Новая дельта-9-элонгаза для получения масел, обогащенных полиненасыщенными жирными кислотами

Новая дельта-9-элонгаза для получения масел, обогащенных полиненасыщенными жирными кислотами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

УРОВЕНЬ ТЕНИКИ

[0001] Настоящее описание относится к изолированным полинуклеотидам, кодирующим дельта-9-элонгазу, дельта-9-элонгазам, которые кодируют указанные изолированные полинуклеотиды, векторам экспрессии, содержащим указанные изолированные полинуклеотиды, клеткам-хозяевам, содержащим указанные векторы экспрессии, и способам получения дельта-9-элонгаз и полиненасыщенных жирных кислот.

[0002] Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) играют большую роль в правильном функционировании живых организмов. Например, ПНЖК представляют собой важные компоненты плазматической мембраны клетки, в которой они присутствуют в виде фосфолипидов. Они также являются предшественниками простациклинов, эйкозаноидов, лейкотриенов и простагландинов млекопитающих. Кроме того, ПНЖК необходимы для правильного формирования развивающегося головного мозга младенца, а также для образования и восстановления тканей. В связи с биологической значимостью ПНЖК, предпринимаются попытки эффективного получения ПНЖК, а также промежуточных продуктов, позволяющих их получить.

[0003] В биосинтез ПНЖК вовлечено множество ферментов, в основном десатураз и элонгаз (см. Фигуру 1). Десатуразы катализируют введение элементов ненасыщенности (например, двойных связей) между атомами углерода в субстрате-алкильной цепи жирной кислоты. Элонгазы катализируют добавление 2-углеродной единицы к жирной кислоте-субстрату. Например, линолевую кислоту (ЛК, 18:2n-6) получают из олеиновой кислоты (ОК, 18:1n-9) с помощью дельта-12-десатуразы. Эйкозандиеновую кислоту (ЭДК, 20:2n-6) получают из линолевой кислоты (ЛК, 18:2n-6) с помощью дельта-9-элонгазы. Дигомо-гамма-линоленовую кислоту (ДГЛК, 20:3n-6) получают из эйкозандиеновой кислоты (ЭДК, 20:2n-6) с помощью дельта-8-десатуразы. Арахидоновую кислоту (АРК, 20:4n-6) получают из дигомо-гамма-линоленовой кислоты (ДГЛК, 20:3n-6) с помощью дельта-5-десатуразы (см. Фигуру 1).

[0004] Элонгазы катализируют превращение гамма-линоленовой кислоты (ГЛК, 18:3n-6) в дигомо-гамма-линоленовую кислоту (ДГЛК, 20:3n-6) и превращение стеаридоновой кислоты (СДК, 18:4n-3) в эйкозатетраеновую кислоту (ЭТК, 20:4n-3). Элонгаза также катализирует превращение арахидоновой кислоты (АРК, 20:4n-6) в адреновую кислоту (АДК, 22:4n-6) и превращение эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК, 20:5n-3) в омега-3-докозапентаеновую кислоту (22:5n-3). Дельта-9-элонгаза удлиняет полиненасыщенные жирные кислоты, содержащие элемент ненасыщенности в положении 9 атома углерода. Например, дельта-9-элонгаза катализирует превращение линолевой кислоты (ЛК, 18:2n-6) в эйкозандиеновую кислоту (ЭДК, 20:2n-6) и превращение альфа-линоленовой кислоты (АЛК, 18:3n-3) в эйкозатриеновую кислоту (ЭТрК, 20:3n-3). Омега-3-ЭТрК затем можно превратить в омега-3-ЭТК с помощью дельта-8-десатуразы. Омега-3-ЭТК затем можно использовать для получения других полиненасыщенных жирных кислот, таких как омега-3-ЭПК, которые можно добавлять в фармацевтические композиции, пищевые композиции, корма для животных, а также другие продукты, такие как косметические средства.

[0005] Обнаруженные ранее элонгазы отличаются по субстратам, на которые они действуют. Более того, они присутствуют как у животных, так и в растениях. Элонгазы, обнаруженные у млекопитающих, обладают способностью использовать в качестве субстрата насыщенные, мононенасыщенные и полиненасыщенные жирные кислоты. Напротив, обнаруженные в растениях элонгазы специфичны к насыщенным или мононенасыщенным жирным кислотам. Таким образом, существует потребность в элонгазе, специфичной к ПНЖК, для получения полиненасыщенных жирных кислот в растениях.

[0006] Полагают, что как у растений, так и у животных процесс элонгации состоит из четырех этапов (Lassner и др., The Plant Cell 8:281-292 (1996)). КоА представляет собой переносчик ацильной группы. Первый этап включает конденсацию малонил-КоА с длинноцепочечным ацил-КоА с получением диоксида углерода и β-кетоацил-КоА, в котором ацильная молекула удлинилась на два атома углерода. Последующие реакции включают восстановление до β-гидроксиацил-КоА, дегидрирование с получением еноил-КоА и повторное восстановление с получением удлиненного ацил-КоА. Исходная реакция конденсации представляет собой не только субстрат-специфичный этап, но и стадию, лимитирующую скорость реакции.

[0007] Следует отметить, что животные не могут уменьшать насыщенность ниже положения дельта-9 и, следовательно, не могут превращать олеиновую кислоту (ОК, 18:1n-9) в линолевую кислоту (ЛК, 18:2n-6). Аналогичным образом, альфа-линоленовая кислота (АЛК, 18:3n-3) не может быть синтезирована млекопитающими, так как у них отсутствует дельта-15-десатуразная активность. Тем не менее, у млекопитающих и водорослей альфа-линоленовая кислота может быть превращена в стеаридоновую кислоту (СДК, 18:4n-3) с помощью дельта-6-десатуразы (см. WO 96/13591; см. также патент США номер 5552306), а затем подвергнута элонгации с получением эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК, 20:4n-3). Эта полиненасыщенная жирная кислота (т.е. ЭТК, 20:4n-3) затем может быть превращена в эйкозапентаеновую кислоту (ЭПК, 20:5-3) с помощью дельта-5-десатуразы. Другие эукариоты, включая грибы и растения, содержат ферменты, которые уменьшают насыщенность в положениях атомов углерода 12 (см. WO 94/11516 и патент США номер 5443974) и 15 (см. WO 93/11245). Следовательно, основные полиненасыщенные жирные кислоты животные получают из пищи и/или в результате десатурации и элонгации линолевой кислоты или альфа-линоленовой кислоты. В связи с неспособностью млекопитающих образовывать указанные незаменимые длинноцепочечные жирные кислоты, большой интерес представляет выделение генов, вовлеченных в биосинтез ПНЖК, из видов, которые в природе продуцируют данные жирные кислоты, и экспрессирование данных генов в системе микроорганизма, растения или животного, которую можно изменить, чтобы обеспечить получение промышленных количеств одной или нескольких ПНЖК. Следовательно, существует выраженная потребность в ферментах элонгазах, генах, кодирующих данные ферменты, а также рекомбинантных способах получения указанных ферментов.

[0008] В связи с приведенным обсуждением, также существует определенная потребность в маслах, содержащих ПНЖК на более высоком, чем присутствующие в природе, уровне, а также в маслах, обогащенных новыми ПНЖК. Такие масла можно получить путем выделения и экспрессии генов элонгазы.

[0009] Одной из наиболее важных длинноцепочечных ПНЖК является эйкозапентаеновая кислота (ЭПК). ЭПК обнаруживают в грибах, а также в маслах из морепродуктов. Докозагексаеновая кислота (ДГК) представляет собой другую важную длинноцепочечную ПНЖК. ДГК чаще всего обнаруживают в рыбьем жире, а также ее можно выделить из ткани головного мозга млекопитающего. Арахидоновая кислота (АРК) представляет собой третью важную длинноцепочечную ПНЖК. АРК обнаруживают в мицелиальных грибах, и ее также можно выделить из тканей млекопитающего, включая печень и надпочечники.

[0010] АРК, ЭПК и/или ДГК, например, можно получить либо с помощью альтернативного пути с участием дельта-8-десатуразы/дельта-9-элонгазы, либо с помощью обычного пути дельта-6 (см. Фигуру 1). Ранее были идентифицированы элонгазы, которые активны в отношении жирных кислот - субстратов в обычном пути дельта-6 получения длинноцепочечных ПНЖК, особенно АРК, ЭПК и ДГК. В обычном пути дельта-6 превращения ЛК в ДГЛК и АЛК в омега-3-ЭТК используют фермент дельта-6-десатуразу для превращения ЛК в ГЛК и АЛК в стеаридоновую кислоту (СДК) и фермент дельта-6-элонгазу для превращения ГЛК в ДГЛК и СДК в омега-3-ЭТК. Тем не менее, в некоторых случаях, альтернативный путь с участием дельта-8-десатуразы/дельта-9-элонгазы может оказаться предпочтительным по сравнению с обычным путем дельта-6. Например, если определенные остаточные промежуточные продукты омега-6 или омега-3 жирных кислот, такие как ГЛК или СДК, не желательны в процессе получения ДГЛК, омега-3-ЭТК, АРК, ЭПК, омега-3-докозапентаеновой кислоты, омега-6-докозапентаеновой кислоты, АДК и/или ДГК, в качестве альтернативы обычному пути дельта-6 можно применять другой путь с участием дельта-8-десатуразы/дельта-9-элонгазы, чтобы избежать образования ГЛК и СДК.

[0011] В настоящем описании идентифицировали новый источник дельта-9-элонгазы для получения длинноцепочечных ПНЖК, в частности ДГЛК, ЭТК, АРК, ЭПК, омега-3-докозапентаеновой кислоты, омега-6-докозапентаеновой кислоты, АДК и/или ДГК. Фермент дельта-9-элонгаза согласно настоящему описанию превращает, например, ЛК в омега-6-ЭДК и АЛК в омега-3-ЭТрК. Получение ДГЛК из омега-6-ЭДК и АРК из ДГЛК затем катализируется ферментом дельта-8-десатуразой и дельта-5-десатуразой, соответственно.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0012] В одном своем аспекте, настоящее описание относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, или фрагменту указанной нуклеиновой кислоты, которая включает изолированную последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид, обладающий элонгазной активностью, или которая является комплементарной указанной последовательности, при этом последовательность аминокислот указанного полипептида по меньшей мере на 68% идентична последовательности аминокислот, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:18 и SEQ ID NO:20.

[0013] В другом своем аспекте, настоящее описание относится к изолированной последовательности нуклеотидов, или фрагменту указанной последовательности, которая включает или комплементарна по меньшей мере 68% последовательности нуклеотидов, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:19,. Указанная изолированная последовательность нуклеотидов или фрагмент указанной последовательности кодирует функционально активную элонгазу, которая использует полиненасыщенную жирную кислоту в качестве субстрата, в частности, функционально активную дельта-9-элонгазу.

[0014] Указанную последовательность нуклеотидов можно получить, например, из Euglenoid sp., в частности, можно выделить, например, из Euglena deses Ehr. CCMP 2916.

[0015] В другом аспекте, настоящее описание относится к очищенному полипептиду, который кодирует описанная выше изолированная последовательность нуклеотидов, а также к очищенному полипептиду, который удлиняет полиненасыщенные жирные кислоты, содержащие элемент ненасыщенности в положении атома углерода 9, и обладает по меньшей мере 68% идентичности аминокислотной последовательности с последовательностью аминокислот, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:18 и SEQ ID NO:20.

[0016] В еще одном аспекте, настоящее описание относится к вектору экспрессии. Указанный вектор экспрессии содержит последовательность нуклеотидов, функционально связанную с регуляторной последовательностью, при этом указанная последовательность нуклеотидов включает или комплементарна по меньшей мере 68% последовательности нуклеотидов, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:19. Настоящее описание также относится к клетке-хозяину, содержащему указанный вектор экспрессии. Клетка-хозяин может представлять собой, например, эукариотическую клетку или прокариотическую клетку. Подходящие эукариотические клетки и прокариотические клетки описаны в данной заявке. Настоящее описание также относится к трансгенному семени, содержащему указанный вектор экспрессии.

[0017] В другом аспекте, настоящее описание относится к клетке растения, семени растения, растению или ткани растения, содержащим описанный выше вектор экспрессии, при этом экспрессия последовательности нуклеотидов указанного вектора экспрессии приводит к продуцированию по меньшей мере одной полиненасыщенной жирной кислоты указанными клеткой растения, растением или тканью растения. Полиненасыщенная жирная кислота может быть выбрана, например, из группы, состоящей из омега-6-ЭДК и омега-3-ЭТрК и комбинации перечисленных жирных кислот. Настоящее описание также охватывает одно или несколько растительных масел или жирных кислот, экспрессированных описанной выше клеткой растения, семенем растения, растением или тканью растения.

[0018] Кроме того, настоящее описание относится к способу получения дельта-9-элонгазы. Указанный способ включает следующие этапы: а) выделение последовательности нуклеотидов, которая включает или комплементарна по меньшей мере 68% последовательности нуклеотидов, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:19; b) конструирование вектора экспрессии, содержащего: i) указанную выделенную последовательность нуклеотидов, функционально связанную с и) регуляторной последовательностью; и с) введение указанного вектора экспрессии в клетку-хозяина на время и при условиях, которые достаточны для экспрессирования дельта-9-элонгазы, в соответствующих случаях. Указанная клетка-хозяин может, например, представлять собой эукариотическую клетку или прокариотическую клетку. В частности, эукариотическая клетка может представлять собой, например, клетку млекопитающего, клетку насекомого, клетку растения или клетку гриба. Клетка растения может быть получена из масличного растения, выбранного из группы, состоящей из сои, видов Brassica, сафлора, подсолнечника, кукурузы, хлопчатника и льна.

[0019] Дополнительно, настоящее описание относится к способу получения полиненасыщенной жирной кислоты, включающему следующие этапы: а) выделение последовательности нуклеотидов, которая включает или комплементарна по меньшей мере 68% последовательности нуклеотидов, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:19; b) конструирование вектора экспрессии, содержащего указанную выделенную последовательность нуклеотидов, функционально связанную с регуляторной последовательностью; с) введение указанного вектора экспрессии в клетку-хозяина на время и при условиях, которые достаточны для экспрессирования дельта-9-элонгазы; и d) обеспечение взаимодействия указанной экспрессированной дельта-9-элонгазы и полиненасыщенной жирной кислоты-субстрата с тем, чтобы превратить указанную полиненасыщенную жирную кислоту-субстрат в первую полиненасыщенную жирную кислоту-продукт. Указанная «полиненасыщенная жирная кислота-субстрат» представляет собой, например, ЛК или АЛК, и «первая полиненасыщенная жирная кислота-продукт» представляет собой, например, омега-6-ЭДК или омега-3-ЭТрК, соответственно. Данный способ может дополнительно включать этап воздействия на первую полиненасыщенную жирную кислоту-продукт по меньшей мере одной десатуразы, по меньшей мере одной дополнительной элонгазы или комбинации перечисленных ферментов с тем, чтобы превратить указанную первую полиненасыщенную жирную кислоту-продукт во вторую или последующую полиненасыщенную жирную кислоту-продукт. Указанная вторая или последующая полиненасыщенная жирная кислота-продукт может представлять собой, например, ДГЛК или омега-3-ЭТК, АРК, ЭПК, ДПК, ДГК или комбинации перечисленных жирных кислот.

[0020] В другом аспекте, настоящее описание относится к способу получения полиненасыщенной жирной кислоты в клетке-хозяине, включающему следующие этапы: а) выделение последовательности нуклеотидов, которая включает или комплементарна по меньшей мере 68% последовательности нуклеотидов, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:19; b) конструирование вектора экспрессии, содержащего указанную выделенную последовательность нуклеотидов, функционально связанную с регуляторной последовательностью; с) введение i) указанного вектора экспрессии и ii) по меньшей мере одной дополнительной конструкции рекомбинантной ДНК, содержащей указанную выделенную последовательность нуклеотидов, кодирующую дельта-8-десатуразу и функционально связанную с по меньшей мере одной регуляторной последовательностью, в клетку-хозяина на время и при условиях, которые достаточны для экспрессирования дельта-9-элонгазы и дельта-8-десатуразы; и d) обеспечения взаимодействия указанных экспрессированной дельта-9-элонгазы и дельта-8-десатуразы на полиненасыщенную жирную кислоту-субстрат, выбранную из группы, состоящей из ЛК, АЛК и комбинации перечисленных жирных кислоте тем, чтобы превратить указанную полиненасыщенную жирную кислоту-субстрат в первую полиненасыщенную жирную кислоту-продукт. Указанная первая полиненасыщенная жирная кислота-продукт может представлять собой, например, ДГЛК, омега-3-ЭТК или комбинации перечисленных жирных кислот. Данный способ может дополнительно включать этап воздействия на указанную первую полиненасыщенную жирную кислоту-продукт по меньшей мере одной десатуразы, по меньшей мере одной дополнительной элонгазы или комбинации перечисленных ферментов с тем, чтобы превратить указанную первую полиненасыщенную жирную кислоту-продукт во вторую или последующую полиненасыщенную жирную кислоту-продукт. Указанная вторая или последующая полиненасыщенная жирная кислота-продукт может представлять собой, например, АРК, ЭПК, ДПК, ДГК или комбинацию перечисленных жирных кислот. В одном аспекте, указанный способ может дополнительно включать введение в клетку-хозяина конструкции рекомбинантной ДНК, содержащей i) выделенную последовательность нуклеотидов, кодирующую дельта-5-десатуразу, функционально связанную с ii) регуляторной последовательностью. Указанная клетка-хозяин может представлять собой описанную выше клетку-хозяина.

[0021] В другом своем аспекте, настоящее описание относится к способу получения трансгенного растения, включающему трансформирование клетки растения по меньшей мере одной выделенной последовательностью нуклеотидов, или фрагментом указанной последовательности, которая включает или комплементарна по меньшей мере 68% последовательности нуклеотидов, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:19, и регенерирование трансгенного растения из трансформированной клетки растения. Указанную клетку растения можно получить из масличного растения, выбранного из группы, состоящей из сои, видов Brassica, сафлора, подсолнечника, кукурузы, хлопчатника и льна. В другом аспекте, настоящее описание относится к семени, полученному из такого трансгенного растения, полученного с помощью указанного способа.

[0022] Также следует отметить, что каждой последовательности нуклеотидов и аминокислот, упомянутой в настоящем описании, был присвоен конкретный идентификационный номер последовательности. В Перечне последовательностей (который приложен к настоящему описанию), включенном в данную заявку посредством ссылки, перечислены все такие последовательности и соответствующие им номера.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[0023] На Фигуре 1 показана путь биосинтеза жирных кислот и роль дельта-9-элонгазы в этом пути.

[0024] На Фигурах 2А и 2В показано выравнивание последовательностей нуклеотидов SEQ ID NO:26 и SEQ ID NO:27, которые представляют собой последовательности нуклеотидов вариантов Eug-MO7-ELO#10 и Eug-MO7-ELO#14, соответственно, клонированных в сайты Ват HI/Hind III вектора pYX242, что обсуждается в Примере 3.

Варианты обведены прямоугольниками.

[0025] На Фигурах 3А и 3В показано выравнивание последовательностей аминокислот дельта-9-элонгазы из Euglena deses Ehr. CCMP 2916 (Eug-MO7-ELO-10) (SEQ ID NO:18) с известными дельта-9-элонгазами из Euglena gracialis (SEQ ID NO:4), Isochrysis galbana (SEQ ID NO:2); элонгазой Elov 14 мыши (номер доступа AAG47667; SEQ ID NO:21), элонгазой ELOVL2 человека (номер доступа NP_060240; SEQ ID NO:22) и элонгазой С. elegans (номер доступа AF244356; SEQ ID NO:23). Неизменяющиеся остатки заштрихованы.

[0026] На Фигуре 4А показана последовательность аминокислот дельта-9-элонгазы из Pavlova salma (номер доступа AAY15135; SEQ ID NO:1).

[0027] На Фигуре 4В показана последовательность аминокислот дельта-9-элонгазы из Isochrysis galbana (номер доступа AF390174; SEQ ID NO:2).

[0028] На Фигуре 4С показана последовательность аминокислот дельта-9-элонгазы из Eutreptiella sp. (SEQ ID NO:3).

[0029] На Фигуре 4D показана последовательность аминокислот дельта-9-элонгазы из Euglena gracialis (номер доступа САТ16687; SEQ ID NO:4).

[0030] На Фигуре 4Е показана последовательность аминокислот дельта-9-элонгазы из Euglena anabena (SEQ ID NO:5).

[0031] На Фигуре 5А показана последовательность нуклеотидов (SEQ ID NO:6) клона plate2_MO7, получение которого описано в Примере 1.

[0032] На Фигуре 5В показана предсказанная последовательность аминокислот (SEQ ID NO:7) клона plate2_MO7, получение которого описано в Примере 1.

[0033] На Фигуре 6А показана последовательность нуклеотидов (SEQ ID NO:13) предполагаемого 3′-конца фрагмента гена plate2_MO7, получение которого описано в Примере 2.

[0034] На Фигуре 6В показана предсказанная последовательность аминокислот (последовательности SEQ ID NO:14 и 30-32) предполагаемого 3′-конца фрагмента гена plate2_MO7, получение которого описано в Примере 2. Последовательности SEQ ID NO:14 и 30-32 отделены значком "*", который представляет собой стоп-кодон.

[0035] На Фигуре 6С показана последовательность SEQ ID NO:14.

[0036] На Фигуре 6D показана последовательность SEQ ID NO:30.

[0037] На Фигуре 6Е показана последовательность SEQ ID NO:31.

[0038] На Фигуре 6F показана последовательность SEQ ID NO:32.

[0039] На Фигуре 7А показана последовательность нуклеотидов (SEQ ID NO:17) предполагаемой дельта-9-элонгазы из Euglena deses Ehr. CCMP 2916 (Eug-MO7-ELO#10), получение которого описано в Примере 3.

[0040] На Фигуре 7В показана предсказанная последовательность аминокислот (SEQ ID NO:18), кодируемая последовательностью нуклеотидов (SEQ ID NO:17) предполагаемой дельта-9-элонгазы из Euglena deses Ehr. CCMP 2916 (Eug-MO7-ELO#10), получение которого описано в Примере 3.

[0041] На Фигуре 8А показана последовательность нуклеотидов (SEQ ID NO:19) варианта дельта-9-элонгазы из Euglena deses Ehr. CCMP 2916 (Eug-MO7-ELO#14), получение которого описано в Примере 3.

[0042] На Фигуре 8В показана предсказанная последовательность аминокислот (SEQ ID NO:20), кодируемая последовательностью нуклеотидов (SEQ ID NO:19) варианта дельта-9-элонгазы из Euglena deses Ehr. CCMP 2916 (Eug-MO7-ELO#14), получение которого описано в Примере 3.

[0043] На Фигуре 9А показана последовательность аминокислот элонгазы Elovl4 мыши (номер доступа AAG47667; SEQ ID NO:21).

[0044] На Фигуре 9В показана последовательность аминокислот элонгазы ELOVL2 человека (номер доступа NP_060240; SEQ ID NO:22).

[0045] На Фигуре 9С показана последовательность аминокислот элонгазы С. elegans (номер доступа AF244356; SEQ ID NO:23).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0046] Настоящее описание относится к последовательностям нуклеотидов (например, гену) и транслированным последовательностям аминокислот гена дельта-9-элонгазы из Euglenoid sp., например, Euglena deses Ehr., в частности Euglena deses Ehr. CCMP 2916. Более того, настоящее описание также охватывает варианты применения указанного гена и фермента, кодируемого указанным геном. Например, ген и соответствующий фермент можно применять для получения полиненасыщенных жирных кислот, таких как, например, омега-6-ЭДК, омега-3-ЭТрК, ДГЛК, омега-3-ЭТК, АРК, ЭПК, омега-3-докозапентаеновая кислота, омега-6-докозапентаеновая кислота, АДК, ДГК или любая комбинация перечисленных жирных кислот, которые можно добавить в фармацевтические композиции, пищевые композиции и в другие полезные продукты.

Определения

[0047] В данной заявке, формы единственного числа включают ссылку на множественное число, если в контексте явно не указано иное. При перечислении в данной заявке числовых диапазонов, предполагается, что каждое число, находящееся в рамках данных диапазонов, указано в явной форме с одинаковой степенью точности. Например, предполагается, что в диапазоне 6-9, в дополнение к 6 и 9, указаны числа 7 и 8, а в диапазоне 6,0-7,0 в явной форме указаны числа 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 и 7,0.

[0048] Химерная конструкция: В данной заявке, формулировка "химерная конструкция" относится к комбинации молекул нуклеиновых кислот, которые обычно не встречаются вместе в природе. Соответственно, химерная конструкция может включать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые получают из различных источников, или регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, полученные из одного и того же источника, но расположенные в порядке, отличном от обычно встречающегося в природе.

[0049] Кодирующая последовательность: В данной заявке, термин "кодирующая последовательность" относится к последовательности ДНК, которая кодирует определенную последовательность аминокислот. "Регуляторные последовательности" относятся к последовательностям нуклеотидов, расположенным против хода транскрипции (5′-некодирующие последовательности), внутри или по ходу транскрипции (3′-некодирующие последовательности) от кодирующей последовательности, при этом указанные последовательности нуклеотидов влияют на транскрипцию, процессинг или стабильность РНК или трансляцию связанной с ними кодирующей последовательности. Регуляторные последовательности могут включать, но не ограничены перечисленными, промоторы, последовательности, направляющие трансляцию, интроны и регуляторные последовательности полиаденилирования.

[0050] Комплементарность: В данной заявке, термин "комплементарность" относится к степени схожести между двумя фрагментами ДНК. Ее определяют путем измерения способности смысловой нити одного фрагмента ДНК гибридизоваться с антисмысловой нитью другого фрагмента ДНК при условиях, подходящих для образования двойной спирали. В двойной спирали, аденин присутствует на одной нити, тимин присутствует на другой нити. Аналогично, там, где гуанин присутствует на одной нити, цитозин обнаруживают на другой. Чем больше схожесть между последовательностями нуклеотидов двух фрагментов ДНК, тем больше способность образовывать гибридные дуплексы между нитями двух указанных фрагментов ДНК.

[0051] Кодируется, гибридизация и строгие условия: В настоящем описании формулировка "кодируется" относится к последовательности нуклеиновых кислот, которая кодирует полипептидную последовательность, при этом указанная полипептидная последовательность или ее часть содержит аминокислотную последовательность, состоящую из по меньшей мере трех последовательных аминокислот, более предпочтительно из по меньшей мере восьми последовательных аминокислот и еще более предпочтительно из по меньшей мере 15 последовательных аминокислот полипептида, кодируемого указанной последовательностью нуклеиновых кислот.

[0052] В объем настоящего описания также входит изолированная последовательность нуклеотидов, которая кодирует фермент, обладающий активностью элонгазы ПНЖК, и которая способна гибридизоваться при умеренно строгих условиях с нуклеиновой кислотой, обладающей последовательностью нуклеотидов, которая включает или комплементарна последовательности нуклеотидов, включающей SEQ ID NO:17 или SEQ ID NO:19 (как показано на Фигурах 7А и 8А, соответственно). Молекула нуклеиновой кислоты "способна гибридизоваться" с другой молекулой нуклеиновой кислоты, если одноцепочечная форма указанной молекулы нуклеиновой кислоты может отжигаться с другой молекулой нуклеиновой кислоты при подходящих условиях, то есть при подходящей температуре и ионной силе (см., Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, второе издание (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк)). Условия (температура и ионная сила) определяют "строгость" гибридизации. Для "гибридизации" необходимо, чтобы две нуклеиновые кислоты содержали комплементарные последовательности. Тем не менее, в зависимости от строгости гибридизации, могут встречаться несовпадения между основаниями. Подходящая строгость гибридизации нуклеиновых кислот зависит от длин нуклеиновых кислот и степени их комплементарности. Такие параметры хорошо известны специалистам в данной области. В частности, чем больше степень подобия или гомологии между двумя последовательностями нуклеотидов, тем больше значение Tm для гибридов нуклеиновых кислот с данными последовательностями. Для гибридов длиной больше, чем 100 нуклеотидов, вывели уравнения для вычисления Tm (см., Sambrook и др., выше). Для гибридизации с более короткими нуклеиновыми кислотами, положение несовпадений становится более существенным, и длина олигонуклеотида определяет его специфичность (см., Sambrook и др., выше).

[0053] Обычно строгие условия представляют собой такие условия, при которых концентрация соли меньше, чем приблизительно 1,5 М ионов Na, обычно концентрация ионов Na (или других солей) приблизительно составляет от 0,01 до 1,0 М при рН от 7,0 до 8,3 и температура составляет по меньшей мере приблизительно 30°С для коротких зондов (например, размером от 10 до 50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°С для длинных зондов (например, размером больше, чем 50 нуклеотидов). Строгих условий также можно добиться путем добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Пример условий низкой строгости включает гибридизацию в буферном растворе с содержанием формамида от 30 до 35%, 1 М NaCl, 1% ДСН (додецилсульфата натрия) при 37°С и промывку от 1 Х до 2 Х SSC (20 Х SSC=3,0 M NaCl/0,3 М тринатриевого цитрата) при температуре от 50 до 55°С. Пример умеренно строгих условий включает гибридизацию в буферном растворе с содержанием формамида от 40 до 45%, 1 М NaCl, 1% ДСН при 37°С и промывку от 0,5 Х до 1 Х SSC при температуре от 55 до 60°С. Пример высоко строгих условий включает гибридизацию в буферном растворе с 50% формамидом, 1 М NaCl, 1% ДСН при 37°С и промывку 0,1 Х SSC при температуре от 60 до 65°С.

[0054] Экзон: В данной заявке, термин "экзон" относится к части последовательности гена, которая транскрибируется и обнаруживается в зрелой информационной РНК, полученной из указанного гена, но не обязательно является частью последовательности, которая кодирует конечный продукт гена.

[0055] Экспрессия, антисмысловое ингибирование и ко-супрессия: В данной заявке, термин "экспрессия" относится к получению функционального конечного продукта. Экспрессия гена включает транскрипцию гена и трансляцию мРНК с образованием белка-предшественника или зрелого белка.

[0056] В данной заявке, формулировка "антисмысловое ингибирование" относится к получению транскриптов антисмысловых РНК, способных подавлять экспрессию целевого белка.

[0057] В данной заявке, термин "ко-супрессия" относится к продукции смысловых транскриптов РНК, способных подавлять экспрессию идентичных или по существу сходных чужеродных или эндогенных генов (см. патент США номер 5231020).

[0058] Фрагмент или часть фрагмента, который функционально эквивалентен: Термины "фрагмент или часть фрагмента, который функционально эквивалентен" и "функционально эквивалентенный фрагмент или часть фрагмента", которые используют взаимозаменяемо в настоящем описании, относятся к части или подпоследовательности изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, у которой сохраняется способность изменять экспрессию гена или вызывать некоторый фенотип независимо от того, кодирует или нет указанный фрагмент или часть фрагмента активный фермент. Например, фрагмент или часть фрагмента можно применять при разработке химерных конструкций для получения желательного фенотипа у трансформированного растения. Химерные конструкции можно разработать специально, чтобы применять для ко-супрессии или антисмыслового ингибирования, путем присоединения фрагмента или части фрагмента нуклеиновой кислоты, независимо от того, кодирует он или нет активный фермент, в подходящей ориентации по отношению к промоторной последовательности растения.

[0059] Ген, нативный ген, чужеродный ген и трансген: В данной заявке, термин "ген" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует определенный белок, включая регуляторные последовательности, предшествующие (5′-некодирующие последовательности) и следующие (3′-некодирующие последовательности) за кодирующей последовательностью.

[0060] В данной заявке, формулировка "нативный ген" относится к гену в таком виде, в котором он встречается в природе, с его собственными регуляторными последовательностями.

[0061] "Чужеродный" ген относится к гену, обычно не встречающемуся в организме хозяина, но который был введен в организм хозяина путем переноса генов. Чужеродные гены могут включать нативные гены, вставленные в ненативный организм, или химерные конструкции.

[0062] В данной заявке, термин "трансген" относится к гену, который был введен в геном с помощью процедуры трансформации.

[0063] Виды Gossvpium: В данной заявке, формулировка "виды Gossypium" относится к любым из перечисленных растений: Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum, Gossypium hirsutum, Gossypium hirsutum var hirsutum, Gossypium hirsutum var marie-galante, Gossypium lapideum, Gossypium sturtianum, Gossypium thuberi, Gossypium thurberi, Gossypium tomentosum или Gossypium tormentosum.

[0064] Гомология: Термины "гомология", "гомологичный", "по существу сходный" и "по существу соответствующий" используются взаимозаменяемо в настоящем описании и относятся к молекулам нуклеиновых кислот, в которых изменение одного или нескольких нуклеотидных оснований не влияет на способность указанной молекулы нуклеиновой кислоты опосредовать экспрессию гена или определять некоторый фенотип. Данные термины также относятся к модификациям молекул нуклеиновых кислот согласно настоящему описанию, таким как делеция или вставка одного или нескольких нуклеотидов, которые по существу не изменяют функциональных свойств полученной в результате этого молекулы нуклеиновой кислоты по сравнению с исходной, немодифицированной молекулой. Следовательно, для специалистов в данной области должно быть очевидно и понятно, что в объем настоящего описания входят не только конкретные типичные последовательности.

[0065] Клетка-хозяин: В данной заявке, под формулировкой "клетка-хозяин" подразумевают клетку, которая содержит изолированную последовательность нуклеиновых кислот или ее фрагмент согласно настоящему описанию. Клетка-хозяин могут представлять собой прокариотическую клетку (например, такую как Escherichia coli, цианобактерии и Bacillus subtilis) или эукариотическую клетку (например, такую как клетку гриба, насекомого, растения или млекопитающего).

[0066] Примеры клеток гриба, которые можно использовать, представляют собой Saccharomyces spp., Candida spp., Lipomyces spp., Yarrowia spp., Kluyveromyces spp., Hansenula spp., Aspergillus spp., Pemcillium spp., Neurospora spp., Trichoderma spp.и Pichia spp.Особенно предпочтительной клеткой гриба является Saccharomyces cerevisiae.

[0067] Клетки растения могут быть клетками однодольного или двудольного растения. Особенно предпочтительные клетки растения получают из масличных растений, таких как Glycine max (например, соя), виды Brassica, Carthamus tinctorius L. (например, сафлор), Helianthus annuus (например, подсолнечник), Zea mays (например, кукуруза), виды Gossypium (хлопчатник) и Linum usitatissimum (например, лен).

[0068] Идентичность, идентичность последовательностей и процент идентичности последовательностей (% идентичности): Термины "идентичность" или "идентичность последовательностей", которые используют взаимозаменяемо в настоящем описании, когда они используются в контексте последовательностей нуклеотидов или последовательностей полипептидов, относятся к основаниям нуклеиновых кислот или к аминокислотным остаткам в двух последовательностях, которые оказываются одинаковыми, когда их выравнивают на максимальное соответствие в рамках определенного окна сравнения. Таким образом, идентичность определяют как степень одинаковости, соответствия или эквивалентности между одинаковыми нитями (либо смысловыми, либо антисмысловыми) двух фрагментов ДНК или полипептида.

[0069] "Процент идентичности последовательностей" или "% идентичности" рассчитывают путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей на протяжении определенного участка, определения количества положений, в которых встречаются идентичные основания в обеих последовательностях, для получения количества совпадающих положений, деления количества таких положений на общее количество положений в сравниваемом фрагменте и умножения результата на 100. Оптимальное выравнивание последовательностей можно осуществить с помощью алгоритма Смита-Ватермана, Appl. Math. 2:482 (1981), с помощью алгоритма Нидлмана-Вунша, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), с помощью способа по Пирсону и Липману, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:2444 (1988), и с помощью компьютерных программ, которые осуществляют соответствующие алгоритмы (например, Higgins и др., CABIOS. 5L151-153 (1989)), FASTDB (Intelligenetics), BLAST (National Center for Biomedical Information; Altschul и др., Nucleic Acids Research 25:3389-3402 (1997)), PILEUP (Genetics Computer Group, Мэдисон, Висконсин) или GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA (пакет программ Wisconsin Genetics, версия 7.0, Genetics Computer Group, Мэдисон, Висконсин) (см. патент США номер 5912120). Подходящие примеры процента идентичности последовательностей включают, но не ограничены перечисленными, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. Идентичность можно определить с помощью любых из компьютерных программ, описанных в данной заявке.

[0070] Опосредованно или непосредственно: В данной заявке, в объем термина "опосредованно", когда он используется применительно к испол