачественных опухолей. Например, HERCEPTIN® и RITUXAN® (оба от Genentech Inc., South San Francisco, California) представляют собой антитела, которые успешно используют для лечения рака молочной железы и неходжскинской лимфомы, соответственно. Более конкретно, HERCEPTIN® представляет собой рекомбинантное образованное из ДНК гуманизированное моноклональное антитело, которое селективно связывается с протоонкогеном внеклеточного домена рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER2). Сверхэкспрессия белка HER2 наблюдается в 25-30% случаев первичного рака молочной железы. RITUXAN® представляет собой полученное способами генетической инженерии химерное моноклональное антитело мыши/человека, направленное против антигена CD20, находящегося на поверхности нормальных и злокачественных B-лимфоцитов. Оба эти антитела рекомбинантно продуцируют в клетках CHO.

В других попытках выяснить эффективные клеточные мишени для терапии злокачественной опухоли, исследователи провели поиск, чтобы идентифицировать (1) не ассоциированные с мембраной полипептиды, которые специфично продуцируются одним или несколькими конкретным типом(ами) злокачественной клетки(ок) по сравнению с одним или несколькими конкретным типом(ами) незлокачественной нормальной клетки(ок), (2) полипептиды, которые продуцируются злокачественными клетками на уровне экспрессии, который значимо превышает уровень экспрессии одной или нескольких нормальной незлокачественной клетки(ок), или (3) полипептиды, экспрессия которых по существу ограничивается до только одного (или очень ограниченного количества отличающихся) типа ткани(ей) как в злокачественном, так и в незлокачественном состоянии (например, нормальная ткань предстательной железы и опухолевая ткань предстательной железы). Такие полипептиды могут оставаться расположенными внутриклеточно или они могут секретироваться злокачественной клеткой. Более того, такие полипептиды могут экспрессироваться не самой злокачественной клеткой, а, вместо этого, клетками, которые продуцируют и/или секретируют полипептиды, обладающие эффектом стимуляции или усиления роста злокачественных клеток. Такие секретируемые полипептиды часто представляют собой белки, которые обеспечивают злокачественным клеткам преимущество при росте относительно нормальных клеток, и включают, например, такие полипептиды как ангиогенные факторы, факторы клеточной адгезии, факторы роста и т.п. Можно ожидать, что идентификация антагонистов таких не ассоциированных с мембраной полипептидов может служить в качестве эффективных лекарственных средств для лечения таких злокачественных опухолей. Более того, идентификация особенностей экспрессии таких полипептидов может быть полезной для диагностики конкретных злокачественных опухолей у млекопитающих.

Несмотря на указанные выше достижения в терапии злокачественных опухолей млекопитающих, существует существенная необходимость в дополнительных лекарственных средствах, способных детектировать наличие опухоли у млекопитающего, и в эффективном ингибировании неопластического роста клеток, соответственно. Таким образом, задачей настоящего изобретения является идентификация полипептидов, ассоциированных с клеточной мембраной, секретируемых или внутриклеточных полипептидов, экспрессия которых специфично ограничена только одним (или очень ограниченным количеством различных) типом(ами) ткани, гемопоэтическими тканями, как в злокачественном, так и в незлокачественном состоянии, и применение этих полипептидов и кодирующих их нуклеиновых кислот для получения композиций, подходящих для медикаментозного лечения и/или детекции гемопоэтической злокачественной опухоли у млекопитающих.

CD79 представляет собой компонент передачи сигнала B-клеточным рецептором, состоящий из ковалентного гетеродимера, содержащего CD79a (Igα, mb-1) и CD79b (Igβ, B29). Как CD79a, так и CD79b, содержат внеклеточный иммуноглобулиновый домен (Ig), трансмембранный домен, домен внутриклеточной передачи сигнала, домен иммунорецепторного тирозин-связывающего активаторного мотива (ITAM). CD79 экспрессируется на B-клетках и в клетках неходжкинской лимфомы (NHL) (Cabezudo et al., Haematologica, 84:413-418 (1999); D'Arena et al., Am. J. Hematol, 64: 275-281 (2000); Olejniczak et al., Immunol. Invest, 35: 93-114 (2006)). Все из CD79a и CD79b и sIg требуются для экспрессии на поверхности CD79 (Matsuuchi et al., Curr. Opin. Immunol, 13(3): 270-7)). Средняя экспрессия на поверхности CD79b на NHL сходна с поверхностной экспрессией на нормальных B-клетках, но ее уровень выше (Matsuuchi et al., Curr. Opin. Immunol, 13(3): 270-7 (2001)).

С учетом экспрессии CD79b, является полезным получение терапевтических антител к антигену CD79b, которые создают минимальную антигенность, или не создают ее, при введении пациентам, особенно при длительном лечении. Настоящее изобретение удовлетворяет эту и другие необходимости. Настоящее изобретение относится к антителам против CD79b, которые преодолевают ограничения современных терапевтических композиций, а также обеспечивают дополнительные преимущества, которые станут очевидными из подробного описания, ниже.

Применение конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC), т.е. иммуноконъюгатов, для местной доставки цитотоксических и цитостатических средств, т.е. лекарственных средств для уничтожения или ингибирования опухолевых клеток при лечении злокачественной опухоли (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26: 151-172; US 4975278) позволяет нацеленную доставку группы лекарственного средства в опухоли, и внутриклеточное накопление в них, где системное введение этих неконъюгированных лекарственных средств может приводить к неприемлемым уровням токсичности в нормальных клетках, помимо опухолевых клеток, подлежащих устранению (Baldwin et al. (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). Попытки повысить терапевтический индекс, т.е. максимальную эффективность и минимальную токсичность ADC, сфокусированы на селективности поликлональных (Rowland et al. (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87) и моноклональных антител (mAb), а также на свойствах связывания лекарственных средств и высвобождения лекарственных средств (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549). Группы лекарственных средств, используемые в конъюгатах антитело-лекарственное средство, включают белковые токсины бактерий, такие как дифтерийный токсин, белковые токсины растений, такие как рицин, низкомолекулярные соединения, такие как ауристатины, гелданамицин (Mandler et al. (2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), майтанзиноиды (EP 1391213; Liu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), калихеамицин (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342), дауномицин, доксорубицин, метотрексат и виндезин (Rowland et al. (1986), выше). Группы лекарственных средств могут влиять на цитотоксические и цитостатические механизмы, включая связывание тубулина, связывание ДНК или ингибирование топоизомеразы. Некоторые цитотоксические лекарственные средства имеют тенденцию к инактивации или снижению активности при конъюгировании с крупными антителами или белковыми лигандами рецепторов.

Пептиды ауристатина, ауристатин E (AE) и монометилауристатин (MMAE), синтетические аналоги доластатина (WO 02/088172), конъюгируют в качестве групп лекарственного средства с: (i) химерными моноклональными антителами cBR96 (специфичными к Lewis Y на карциномах); (ii) cAC10, которое является специфичным к CD30 на гематологических злокачественных опухолях (Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773; Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784; Francisco et al. (2003) Blood 102(4):1458-1465; US 2004/0018194; (iii) антителами против CD20, такими как ритуксан (WO 04/032828) для лечения экспрессирующих CD20 опухолей и иммунных нарушений; (iv) антителом против EphB2R 2H9 для лечения рака ободочной и прямой кишки (Mao et al. (2004) Cancer Research 64(3):781-788); (v) антителом против E-селектина (Bhaskar et al. (2003) Cancer Res. 63:6387-6394); (vi) трастузумабом (HERCEPTIN®, US 2005/0238649), и (vi) антителами против CD30 (WO 03/043583). Варианты ауристатина E описаны в US 5767237 и US 6124431. Монометилауристатин E, конъюгированный с моноклональными антителами, описан в Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, представленной 28 марта 2004 года. Аналоги ауристатина MMAE и MMAF конъюгируют с различными антителами (US 2005/0238649).

Общепринятые способы присоединения, т.е. связывания ковалентными связями, группы лекарственного средства с антителом, как правило, приводят к гетерогенной смеси молекул, где группа лекарственного средства связана с несколькими участками антитела. Например, цитотоксические лекарственные средства, как правило, конъюгируют с антителами через часто многочисленные остатки лизина антитела, с образованием гетерогенной смеси антитело-лекарственное средство. В зависимости от условий реакции, гетерогенная смесь, как правило, содержит антитела с диапазоном связанных с ним групп лекарственного средства от 0 до 8 или более. Кроме того, в каждой подгруппе конъюгатов с конкретным числовым отношением групп лекарственного средства к антителу находится потенциально гетерогенная смесь, где группа лекарственного средства связана с различными участками антитела. Аналитические и препаративные способы могут быть недостаточными для разделения и охарактеризации типов молекул конъюгата антитело-лекарственное средство в гетерогенной смеси, полученной при реакции конъюгации. Антитела представляют собой крупные, комплексные и структурно разнообразные биомолекулы, часто со множество реакционно-способных функциональных групп. Их реакционная способность к линкерным реагентам и промежуточным соединениям лекарственное средство-линкер зависят от таких факторов, как pH, концентрация, концентрация соли и сорастворители. Более того, многостадийный процесс конъюгации может быть невоспроизводимым вследствие трудности контроля условий реакции и охарактеризации реагентов и промежуточных соединений.

Тиольные группы цистеина являются реакционно-способными при нейтральных значениях pH, в отличие от большинства аминов, которые являются протонированными и менее нуклеофильными при pH около 7. Поскольку свободные тиольные (RSH, сульфгидрильные) группы являются относительно реакционно-способными, белки с остатками цистеина часто находятся в окисленной форме в качестве связанных дисульфидом олигомеров или обладают дисульфидными группами со внутренними мостиками. Внеклеточные белки, как правило, не имеют свободных тиолов (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London, page 55). Тиольные группы цистеина антител, как правило, являются более реакционно-способными, т.е. более нуклеофильными, в отношении электрофильных реагентов для конъюгации, чем аминогруппы или гидроксильные группы антитела. Остатки цистеина встраивали в белки способами генетической инженерии для образования ковалентных связей с лигандами или для образования новых внутримолекулярных дисульфидных связей (Better et al. (1994) J. Biol. Chem. 13:9644-9650; Bernhard et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; Greenwood et al. (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255; Tu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862-4867; Kanno et al. (2000) J. of Biotechnology, 76:207-214; Chmura et al. (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(15):8480-8484; US 6248564). Однако встраивание тиольных групп цистеина путем мутации различных аминокислотных остатков белка на остатки аминокислоты цистеина является потенциально проблематичной, в частности в случае неспаренных (свободных Cys) остатков или остатков, которые являются относительно доступными для реакции или окисления. В концентрированных растворах белка, как в периплазме E. coli, так и в культуральных супернатантах, или в частично или полностью очищенном белке, неспаренные остатки Cys на поверхности белка могут образовывать пары и окисляться с образованием межмолекулярных дисульфидов, и, таким образом, димеров или мультимеров белков. Образование дисульфидного димера делает новый Cys нереакционно-способным для конъюгации с лекарственным средством, лигандом или другой меткой. Более того, если белок окислительным путем образует внутримолекулярную дисульфидную связь между вновь конструированным остатком Cys и существующим остатком Cys, обе тиольные группы Cys являются недоступными для участия и взаимодействий в активном центре. Более того, белок может стать неактивным или неспецифическим вследствие неправильного сворачивания или утраты третичной структуры (Zhang et al. (2002) Anal. Biochem. 311: 1-9).

Антитела со встроенными в них остатками цистеина конструируют в качестве FAB-фрагментов антител (тио-Fab) и экспрессируют в качестве полноразмерных моноклональных антител IgG (тио-Mab) (Junutula, J. R. et al. (2008) J Immunol Methods 332:41-52; US 2007/0092940, содержание которых включено в настоящий документ в качестве ссылок). Антитела тио-Fab и тио-Mab конъюгируют через линкеры на вновь внесенных тиольных группах цистеина с помощью реакционно-способных к тиолу линкерных реагентов и реагентов лекарственное средство-линкер с получением конъюгатов антитело-лекарственное средство (тио-ADC).

Все ссылки, цитированные в настоящем документе, включая патентные заявки и публикации, включены в качестве ссылок в полном объеме.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к антителам против CD79b или их функциональным фрагментам, и к способу их применения для лечения гемопоэтических опухолей.

В одном аспекте изобретение относится к антителу, которое связывается, предпочтительно специфично, с любым из описанных выше или ниже полипептидов. Необязательно, антитело представляет собой моноклональное антитело, фрагмент антитела, включая Fab-, Fab'-, F(ab')₂- и Fv-фрагмент, диатело (diabody), однодоменное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, одноцепочечное антитело или антитело, которое конкурентно ингибирует связывание антитела против полипептида CD79b с его соответствующим антигенным эпитопом. Антитела по настоящему изобретению необязательно можно конъюгировать с ингибирующим рост средством или цитотоксическим средством, таким как токсин, включая, например, ауристатин, майтанзиноид, производное долостатина или калихеамицин, антибиотик, радиоактивный изотоп, нуклеолитический фермент или сходные с ними. Антитела по настоящему изобретению необязательно можно продуцировать в клетках CHO или в бактериальных клетках, и предпочтительно они индуцируют гибель клетки, с которой они связываются. Для целей детекции, антитела по настоящему изобретению можно метить поддающейся детекции меткой, связывать с твердой подложкой или сходные с ними.

В одном аспекте изобретение относится к гуманизированному антителу против CD79b, где одновалентная аффинность (например, аффинность антитела в виде Fab-фрагмента к CD79b) или аффинность антитела к CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела в виде фрагмента IgG к CD79b) является по существу такой же как, более низкой или более высокой чем, одновалентная аффинность или аффинность в двухвалентной форме, соответственно, антитела мыши (например, аффинность антитела мыши в виде Fab-фрагмента или в виде фрагмента IgG к CD79b) или химерного антитела (например, аффинность химерного антитела в виде Fab-фрагмента или в виде фрагмента IgG к CD79b), содержащему последовательность вариабельного домена легкой цепи и тяжелой цепи, как представлено на фигуре 7 (SEQ ID NO:10) и фигурах 8A-B (SEQ ID NO:14), состоящему или по существу состоящему из них.

В другом аспекте изобретение относится к гуманизированному антителу против CD79b, где аффинность антитела в его двухвалентной форме к CD79b (например, аффинность антитела в виде IgG к CD79b) составляет 2,0 нМ.

В одном аспекте предусмотрено антитело, которое связывается с CD79b, где антитело содержит: (a) по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из группы, состоящей из:

(i) HVR-L1, содержащей последовательность A1-A15, где A1-A16 представляет собой KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO:59)

(ii) HVR-L2, содержащей последовательность B1-B7, где B1-B7 представляет собой LVSKLDS (SEQ ID NO:60)

(iii) HVR-L3, содержащей последовательность C1-C9, где C1-C9 представляет собой WQGTHFPYT (SEQ ID NO:61)

(iv) HVR-H1, содержащей последовательность D1-D10, где D1-D10 представляет собой GYTFTSYWMN (SEQ ID NO:62)

(v) HVR-H2, содержащей последовательность E1-E18, где E1-E18 представляет собой GMIDPSDSETHYNHIFKD (SEQ ID NO:63) и

(vi) HVR-H3, содержащей последовательность F1-F6, где F1-F10 представляет собой ARNLYL (SEQ ID NO:64).

В одном аспекте предусмотривается антитело, которое связывается с CD79b, где антитело содержит по меньшей мере один вариант HVR, где вариант последовательности HVR содержит модификацию по меньшей мере одного остатка последовательности, представленного в SEQ ID NO: 59, 60, 61, 62, 63 или 64.

В одном аспекте изобретение относится к антителу, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC, представленную на фигуре 13 (SEQ ID NO:31-33).

В одном аспекте изобретение относится к антителу, содержащему вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC, представленную на фигуре 13 (SEQ ID NO:23-25).

В одном аспекте изобретение относится к антителу против CD79b, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO:16. В другом аспекте изобретение относится к антителу против CD79b, содержащему вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO:12.

В одном аспекте изобретение относится к антителу против CD79b со встроенными в него остатками цистеина, содержащему один или несколько остатков аминокислоты цистеина и последовательность, выбранную из SEQ ID NO:91-122. Антитело против CD79b со встроенными в него остатками цистеина может связываться с полипептидом CD79b. Антитело против CD79b со встроенными в него остатками цистеина можно получать посредством процесса, включающего замену одного или нескольких аминокислотных остатков исходного антитела против CD79b цистеином.

В одном аспекте изобретение относится к антителу против CD79b со встроенными в него остатками цистеина, содержащему один или несколько свободных остатков аминокислоты цистеина, где антитело против CD79b со встроенными в него остатками цистеина связывается с полипептидом CD79b и получено путем процесса, включающего замену одного или нескольких аминокислотных остатков исходного антитела против CD79b цистеином, где исходное антитело содержит по меньшей мере одну последовательность HVR, выбранную из:

(a) HVR-L1, содержащей последовательность A1-A15, где A1-A16 представляет собой KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO:59);

(b) HVR-L2, содержащей последовательность B1-B7, где B1-B7 представляет собой LVSKLDS (SEQ ID NO:60);

(c) HVR-L3, содержащей последовательность C1-C9, где C1-C9 представляет собой WQGTHFPYT (SEQ ID NO:61) или FQGTHFPFT (SEQ ID NO:79);

(d) HVR-H1, содержащей последовательность D1-D10, где D1-D10 представляет собой GYTFTSYWMN (SEQ ID NO:62);

(e) HVR-H2, содержащей последовательность E1-E18 где E1-E18 представляет собой GMIDPSDSETHYNHIFKD(SEQ ID NO:63); и

(f) HVR-H3, содержащей последовательность F1-F6, где F1-F10 представляет собой ARNLYL (SEQ ID NO:64).

Антитело против CD79b со встроенными в него остатками цистеина может представлять собой моноклональное антитело, фрагмент антитела, химерное антитело, гуманизированное антитело, одноцепочечное антитело или антитело, которое конкурентно ингибирует связывание антитела против полипептида CD79b с его соответствующим антигенным эпитопом. Антитела по настоящему изобретению необязательно можно конъюгировать с ингибирующим рост средством или цитотоксическим средством, таким как токсин, включая, например, ауристатин или майтанзиноид. Антитела по настоящему изобретению необязательно можно продуцировать в клетках CHO или бактериальных клетках, и предпочтительно они ингибируют рост или пролиферацию клетки, с которой они связываются, или индуцируют ее гибель. Для диагностических целей, антитела по настоящему изобретению можно метить поддающейся детекции меткой, связывать с твердой подложкой, или сходные с ними.

В одном аспекте изобретение относится к способам получения антитела по изобретению. Например, изобретение относится к способу получения антитела против CD79b (которое, как определено в настоящем документе, включает интактное антитело и его фрагменты), причем указанный способ включает экспрессию в подходящей клетке-хозяине рекомбинантного вектора по изобретению, кодирующего указанное антитело (или его фрагмент), и выделение указанного антитела.

В одном аспекте изобретение относится к фармацевтическому составу, содержащему антитело по изобретению или конъюгат антитело-лекарственное средство по изобретению, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или эксципиент.

В одном аспекте изобретение относится к изделию, содержащему контейнер; и композиции, находящейся в контейнере, где композиция содержит одно или несколько антител против CD79b по изобретению.

В одном аспекте изобретение относится к набору, содержащему первый контейнер, содержащий композицию, содержащую одно или несколько антител против CD79b по изобретению; и второй контейнер, содержащий буфер.

В одном аспекте изобретение относится к применению антитела против CD79b по изобретению для изготовления лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение.

В одном аспекте изобретение относится к применению изделия по изобретению для изготовления лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение.

В одном аспекте изобретение относится к применению набора по изобретению для изготовления лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение.

В одном аспекте изобретение относится к способу ингибирования роста клетки, которая экспрессирует CD79b, причем указанный способ включает контактирование указанной клетки с антителом по изобретению, тем самым вызывая ингибирование роста указанной клетки. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с ингибирующим рост средством.

В одном аспекте изобретение относится к способу медикаментозного лечения млекопитающего, имеющего злокачественную опухоль, содержащую клетку, которая экспрессирует CD79b, причем указанный способ включает введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела по изобретению, тем самым эффективно осуществляя лечение указанного млекопитающего. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с ингибирующим рост средством.

В одном аспекте изобретение относится к способу лечения или профилактики клеточно-пролиферативного нарушения, связанного с повышенной экспрессией CD79b, причем указанный способ включает введение индивиду, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества антитела по изобретению, тем самым эффективно осуществляя лечение или профилактику указанного клеточно-пролиферативного нарушения. В одном варианте осуществления, указанное пролиферативное нарушение представляет собой злокачественную опухоль. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с ингибирующим рост средством.

В одном аспекте изобретение относится к способу ингибирования роста клетки, где рост указанной клетки по меньшей мере частично зависит от эффекта CD79b на усиление роста, причем указанный способ включает контактирование клетки с эффективным количеством антитела по изобретению, тем самым ингибируя рост указанной клетки. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с ингибирующим рост средством.

В одном аспекте изобретение относится к способу медикаментозного лечения опухоли у млекопитающего, где рост указанной опухоли по меньшей мере частично зависит от эффекта CD79b на усиление роста, причем указанный способ включает контактирование клетки с эффективным количеством антитела по изобретению, тем самым эффективно осуществляя лечение указанной опухоли. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с ингибирующим рост средством.

В одном аспекте изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли, включающему введение пациенту фармацевтического состава, содержащего иммуноконъюгат, описанный в настоящем документе, приемлемый разбавитель, носитель или эксципиент.

В одном аспекте изобретение относится к способу ингибирования пролиферации B-клеток, включающему воздействие на клетку иммуноконъюгата, содержащего антитело по изобретению, в условиях, позволяющих связывание иммуноконъюгата с CD79b.

В одном аспекте изобретение относится к способу определения наличия CD79b в образце, предположительно содержащем CD79b, причем указанный способ включает воздействие на указанный образец антитела по изобретению, и определение связывания указанного антитела с CD79b в указанном образце, где связывание указанного антитела с CD79b в указанном образце указывает на наличие указанного белка в указанном образце.

В одном аспекте изобретение относится к способу диагностики клеточно-пролиферативного нарушения, связанного с увеличением числа клеток, таких как B-клетки, экспрессирующих CD79b, причем способ включает контактирование тестируемых клеток в биологическом образце с любыми из указанных выше антител; определение уровня антитела, связавшегося с тестируемыми клетками в образце, путем детекции связывания антитела с CD79b; и сравнение с уровнем антитела, связавшегося с клетками, в контрольном образце, где уровень связавшегося антитела нормализован относительно количества экспрессирующих CD79b клеток в тестируемом и контрольном образцах, и где более высокий уровень антитела, связавшегося с тестируемым образцом по сравнению с контрольным образцом указывает на наличие клеточно-пролиферативного нарушения, связанного с клетками, экспрессирующими CD79b.

В одном аспекте изобретение относится к способу детекции растворимого CD79b в крови или сыворотке, причем способ включает контактирование тестируемого образца крови или сыворотке от млекопитающего, предположительно страдающего B-клеточно-пролиферативным нарушением, с антителом против CD79b по изобретению, и детекцию повышения растворимого CD79b в тестируемом образце относительно контрольного образца крови или сыворотки от здорового млекопитающего.

В одном аспекте изобретение относится к способу связывания антитела по изобретению с клеткой, которая экспрессирует CD79b, причем указанный способ включает контактирование указанной клетки с антителом по изобретению. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с ингибирующим рост средством.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На фигуре 1 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:1) кДНК PRO36249, где SEQ ID NO:1 представляет собой клон, обозначаемый в настоящем документе как "DNA225786" (также обозначаемый в настоящем документ как "CD79b"). Нуклеотидная последовательность кодирует CD79b, и кодон инициации и стоп-кодон показаны полужирным шрифтом и подчеркнуты.

На фигуре 2 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2), образованная кодирующей последовательностью SEQ ID NO:1, представленной на фигуре 1.

На фигуре 3 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:3) легкой цепи химерного 2F2 (ch2F2) IgG1 (2F2 представляет собой моноклональное антитело мыши против CD79b). Нуклеотидная последовательность кодирует легкую цепь ch2F2, представленную на фигуре 4, и первый кодон (кодирующий первую аминокислоту SEQ ID NO:4) указан полужирным шрифтом и подчеркнут.

На фигуре 4 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:4), образованная кодирующей последовательностью SEQ ID NO:3, представленной на фигуре 3. Вариабельные области представляют собой не подчеркнутые области.

На фигуре 5 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:5) тяжелой цепи химерного 2F2 (ch2F2) IgG1 (2F2 представляет собой моноклональное антитело мыши против CD79b). Нуклеотидная последовательность кодирует тяжелую цепь ch2F2, представленную на фигуре 6, и первый кодон (кодирующий первую аминокислоту SEQ ID NO:6) указан полужирным шрифтом и подчеркнут.

На фигуре 6 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:6), образованная кодирующей последовательностью SEQ ID NO:5, представленной на фигуре 5. Вариабельные области представляют собой не подчеркнутые участки.

На фигуре 7 представлено выравнивание последовательностей вариабельных областей легких цепей для следующих: консенсусная последовательность легкой цепи каппа I человека (обозначенная как "huKI"; SEQ ID NO:9) с VL-FR1, VL-FR2, VL-FR3, VL-FR4 (SEQ ID NO:65-68, соответственно), антитело 2F2 мыши против CD79b (обозначенное как "mu2F2" и также в настоящем документе обозначаемое как "2F2"; SEQ ID NO:10), "гуманизированное" антитело с пересаженной последовательностью 2F2 (обозначаемое как "hu2F2 с пересаженной последовательностью"; SEQ ID NO:11) и вариант 7 "гуманизированного" антитела с пересаженной последовательностью 2F2 (обозначаемый как "hu2F2.D7"; SEQ ID NO:12) (содержащий 71A, 73T и 78A). Положения пронумерованы согласно Кабат, и гипервариабельные области (HVR), пересаженные из 2F2 мыши в консенсусную каркасную область вариабельной области легкой цепи каппа I, заключены в рамку.

На фигурах 8A-B представлено выравнивание последовательностей вариабельных областей тяжелых цепей для следующих: консенсусная последовательность тяжелой цепи подгруппы III человека (обозначенная как "humIII"; SEQ ID NO:13) с VH-FR1, VH-FR2, VH-FR3 и VH-FR4 (SEQ ID NO:69-72, соответственно), антитело 2F2 мыши против CD79b (обозначенное как "mu2F2" и также в настоящем документе обозначаемое как "2F2"; SEQ ID NO:14), "гуманизированное" антитело с пересаженной последовательностью 2F2 (обозначаемое как "hu2F2 с пересаженной последовательностью"; SEQ ID NO:15) (содержащее 71A, 73T и 78A) и вариант 7 "гуманизированного" антитела с пересаженной последовательностью 2F2 (обозначаемый как "hu2F2.D7"; SEQ ID NO:16) (содержащий 71A, 73T и 78A). Положения пронумерованы согласно Кабат, и гипервариабельные области (HVR), пересаженные из mu2F2 в консенсусную каркасную область вариабельной области тяжелой цепи подгруппы III, заключены в рамку.

На фигуре 9 представлена последовательность HVR выбранного варианта "гуманизированного" антитела с пересаженной последовательностью 2F2 (SEQ ID NO:18), где вариант обладает множеством изменений аминокислот в отдельной области HVR "гуманизированного" антитела с пересаженной последовательностью 2F2 (часть HVR-L3 (SEQ ID NO:61) представлена на фигуре 9 в качестве SEQ ID NO:17). Последовательности вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи вне показанных аминокислотных изменений были идентичны пересаженной последовательности 2F2 и не показаны. Не было выявлено изменений в HVR-L1 (SEQ ID NO:59), HVR-L2 (SEQ ID NO:60), HVR-H1 (SEQ ID NO:62); HVR-H2 (SEQ ID NO:63) или HVR-H3 (SEQ ID NO:64) "гуманизированного" антитела с пересаженной последовательностью 2F2.

На фи