Моноклональные антитела, способные связываться с белком axl, и их применение

Моноклональные антитела, способные связываться с белком axl, и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, которые связываются с белком «anexelekto» (неконтролируемый), к средствам, содержащим указанные антитела в качестве активного ингредиента, а также к способам применения указанных антител.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Ген «anexelekto» (также называемый AXL, UFO, ARK, или TYRO7; в настоящей заявке обозначен как AXL), клонированный у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом, представляет собой онкоген, способный трансформировать клетки NIH3T3 мышей при сверхэкспрессии (непатентные документы 1 и 2). Белок AXL представляет собой рецептор, связанный с тирозинкиназой, имеющий молекулярную массу 140 кДа (непатентный документ 3), и считается, что он отвечает за передачу сигнала по сигнальному пути за счет автофосфорилирования, которое происходит при связывании с лигандом Gas6 (продуктом гена 6 блокировки роста) (непатентный документ 4). Рецепторы, связанные с тирозинкиназой, такие как Sky, Mer и AXL, известны как рецепторы, связанные с тирозинкиназой, лигандом которых является Gas6 (непатентный документ 5).

Полагают, что AXL обладает молекулярными функциями, связанными с усилением роста клеток, подавлением апоптоза, миграцией клеток и клеточной адгезией. Экспериментально наблюдавшиеся явления в клетках, обработанных белком Gas6, подтвердили это предположение. Опубликованные экспериментальные данные включают подавление клеточной смерти и усиление роста гладкомышечных клеток сосудов крысы (непатентные документы 6 и 7); ускорение роста клеток NIH3T3 мыши и подавление клеточной смерти после выращивания клеток на бессывороточной среде (непатентные документы 8 и 9); усиление клеточного роста фибробластов сердца мыши (непатентный документ 10); усиление роста раковых клеток рака простаты человека (непатентный документ 11); усиление клеточного роста и инфильтрации, а также подавление клеточной смерти клеток карциномы желудка человека (непатентный документ 12); усиление способности к миграции гладкомышечных клеток сосудов человека и крысы (непатентный документ 13); способности к усилению миграции клеток нейронов мыши (непатентный документ 14) и агрегацию клеток, сверхэкспрессирующих AXL мыши (непатентный документ 15).

Аналогичным образом, молекулярные анализы внутриклеточных сигналов после обработки белком Gas6 показали, что путь PI3K-Akt и путь МАРК действуют как метаболические пути сигнальной трансдукции, опосредованной AXL, (непатентный документ 5). Анализ на дрожжах способом двойных гибридов с использованием внутриклеточной области AXL в качестве затравки подтвердил прямое молекулярное взаимодействие на указанные метаболические пути. В результате был идентифицирован путь GrbB2/PI3K/p55γ/SOCS-1/NcK2/RanBP2/C1-TEN (непатентный документ 16). Взаимодействия этих молекул позволяют предположить существование внутриклеточных путей передачи сигнала, следующих после AXL. Кроме того, наблюдаемые взаимодействия подтверждают предположение, что AXL действует в процессах усиления клеточного роста, подавления апоптоза, клеточной миграции и адгезии клеток. AXL также был идентифицирован как ген, сверхэкспрессирующий при появлении TNFα-индуцированной клеточной смерти фибробластов мыши подавлена с помощью IL-15. Подавление TNFα-индуцированной клеточной смерти прекращалось при подавлении экспрессии AXL, а фосфорилирование рецепторов IL-15 и AXL усиливалось при воздействии IL-15. Эти экспериментальные данные также показывают, что передача сигнала опосредована комплексом AXL и рецептора IL-15 (непатентный документ 17).

Сообщалось, что возникновение опухолей у “голых” мышей прекращалась при ингибировании Gas6-зависимого фосфорилирования AXL в глиомных линиях человека, сверхэкспрессирующих доминант-негативную форму AXL (непатентный документ 18). Однако не было никаких сообщений или предположений, и было неясно, существует ли антитело против AXL, которое ингибирует фосфорилирование.

AXL представляет собой рецептор, связанный с однократно пронизывающей мембрану тирозинкиназой, внеклеточная область которого состоит из двух иммуноглобулин-подобных доменов (называемых IgD1 и IgD2) и двух типа III фибронектиновых доменов (называемых FND1 и FND2) на N-концевой стороне (непатентный документ 3). Хотя известно, что FND экспрессируются в таких молекулах, как молекулы адгезии нервных клеток и нефрины, участвующие в межклеточной адгезии, более полная информация об активности FND-доменов в AXL отсутствует (непатентный документ 19).

AXL был идентифицирован как онкоген, который сохраняет характерную способность трансформировать клетки, его также рассматривали в качестве молекулы, связанной с канцерогенезом. Были представлены данные различных анализов экспрессии AXL на уровне белка и мРНК. Сообщалось о сверхэкспрессии белка AXL в опухолевых тканях и опухолевых клетках человека, в том числе рака легких (непатентный документ 20), рака молочной железы (непатентный документ 21), рака яичников (непатентный документ 22), рака щитовидной железы (непатентный документ 23), меланомы (непатентный документ 23), рака почки (непатентный документ 24), рака желудка (непатентный документ 12) и глиомы (непатентный документ 25). Кроме того, сверхэкспрессия белка AXL вызывается высокими уровнями мРНК AXL при раке пищевода (непатентный документ 26), раке толстой кишки (непатентный документ 27), остром миелобластном лейкозе (непатентный документ 28). Также имеются сообщения об ингибировании образования полостей клеток (люменов) при подавлении AXL с помощью иРНК в клетках HUVEC (непатентный документ 29), о пониженной способности раковых клеток рака молочной железы человека формировать опухоли у мышей в результате конститутивной супрессии AXL (непатентный документ 29), и о пониженной способности глиомных клеток человека формировать опухоли у мышей в результате конститутивной сверхэкспрессии у доминант-негативных мутантов (непатентный документ 25). Имеется твердое предположение об участии AXL на уровне его молекулярной активности в процессе роста опухолей.

Сообщалось, что поликлональные антитела к внеклеточному домену AXL оказывают ингибирующее действие на миграцию в клеточных линиях высокоинвазивного рака молочной железы (патентный документ 1). Однако доклинические исследования показали, что лекарственные средства, демонстрирующие ингибирующее действие на миграцию раковых клеток, не обязательно обладают противоопухолевую активность. Например, известно, что матричная металлопротеаза (далее сокращенно «MMP») способствует опухолевой инфильтрации и миграции. Таким образом, все внимание было сосредоточено на различных ингибиторах матричной металлопротеазы, которые ингибируют ферментативную активность MMP, и были проведены клинические исследования различных фармацевтических препаратов, таких как батимастат, маримастат и приномастат. Однако противоопухолевых эффектов в клинических испытаниях не наблюдалось (непатентный документ 30).

Соответственно, не существовало никаких сообщений или предположений, и остается неизвестно, обладает ли антитело против AXL какими-либо противоопухолевыми эффектами, в частности, in vivo, могут ли антитела подавлять ангиогенез, и могут ли они подавлять рак.

Патентный документ 1: WO 2004/008147

Непатентный документ 1: Liu, et al, Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 1952-6

Непатентный документ 2: Janssen, et al., Oncogene (1991) 6, 2113-20

Непатентный документ 3: O'Bryan, et al., Mol. Cell. Biol. (1991) 11, 5016-31

Непатентный документ 4: Varnum, et al., Nature (1995) 373, 623-626

Непатентный документ 5: Hafizi, et al., FEBS J. (2006) 273, 5231-5244

Непатентный документ 6: Nakano, et al., FEBS Lett. (1996) 387, 78-80

Непатентный документ 7: Nakano, et al., J. Biol. Chem. (1995) 270, 5702-5

Непатентный документ 8: Goruppi, et al., Mol. Cell. Biol. (1997) 17, 4442-53

Непатентный документ 9: Bellosta, et al., Oncogene (1997) 15, 2387-97

Непатентный документ 10: Stenhoff, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2004) 319, 871-8

Непатентный документ 11: Sainaghi, et al., J. Cell. Physiol. (2005) 204, 36-44

Непатентный документ 12: Sawabu, et al., Mol. Carcinog. (2007) 46, 155-164

Непатентный документ 13: Fridell, et al., J. Biol. Chem. (1998) 273, 7123-6

Непатентный документ 14: Allen, et al., Mol. Cell. Biol. (2002) 22, 599-613

Непатентный документ 15: McCloskey, et al., J. Biol. Chem. (1997) 272, 23285-91

Непатентный документ 16: Hafizi, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2002) 299, 793-800

Непатентный документ 17: Budagian et al., Embo J. (2005) 24, 4260-70

Непатентный документ 18: Vajkoczy P et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103, 5799-804

Непатентный документ 19: Yamagata et al., Curr. Opin. Cell. Biol. (2003) 15, 621-632

Непатентный документ 20: Shieh, et al., Neoplasia (2005) 7, 1058-1064

Непатентный документ 21: Meric, et al., Clin. Cancer Res. (2002) 8, 361-367

Непатентный документ 22: Sun, et al., Oncology (2004) 66,450-457

Непатентный документ 23: Ito, et al., Thyroid (2002) 12, 971-975

Непатентный документ 24: Chung, et al., DNA Cell Biol. (2003) 22, 533-540

Непатентный документ 25: Vajkoczy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103, 5799-804

Непатентный документ 26: Nemoto, et al., Pathobiology (1997) 65, 195-203

Непатентный документ 27: Craven, et al., Int. J. Cancer (1995) 60, 791-797

Непатентный документ 28: Neubauer, et al., Blood (1994) 84, 1931-1941

Непатентный документ 29: Holland, et al., Cancer Res. (2005) 65, 9294-9303

Непатентный документ 30: Pavlaki et al., Cancer Metastasis Rev. (2003) 22, 177-203

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[Проблемы, которые решаются данным изобретением]

Целью настоящего изобретения является создание антител против AXL и их использование. Более конкретно, целью настоящего изобретения является создание способов ингибирования ангиогенеза с помощью антител против AXL, способов подавления клеточного роста, способов ингибирования функции AXL, способов ускорения функции AXL и способов снижения уровня экспрессии AXL. Другой целью настоящего изобретения является создание антител против AXL с новыми эффектами.

[Средства решения проблем]

В результате проведения тщательных исследований, авторам настоящего изобретения удалось получить антитела против AXL со специфическими функциями, и обнаружить, что эти антитела обладают подавляющим ангиогенез эффектом и противоопухолевым эффектом, и тем самым было сделано настоящее изобретение. Более конкретно, настоящее изобретение включает:

[1] моноклональное антитело, которое связывается с AXL;

[2] антитело по п. [1], которое обладает активностью, подавляющей клеточный рост;

[3] антитело по п. [1], которое подавляет рост раковых клеток;

[4] антитело по любому из пп. [1]-[3], которое связывается с FND1;

[5] антитело, полученное с использованием в качестве антигена пептида, содержащего полноразмерный FND1 или последовательность, содержащую по меньшей мере пять или более последовательных аминокислот указанного пептида;

[6] антитело по любому из пп. [1]-[5], которое обладает агонистической активностью в отношении AXL;

[7] антитело по любому из пп. [1]-[5], которое обладает антагонистической активностью в отношении AXL;

[8] антитело по п. [7], полученное путем отбора антитела, у которого не обнаруживался фосфорилированный тирозин в AXL при контакте с клеткой, экспрессирующей AXL и лиганда AXL;

[9] антитело по любому из пп. [1]-[8], которое обладает активностью, снижающей уровень экспрессии AXL;

[10] антитело по любому из пп. [1]-[9], которое обладает активностью, ингибирующей ангиогенез;

[11] антитело по любому из следующих пп. (a)-(j):

(a) антитело (Ax285), полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10858;

(b) антитело (Ax292), полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10859;

(c) антитело (Ax223), полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10853;

(d) антитело (Ax96), полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10852;

(e) антитело (Ax258), полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10856;

(f) антитело (Ax284), полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10857;

(g) антитело (Ax7), полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10850;

(h) антитело (Ax51), полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10851;

(i) антитело (Ax225), полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10854; и

(j) антитело (Ax232), полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10855;

[12] антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и эпитоп, связанный с любым антителом по п. [11];

[13] антитело, которое содержит последовательность CDR, идентичную последовательности CDR, находящейся в любом из антител по п. [11];

[14] антитело, в котором последовательности CDR 1, 2 и 3 тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно;

[15] антитело, которое содержит CDR тяжелой цепи, включая аминокислотную последовательность CDR тяжелой цепи антитела по п. [14] с заменой, делецией, вставкой и/или добавлением одной или нескольких аминокислот, и которое функционально эквивалентно антителу по п. [14];

[16] антитело, в котором последовательности CDR 1, 2 и 3 легкой цепи представляют собой SEQ ID NO: 8, 9 и 10 соответственно;

[17] антитело, которое содержит CDR легкой цепи, включая аминокислотную последовательность CDR легкой цепи антитела по п. [16] с заменой, делецией, вставкой и/или добавлением одной или нескольких аминокислот, и которое функционально эквивалентно антителу по п. [16];

[18] антитело по любому из пп. [13]-[17], которое является химерным антителом;

[19] антитело по любому из пп. [13]-[17], которое является гуманизированным антителом;

[20] гибридома по любому из следующих пп. (a)-(j):

(a) гибридома с депозитарным номером FERM BP-10858 (Ax285);

(b) гибридома с депозитарным номером FERM BP-10859 (Ax292);

(c) гибридома с депозитарным номером FERM BP-10853 (Ax223);

(d) гибридома с депозитарным номером FERM BP-10852 (Ax96);

(e) гибридома с депозитарным номером FERM BP-10856 (Ax258);

(f) гибридома с депозитарным номером FERM BP-10857 (Ax284);

(g) гибридома с депозитарным номером FERM BP-10850 (Ax7);

(h) гибридома с депозитарным номером FERM BP-10851 (Ax51);

(i) гибридома с депозитарным номером FERM BP-10854 (Ax225); и

(j) гибридома с депозитарным номером FERM BP-10855 (Ax232);

[21] ингибитор ангиогенеза, содержащий антитело против AXL в качестве активного ингредиента;

[22] ингибитор ангиогенеза по п. [21], где антитело является антителом по любому из пп. [1]-[19];

[23] ингибитор клеточного роста, содержащий антитело против AXL в качестве активного ингредиента;

[24] ингибитор роста по п. [23], где клетки являются раковыми клетками;

[25] ингибитор роста по п. [23], где антитело является антителом по любому из пп. [1]-[19];

[26] ингибитор роста по п. [23], где антитело против AXL является антителом, связывающимся с FND1;

[27] ингибитор роста по п. [23], который содержит в качестве активного ингредиента антитело, которое связывается с IgD2 и обладает активностью ингибирования фосфорилирования;

[28] индуктор фосфорилирующей AXL активности, который содержит в качестве активного ингредиента антитело против AXL;

[29] индуктор по п. [28], где антитело против AXL является антителом, связывающимся с IgD;

[30] индуктор по п. [28], где антитело является антителом по п. [6];

[31] ингибитор активности фосфорилирующей AXL, который содержит антитело против AXL в качестве активного ингредиента;

[32] ингибитор по п. [31], где антитело против AXL является антителом, связывающимся с IgD2;

[33] ингибитор по п. [31], где антитело является антителом по п. [7] или п. [8];

[34] средство, снижающее уровень экспрессии AXL, которое содержит антитело против AXL в качестве активного ингредиента;

[35] средство, снижающее уровень экспрессии по п. [34], где антитело против AXL является антителом, связывающимся с FND1;

[36] средство, снижающее уровень экспрессии по п. [34], где антитело является антителом по п. [9];

[37] способ индукции фосфорилирования AXL с использованием антитела против AXL;

[38] способ снижения уровня экспрессии AXL с использованием антитела против AXL;

[39] способ ингибирования фосфорилирования AXL с использованием антитела против AXL;

[40] противораковое средство, содержащее антитело против AXL в качестве активного ингредиента;

[41] противораковое средство по п. [40], где антитело является антителом по любому из пп. [1]-[19];

[42] противораковое средство по п. [40], содержащее в качестве активного ингредиента антитело, которое связывается с IgD2 и обладает активностью ингибирования фосфорилирования;

[43] противораковое средство по п. [40], где рак является раком поджелудочной железы, раком желудка, раком легких, остеосаркомой, раком толстой кишки, раком предстательной железы, меланомой, раком эндометрия, раком яичников, лейомиомой матки, раком щитовидной железы, раком стволовых клеток, раком молочной железы, раком мочевого пузыря, раком почки, глиомой, нейробластомой или раком пищевода;

[44] противораковое средство по п. [42], где рак является глиомой, раком желудка, раком эндометрия, немелкоклеточным раком легкого, аденокарциномой поджелудочной железы или раком молочной железы;

[45] противораковое средство по п. [43], где рак является аденокарциномой поджелудочной железы или раком молочной железы;

[46] антитело по п. [1], которое обладает активностью ингибирования фосфорилирования;

[47] способ ингибирования ангиогенеза с использованием антитела против AXL;

[48] способ применения антитела против AXL при получении ингибитора ангиогенеза;

[49] подавления клеточного роста с использованием антитела против AXL;

[50] способ лечения и/или профилактики рака с использованием антитела против AXL;

[51] способ применения антитела против AXL при получении ингибитора клеточного роста;

[52] способ применения антитела против AXL при получении противоракового средства;

[53] способ применения антитела против AXL при получении индуктора фосфорилирования;

[54] способ применения антитела против AXL при получении ингибитора фосфорилирования;

[55] способ применения антитела против AXL при получении средства для снижения уровня экспрессии AXL; и

[56] способ получения антитела, специфичного в отношении AXL, включающий:

(a) иммунизацию животного, не человека, пептидом, содержащим полноразмерный FND1 или последовательность, содержащую по меньшей мере пять или более последовательных аминокислот указанного пептида; и

(b) сбор антител у животного, не человека, по п. (а) или сбор продуцирующих антитело клеток для сбора антитела, продуцируемого клетками, продуцирующими антитело.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1A представляет собой фотографию, на которой представлена активность моноклонального антитела против AXL (Ax292) по настоящему изобретению в отношении индукции фосфорилирования AXL в раковых клетках. Показано, что антитело индуцирует фосфорилирование киназного домена AXL.

Фигура 1B представляет собой фотографию, на которой показана активность моноклонального антитела против AXL (Ax258) по настоящему изобретению в отношении индукции фосфорилирования AXL в раковых клетках. Показано, что антитело индуцирует фосфорилирование киназного домена AXL.

Фигура 1C представляет собой фотографию, на которой показана активность моноклонального антитела против AXL (Ax285) по настоящему изобретению в отношении индукции фосфорилирования AXL в раковых клетках. Показано, что антитело индуцирует фосфорилирование киназного домена AXL.

Фигура 1D представляет собой фотографию, на которой показана активность моноклонального антитела против AXL (Ax223) по настоящему изобретению в отношении индукции фосфорилирования AXL в раковых клетках. Показано, что антитело индуцирует фосфорилирование киназного домена AXL.

Фигура 1E представляет собой фотографию, на которой показана активность моноклонального антитела против AXL (Ax96) по настоящему изобретению в отношении индукции фосфорилирования AXL в раковых клетках. Показано, что антитело индуцирует фосфорилирование киназного домена AXL.

Фигура 2A представляет собой фотографию, на которой показана активность моноклонального антитела против AXL (Ax51) по настоящему изобретению в отношении ингибирования лиганд-зависимого фосфорилирования AXL в клетке. Показано, что антитело ингибирует лиганд-зависимое фосфорилирование киназного домена AXL.

Фигура 2B представляет собой фотографию, на которой показана активность моноклонального антитела против AXL (Ax7) по настоящему изобретению в отношении ингибирования лиганд-зависимого фосфорилирования AXL в клетке. Показано, что антитело ингибирует лиганд-зависимое фосфорилирование киназного домена AXL.

Фигура 3A представляет собой фотографию, на которой показана активность моноклонального антитела против AXL (Ax292) по настоящему изобретению в отношении индукции деактивации AXL в раковых клетках. Показано, что антитело индуцирует деактивацию белка AXL.

Фигура 3B представляет собой фотографию, на которой показана активность моноклонального антитела против AXL (Ax284) по настоящему изобретению в отношении индукции деактивации AXL в раковых клетках. Показано, что антитело индуцирует деактивацию белка AXL.

Фигура 3C представляет собой фотографию, на которой показана активность моноклонального антитела против AXL (Ax285) по настоящему изобретению в отношении индукции деактивации AXL в раковых клетках. Показано, что антитело индуцирует деактивацию белка AXL.

Фигура 3D представляет собой фотографию, на которой показана активность моноклонального антитела против AXL (Ax223) по настоящему изобретению в отношении индукции деактивации AXL в раковых клетках. Показано, что антитело индуцирует деактивацию белка AXL.

Фигура 3E представляет собой фотографию, на которой показана активность моноклонального антитела против AXL (Ax7) по настоящему изобретению в отношении индукции деактивации AXL в раковых клетках. Показано, что антитело индуцирует деактивацию белка AXL.

Фигура 3F представляет собой фотографию, на которой показана активность моноклонального антитела против AXL (Ax225) по настоящему изобретению в отношении индукции деактивации AXL в раковых клетках. Показано, что антитело индуцирует деактивацию белка AXL.

Фигура 3G представляет собой фотографию, на которой показана активность моноклонального антитела против AXL (Ax96) по настоящему изобретению в отношении индукции деактивации AXL в раковых клетках. Показано, что антитело индуцирует деактивацию белка AXL.

Фигура 3H представляет собой фотографию, на которой показана активность моноклонального антитела против AXL (Ax258) по настоящему изобретению в отношении индукции деактивации AXL в раковых клетках. Показано, что антитело индуцирует деактивацию белка AXL.

Фигура 4 представляет собой рисунок и фотографию, на которых показаны активности моноклональных антител против AXL по настоящему изобретению (Ax232, Ax292, Ax285 и Ax284) в отношении ингибирования ангиогенеза in vitro. Показано, что антитела обладают активностью, ингибирующей ангиогенез in vitro.

Фигура 5 представляет собой рисунок, на котором показаны противоопухолевые эффекты моноклональных антител против AXL по настоящему изобретению (Ax223, Ax285, Ax96, Ax292, Ax258, Ax7, Ax51, Ax284 и Ax225) у ксенотрансплантатных моделей на мышах аденокарциномы поджелудочной железы человека.

Фигура 6 представляет собой таблицу, в которой показаны противоопухолевые эффекты моноклональных антител против AXL по настоящему изобретению (Ax223, Ax285, Ax96, Ax292, Ax258, Ax7, Ax51, Ax284 и Ax225) (2) у ксенотрансплантатных моделей на мышах от аденокарциномы поджелудочной железы человека, и в которой сведены связывающие домены и активности ингибирования фосфорилирования каждого антитела.

Фигура 7 представляет собой рисунок, на котором показаны противоопухолевые эффекты моноклонального антитела против AXL (Ax225) по настоящему изобретению у ксенотрансплантатных моделей на мышах рака молочной железы человека.

ЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новому антителу против AXL. Кроме того, настоящее изобретение относится к новому применению антитела против AXL.

Не существует никаких конкретных ограничений в отношении антитела против AXL по настоящему изобретению при условии, что оно связывается с AXL, и не существует также никаких особых ограничений в отношении источника его получения (например, человек, мышь, крыса, кролик или курица), тип (поликлональное антитело или моноклональное антитело), форму (например, измененное антитело, модифицированное антитело, фрагмент антитела, или мини-антитело [антитело с низким молекулярным весом]), и тому подобное. Хотя никаких особых ограничений на антитело против AXL по настоящему изобретению не существует, предпочтительно, антитело специфически связывается с AXL и, предпочтительно, является моноклональным антителом.

Антитело против AXL по настоящему изобретению также, предпочтительно, обладает подавляющей клеточный рост активностью.

Предпочтительным вариантом осуществления антител против AXL по настоящему изобретению являются антитела против AXL, связывающие FND1.

Как видно из примеров, описанных ниже, антитела, которые связываются с FND1, в частности, обладают более высокой in vivo противоопухолевой активностью по сравнению с активностью других антител.

Связывающая активность антител против AXL с FND1 может быть оценена способом, известным специалистам в данной области, например, одним из описанных ниже способов. Связывающую активность антитела против AXL с FND1 подтверждали электрофорезом FND1 и вестерн-блоттингом с антителом против AXL.

Антитело против AXL с агонистической в отношении AXL активностью является примером предпочтительного варианта осуществления антитела против AXL по настоящему изобретению. Антитело против AXL с агонистической в отношении AXL активностью имеет отношение к индукции фосфорилирования при участии AXL и, в частности, к индукции реакции фосфорилирования тирозина, когда антитело против AXL связывается с AXL. Хотя не существует никаких особых ограничений в отношении мишени в реакции фосфорилирования, которая вызвана антителом против AXL с агонистической активностью, пример включает автофосфорилирование AXL.

Обладает ли антитело против AXL агонистической активностью можно определить способом, известным специалистам в данной области, например, одним из описанных ниже способов. Исследуемое антитело против AXL приводили в контакт с клетками, экспрессирующими AXL (такими, как Calu-1, MDA-MB-231 или DU-145 клетки), и AXL затем извлекали из клеток. То, что тирозин в извлеченном AXL был фосфорилированным подтверждали, используя антитело против фосфотирозина. Более конкретнее, тот факт, что антитело против AXL обладает агонистической активностью, можно подтвердить способами, описанными в примерах.

Примеры антител против AXL с агонистической активностью включают антитела по пп. (a)-(g) ниже:

(а) антитело, полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10858 (Ax285);

(b) антитело, полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10852 (Ax96);

(c) антитело, полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10856 (Ax258);

(d) антитело, полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10859 (Ax292);

(е) антитело, полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10853 (Ax223);

(f) антитело, распознающее тот же эпитоп, что и эпитоп, распознаваемый антителом по любому из пп. (a)-(e); и

(g) антитело с последовательностью CDR, идентичной последовательности CDR антитела по любому из пп. (a)-(e).

Антитело, распознающее тот же эпитоп, что и антитело, описанное выше, может быть получено, например, в соответствии со способом, описанным ниже.

Имеет ли исследуемое антитело и какое-либо еще антитело общий эпитоп, может быть подтверждено конкуренцией двух антител за этот эпитоп. Конкуренцию между антителами обнаруживают с помощью эпитоп-перекрестного конкурентного анализа и тому подобное. Конкурентный анализ ELISA, например, является предпочтительнее эпитоп-перекрестного конкурентного анализа. В частности, в эпитоп-перекрестном конкурентном анализе белок AXL, нанесенный на лунки обычного микропланшета, преинкубируют в присутствии или в отсутствии возможного конкурентного антитела, затем добавляют отмеченное выше антитело против AXL. Количество вышеупомянутого антитела против AXL, связанного с белком AXL в лунках, косвенным образом коррелирует со связывающей способностью возможного конкурентного антитела (исследуемого антитела), конкурирующего за связывание с тем же эпитопом. Таким образом, чем больше аффинность исследуемого антитела к тому же эпитопу, тем больше сокращается количество вышеупомянутого антитела против AXL, связавшегося с лунками, покрытыми белком AXL, и тем больше увеличивается количество исследуемого антитела, связанного с лунками, покрытыми белком AXL.

Количество антитела, связанного с лунками, легко может быть измерено посредством предварительного мечения антитела. Например, меченое биотином антитело можно измерить с помощью авидин-пероксидазного конъюгата и подходящего субстрата. Эпитоп-перекрестный конкурентный анализ, который использует ферментную метку, такую как пероксидаза, называется конкурентным анализом ELISA. Антитела могут быть помечены другими маркирующими веществами, которые можно детектировать и измерять. В частности, известны радиоактивные метки и флуоресцентные метки.

Если исследуемое антитело имеет константную область, происходящую от иных биологических видов, чем отмеченное выше антитело против AXL, то количество антитела, связанного с лунками, также может быть измерено с помощью меченого антитела, распознающего константную область этого антитела. В противном случае, если антитело происходит от того же биологического вида, но принадлежит другому классу, то количество антитела, связанного с лунками, может быть измерено с помощью антител, распознающих любой класс.

Если возможное конкурентное антитело может блокировать связывание антитела против AXL, по меньшей мере на 20%, предпочтительно, по меньшей мере на 20%-50%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 50% по сравнению со связывающей активностью, полученной в контрольном тесте, проведенном при отсутствии возможного конкурентного антитела, то возможное конкурентное антитело является антителом, которое в значительной степени связывается с тем же эпитопом, или которое конкурирует с вышеупомянутым антителом против AXL за связывание с тем же эпитопом.

Определение последовательности CDR для получения антитела с той же последовательностью CDR, что и у конкретных антител, может быть выполнено специалистом в данной области известными способами. Например, последовательность CDR может быть определена путем определения полноразмерной аминокислотной последовательности антитела или аминокислотной последовательности вариабельной области, и изучения ее гомологии, используя установленную аминокислотную последовательность в базе данных аминокислотных последовательностей антител, созданную Кабатом и сотрудниками (Kabat et al., «Sequence of Proteins of Immunological Interest», US Dept. of Health and Human Services, 1983). Порядковые номера в рамке считывания и порядковые номера в последовательностях CDR могут быть определены в соответствии с границами, указанными Кабатом (Kabat, A.E. et al., US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991).

Полноразмерная аминокислотная последовательность антитела или аминокислотная последовательность вариабельной области может быть определена специалистом в данной области известными способами.

Антитело с той же последовательностью CDR, что и у конкретного антитела, может иметь идентичную последовательность, по крайней мере, одного из шести CDR, которые присутствуют в антителе. Однако антитело, предпочтительно, имеет одинаковую последовательность всех трех CDR, присутствующих в тяжелой цепи, или имеет одинаковую последовательность всех трех CDR, присутствующих в легкой цепи, и даже, более предпочтительно, антитело имеет одинаковую последовательность всех шести CDR, присутствующих в антителе.

Антитела с той же последовательностью CDR, что и у конкретного антитела, включают химерные антитела и гуманизированные антитела. Химерные антитела и гуманизированные антитела будут описаны ниже.

Примером другого предпочтительного варианта осуществления антитела против AXL по настоящему изобретению является антитело против AXL с антагонистической активностью в отношении AXL. Антитело против AXL с антагонистической активностью в отношении AXL представляет собой антитело с активностью, ингибирующей реакцию фосфорилирования при участии AXL, индуцированную связыванием лиганда AXL (такого, как Gas6) с AXL, и, конкретно, реакцию фосфорилирования тирозина. Ингибирование реакции фосфорилирования может быть осуществлено путем ингибирования связывания лиганда AXL и AXL, или другим способом. Хотя не существует никаких особых ограничений в отношении мишеней реакции ингибирования фосфорилирования, индуцированной антителом против AXL с антагонистической активностью, примеры включают автофосфорилирование AXL.

Обладает ли антитело против AXL антагонистической активностью можно определить способом, известным специалистам в данной области, например, описанным ниже способом. Исследуемое антитело приводили в контакт с клетками, экспрессирующими AXL (такими, как Calu-1, MDA-MB-231 или DU-145 клетки), вместе с лигандом AXL, и AXL затем извлекали из клеток. Было подтверждено, что фосфорилированный тирозин в извлеченном AXL невозможно детектировать, используя антитело против фосфотирозина. Конкретнее, то, что антитело против AXL обладает антагонистической активностью, можно подтвердить с помощью способов, описанных в примерах.

Примеры антител против AXL с антагонистической активностью включают антитела по пп. (a)-(d) ниже:

(a) антитело, полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10850 (Ax7);

(b) антитело, полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10851 (Ax51);

(с) антитело, распознающее тот же эпитоп, что и эпитоп, распознаваемый антителом по любому из пп. (a)-(b); и

(d) антитело, обладающее последовательностью CDR, идентичной последовательности CDR антитела по любому из пп. (a)-(c).

Антитело, распознающее тот же эпитоп, и антитело, обладающее идентичной последовательностью CDR, могут быть получены с помощью ранее описанных способов.

Антитело с антагонистической активностью пригодно для ингибирования ангиогенеза, подавления клеточного роста, и тому подобное.

Примером другого предпочтительного варианта осуществления антитела по настоящему изобретению является антитело с активностью, снижающей уровень экспрессии AXL. В настоящем изобретении снижение уровня экспрессии AXL может означать уменьшение количества уже присутствующего AXL путем деградации AXL или тому подобное, либо может означать уменьшение количества вновь экспрессированного AXL путем подавления экспрессии AXL. Снижается ли уровень экспрессии AXL, можно определить способом, известным специалистам в данной области, и например, описанным ниже способом. Исследуемое антитело против AXL приводили в контакт с клетками, экспрессирующими AXL (такими, как Calu-1, MDA-MB-231 или DU-145 клетки), и количество AXL в клетках затем детектировали иммуноблоттингом или тому подобное. Затем сравнивали количество обнаруженного AXL, если исследуемое антитело находилось в контакте, и количество обнаруженного AXL, если исследуемое антитело в контакте не находилось. Более конкретно, это можно подтвердить способами, описанными в примерах.

Примеры антител против AXL с активностью, снижающей уровни экспрессии AXL, включают антитела по пп. (a)-(j) ниже:

a) антитело (Ax285), полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10858;

(b) антитело (Ax96), полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10852;

(с) антитело (Ax258), полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10856;

(d) антитело (Ax7), полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10850;

(e) антитело (Ax292), полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10859;

(f) антитело (Ax223), полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10853;

(g) антитело (Ax225), полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10854;

(h) антитело (Ax284), полученное из гибридомы с депозитарным номером FERM BP-10857;

(i) антитело, распознающее тот же эпитоп, что и эпитоп, распознаваемый антителом по любому из пп. (a)-(h); и

(j) антитело, обладающее последовательностью CDR, идентичной последовательности CDR антитела по любому из пп. (a)-(i).

Антитело, распознающее тот же эпитоп, и антитело, обладающее идентичной последовательностью CDR, можно получить ранее описанным способом.

Антитело с активностью, снижающей уровень экспрессии AXL, может использоваться для ингибирования ангиогенеза, подавления клеточного роста, и тому подобное.

Примером другого предпочтительного варианта осуществления антитела по настоящему изобретению является антитело с эффектом ингибирования ангиогенеза. Хотя не существует никаких особых ограничений в отношении эффекта ингибирования ангиогенеза по настоящему изобретению, при условии, что новообраз