Антитела против гепсина и способы их применения

Антитела против гепсина и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет Предварительной заявки на патент США № 61/253953, поданной 22 октября 2009 года, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится, в общем, к области молекулярной биологии. Более конкретно, изобретение относится к антителам против гепсина и к их применению.

Уровень техники

Гепсин является трансмембранной сериновой протеазой типа II (TTSP), экспрессируемой на поверхности эпителиальных клеток. Этот 417-аминокислотный белок состоит из короткого N-концевого цитоплазматического домена, трансмембранного домена и единственного домена богатого цистеином фагоцитарного рецептора, который плотно упакован с С-концевым доменом протеазы (Somoza et al (2003) Structure 11(9), 1123-1131). Физиологическая функция гепсина до конца не известна. Несмотря на то, что он экспрессируется на очень ранних стадиях эмбриогенеза (Vu et al (1997) J Biol Chem 272 (50), 31315-31320), гепсин-недостаточные мыши были жизнеспособными и развивались нормально (Yu et al (2000) Thromb Haemost 84(5), 865-870; Wu et al (1998) J Clin Invest 101(2), 321-326). Было обнаружено, что гепсин не является незаменимым для регенерации печени и для связанных с коагуляцией физиологических функций (Id.). Недавнее исследование показало, что мыши с нокаутом гепсина имеют нарушенное слуховое восприятие (Guipponi et al. (2007) Am J Pathol 171:608-616). При этом, предполагалось участие гепсина при раке яичников [(Tanimoto et al (1997) Cancer Res 57(14), 2884-2887); WO2001/62271] и раке предстательной железы. Несколько исследований по экспрессии генов идентифицировали ген гепсина как один из наиболее высоко индуцируемых генов при раке предстательной железы (Dhanasekaran et al. (2001) Nature 412, 822-826; Luo et al. (2001) Cancer Res 61 (12), 4683-4688; Magee et al. (2001) Cancer Res 61(15), 5692-5696; Stamey et al. (2001) J Urol 166(6), 2171-2177; Stephan et al. (2004) J Urol 171(1), 187-191; Welsh et al. (20010) Cancer Res 61(16), 5974-5978). Было обнаружено, что в нормальной предстательной железе и в случае доброкачественной гиперплазии уровни РНК гепсина являются низкими, а при раке предстательной железы, особенно в запущенных стадиях, уровни резко повышаются ((Dhanasekaran et al. (2001) Nature 412, 822-826; Luo et al. (2001) Cancer Res 61 (12), 4683-4688; Magee et al (2001) Cancer Res 61(15), 5692-5696; Stamey et al. (2001) J Urol 166(6), 2171-2177; Stephan et al. (2004) J Urol 171(1), 187-191; Welsh et al (20010) Cancer Res 61(16), 5974-5978). Окрашивание белка гепсина моноклональным антителом против гепсина показало, что экспрессия гепсина была максимальной в местах метастазирования в кости и на поздней стадии первичных опухолей (Xuan et al (2006) Cancer Res 66(7), 3611-3619), что согласуется с информацией о том, что увеличенные уровни РНК гепсина коррелируют с более высокими степенями Глеазона и прогрессированием опухоли ((Luo et al. (2001) Cancer Res 61(12), 4683-4688; Magee et al. (2001) Cancer Res 61(15), 5692-5696; Stamey et al. (2001) J Urol 166(6), 2171-2177; Stephan et al. (2004) J Urol 171(1), 187-191; Chen et al. (2003) J Urol 169(4), 1316-1319).

Экспериментальное доказательство роли гепсина при раке предстательной железы появилось на основании исследования Klezovitch et al. (Klezovitch et al. (2004) Cancer Cell 6(2), 185-195), демонстрируя, что на моделях мыши неметастазирующего рака предстательной железы сверхэкспрессия гепсина приводила к прогрессированию и метастазированию первичных опухолей. Удивительно, что сверхэкспрессия гепсина была связана с разрушением базальной мембраны (Id.), что указывает на возможность того, что активность гепсина каким-то образом связана с деградацией компонентов базальной мембраны. In vitro гепсин способен преобразовываться в латентный фактор роста (прогепатоцитарный фактор роста (pro-HGF)) в его активную двухцепочечную форму (HGF), которая индуцировала передачу сигнала рецептора Met (Herter et al. (2005) Biochem J 390 (Pt 1), 125-136; Kirchhofer et al. (2005) FEBS Lett 579(9), 1945-1950; WO2006/014928). Гепсин способен также превращать pro-uPA в его активную форму (Moran et al., (2006) J Biol Chem. 281 (41):30439-46) и расщеплять ламин in vitro (Tripathi et al. (2008) J Biol Chem. 283:30576). Поскольку предполагалось, что HGF/Met-путь участвует в инвазивном росте и метастазировании опухолей, возможно, что сверхэкспрессия гепсина активирует систему HGF/Met при раке предстательной железы (Herter et al. (2005) Biochem J 390 (Pt 1), 125-136; Kirchhofer et al. (2005) FEBS Lett 579(9), 1945-1950; WO2006/014928). Было показано также, что гепсин расщепляет другие субстраты in vitro, в основном связанные с коагуляцией белка (Herter et al., id; Kazama et al. (1995) J Biol Chem 270(1), 66-72). Однако их роль в онкогенезе неизвестна.

Ясно, что остается потребность в средствах, которые имеют клинические признаки, которые являются оптимальными для развития в виде терапевтических средств. Описанное в настоящем описании изобретение удовлетворяет этой потребности и обеспечивает другие преимущества.

Все цитируемые в настоящем описании ссылки, в том числе, заявки на патент и публикации, включены в качестве ссылки в полном объеме.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение основывается на идентификации различных гепсин-связывающих агентов (таких как антитела и их фрагменты). Гепсин представляет собой важную и выгодную терапевтическую мишень, и изобретение относится к композициям и к способам, основанным на связывании этих агентов с гепсином. Гепсин-связывающие агенты по настоящему изобретению, описанные в настоящем описании, обеспечивают важные терапевтические и диагностические средства для применения в нацеливании на патологические состояния, связанные с экспрессией и/или активностью путей передачи сигналов гепсина. Таким образом, изобретение относится к способам, композициям, наборам и изделиям, относящимся к связыванию гепсина.

Активный сайт трипсин-подобных сериновых протеаз, таких как гепсин, образован несколькими внутренне мобильными петлями ('доменом активации') (Huber and Bode, 1978). В частности, 220-петля образует часть кармана S1 и может принимать различные конформационные состояния в некоторых сериновых протеазах (Johnson et al., 2005; Shia et al., 2005; Spraggon et al., 2009; Wilken et al., 2004). Однако структуры ко-кристаллов сериновых протеаз с ингибитором активного центра показали правильно образованные активные сайты, наиболее вероятно, вследствие стабилизирующих сил, прилагаемых ингибитором (Arni et al., 1994; Shia et al., 2005; Spraggon et al., 2009). Было разумным предположить, что занятие кармана S1 ингибитором сериновой протеазы может прилагать стабилизирующие силы к гибкости петель активного центра сериновой протеазы, облегчая распознавание антителом активного центра сериновой протеазы. Таким образом, для идентификации антител против гепсина, которые блокируют ферментативную активность гепсина, получали антитела, которые связывают гепсин в комплексе с ингибитором сериновой протеазы, который занимает карман S1, 3,4-дихлоризокумарином (DCI).

Настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с гепсином. В одном из аспектов изобретение относится к выделенному антителу, которое связывается с гепсином.

В одном из аспектов изобретение относится к выделенному антителу против гепсина, где одновалентная форма (такая как Fab-форма) антитела специфически связывается с гепсином человека с аффинностью связывания приблизительно 10 нМ или лучшей. В некоторых вариантах осуществления антитело специфически связывается с гепсином человека с аффинностью связывания приблизительно 6 нМ или лучшей. Как установлено в данной области, аффинность связывания лиганда с его рецептором может быть определена с использованием любого из разнообразия анализов и выражена в терминах различных количественных величин. Так, в одном из вариантов осуществления аффинность связывания выражена в виде величин K_D и отражает внутреннюю аффинность связывания (например, с минимизированными эффектами авидности). Обычно и предпочтительно, аффинность связывания измеряют in vitro, независимо от того, в бесклеточной среде или в связанной с клетками среде. Любой из множества анализов, известных в данной области, в том числе, описанных в настоящем описании, может быть использован для получения измерений аффинности связывания, например, Biacore, радиоиммуноанализ (RIA) и ELISA.

В другом аспекте изобретение относится к антителам против гепсина, которые связывают область связывающего домена Кунитца гепсина. В одном из аспектов изобретение относится к выделенному антителу против гепсина, которое конкурирует с доменом Кунитца за связывание с гепсином. В одном из вариантов осуществления указанной последовательностью домена Кунитца является домен Кунитца 1 (KD1) HAI-1 или HAI-1B. В одном из вариантов осуществления последовательностью домена Кунитца является вариантная последовательность KD1, имеющая по меньшей мере приблизительно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% идентичность последовательности с KD1 дикого типа HAI-1 человека, где указанная вариантная последовательность имеет по меньшей мере сравнимую способность с KD1 дикого типа в ингибировании активности гепсина. В одном из вариантов осуществления указанная последовательность домена Кунитца является одной или несколькими доменами Кунитца HAI-2. В одном из вариантов осуществления вариантная последовательность домена Кунитца HAI-2 находится между приблизительно 70% и 99%, приблизительно 75% и 98%, приблизительно 80% и 97%, 85% и 95% идентичностью с соответствующими доменом (доменами) Кунитца HAI-2 дикого типа человека, где указанная последовательность имеет по меньшей мере сравнимую способность HAI-2 дикого типа в ингибировании активности гепсина.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителам против гепсина, которые связываются с каталитическим центром гепсина.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителам против гепсина, которые связываются с гепсином вне субсайта s1. В некоторых вариантах осуществления антитела связываются с субсайтом гепсина s2 и/или s3.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителам против гепсина, которые связываются каталитически с инактивированным гепсином.

В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, которые являются устойчивыми к протеолизу гепсина. В некоторых вариантах осуществления эти антитела доступны для гепсина в течение 24 часов при условиях, обеспечивающих расщепление гепсином субстрата гепсина.

В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, которые связывают гепсин, присутствующий в комплексе, содержащем гепсин и ингибитор сериновой протеазы, который связывает субсайт S1 гепсина. В некоторых вариантах осуществления гепсин, присутствующий в комплексе, является инактивированным. В некоторых вариантах осуществления ингибитором сериновой протеазы является 3,4-дихлоризокумарин. (DCI). В некоторых вариантах осуществления ингибитор сериновой протеазы связывает каталитические аминокислотные остатки гепсина Ser195 и His57, посредством чего гепсин инактивируется.

В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, которые связываются специфически с гепсином человека и по существу ингибируют in vivo и/или in vitro ферментативную активность гепсина. В одном из вариантов осуществления ферментативная активность включает расщепление полипептидного субстрата гепсина. В одном из вариантов осуществления этим полипептидным субстратом гепсина является один или несколько из стимулирующего про-макрофаги белка (pro-MSP), pro-uPA, Фактора VII и pro-HGF. Активация гепсином pro-MSP описана в находящейся в процессе одновременного рассмотрения Предварительной заявке на патент США № 61/253990, поданной 22 октября, 2009 года. В одном из вариантов осуществления ферментативная активность включает расщепление синтетического субстрата гепсина. В некоторых вариантах осуществления синтетическим субстратом гепсина является субстрат, показанный в таблице 1.

В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, причем антитела по существу ингибируют каталитическую активность гепсина человека и/или мыши. В некоторых вариантах осуществления одновалентная форма антитела против гепсина ингибирует каталитическую активность гепсина человека с Ki приблизительно (в некоторых вариантах осуществления меньшей или равной) 4 нМ. В некоторых вариантах осуществления одновалентная форма антитела против гепсина ингибирует каталитическую активность гепсина мыши с Ki приблизительно (в некоторых вариантах осуществления, меньшей или равной) 330 нМ.

В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, где эти антитела по существу ингибируют расщепление гепсином pro-uPA. В некоторых вариантах осуществления антитела против гепсина ингибируют расщепление гепсином pro-uPA с IC₅₀ приблизительно 3 нМ или более сильным.

В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, где антитела по существу ингибируют ламинин-зависимую миграцию клеток.

В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, где антитела получены способом, предусматривающим отбор антител, которые связывают комплекс, содержащий (a) гепсин и (b) ингибитор сериновой протезы, который связывает субсайт S1 гепсина. В некоторых вариантах осуществления гепсин, присутствующий в этом комплексе, является инактивированным. В некоторых вариантах осуществления ингибитором сериновой протеазы является 3,4-дихлоризокумарин (DCI). В некоторых вариантах осуществления ингибитор сериновой протеазы связывает каталитические аминокислотные остатки гепсина Ser195 и His 57, посредством чего гепсин инактивируется. В некоторых вариантах осуществления перед отбором (селекцией) антитела, антитело инкубируют с гепсином и ингибитором сериновой протеазы. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию отбора антител, которые конкурируют за связывание гепсина с доменом Кунитца. В некоторых вариантах осуществления доменом Кунитца является KD1.

В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, где антитела получают способом, предусматривающим отбор (идентификацию) антител, которые конкурируют с доменом Кунитца за связывание гепсина. В некоторых вариантах осуществления доменом Кунитца является KD1.

В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, которые по существу не расщепляются гепсином. В некоторых вариантах осуществления антитела против гепсина являются по существу устойчивыми к расщеплению гепсином.

Обычно, антитела против гепсина настоящего изобретения являются антагонистическими антителами.

В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, содержащим: последовательности по меньшей мере одного, двух, трех, четырех, пяти и/или шести гипервариабельных областей (HVR), выбранных из группы, состоящей из:

(a) HVR-L1, содержащего последовательность RASQSVSSAVA (SEQ ID NO:1),

(b) HVR-L2, содержащего последовательность SASSLYS (SEQ ID NO:2),

(c) HVR-L3, содержащего последовательность QQYYSSYYLLT (SEQ ID NO:3),

(d) HVR-H1, содержащего последовательность GFNFSYSYMH (SEQ ID NO:4),

(e) HVR-H2, содержащего последовательность ASIYSYYGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:5), и

(f) HVR-H3, содержащего последовательность ARSDSWSYKSGYTQKIYSKGLDY (SEQ ID NO:6).

В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, содержащим (a) легкую цепь, содержащую (i) HVR-L1, содержащий последовательность RASQSVSSAVA (SEQ ID NO:1); (ii) HVR-L2, содержащий последовательность SASSLYS (SEQ ID NO:2); и (iii) HVR-L3, содержащий последовательность QQYYSSYYLLT (SEQ ID NO:3); и/или (b) тяжелую цепь, содержащую последовательность, содержащую (i) HVR-H1, содержащий последовательность GFNFSYSYMH (SEQ ID NO:4); (ii) HVR-H2, содержащий последовательность ASIYSYYGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:5); и (iii) HVR-H3, содержащий последовательность ARSDSWSYKSGYTQKIYSKGLDY (SEQ ID NO:6).

В одном из аспектов изобретение относится к антителу против гепсина, содержащему HVR-L1, содержащий последовательность SEQ ID NO:1. В одном из аспектов изобретение относится к антителу против гепсина, содержащему HVR-L2, содержащий последовательность SEQ ID NO:2. В одном из аспектов изобретение относится к антителу против гепсина, содержащему HVR-L3, содержащий последовательность SEQ ID NO:3. В одном из аспектов изобретение относится к антителу против гепсина, содержащему область HVR-H1, содержащую последовательность SEQ ID NO:4. В одном из аспектов изобретение относится к антителу против гепсина, содержащему область HVR-H2, содержащую последовательность SEQ ID NO:5. В одном из аспектов изобретение относится к антителу против гепсина, содержащему область HVR-H3, содержащую последовательность SEQ ID NO:6.

В одном из аспектов антитело против гепсина содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, где каждая, по порядку, содержит последовательность RASQDVN/STAVA (SEQ ID NO:7), SEQ ID NO:2, 3, и/или область тяжелой цепи, содержащую HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая, по порядку, содержит SEQ ID NO:4, 5, 6.

В одном из аспектов антитело против гепсина содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, где каждая, по порядку, содержит последовательность RASQDVN/STAVA (SEQ ID NO:7), SEQ ID NO:1, последовательность SASFLYS (SEQ ID NO:8), SEQ ID NO:3, и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая, по порядку, содержит SEQ ID NO:4, 5, 6.

В одном из аспектов антитело против гепсина содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, где каждая, по порядку, содержит SEQ ID NO:7, 8, 3, и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая, по порядку, содержит SEQ ID NO:4, 5, 6.

В аминокислотных последовательностях SEQ ID NO:1-6 указана нумерация индивидуальных HVR (т.е., H1, H2 или H3), как показано на фигуре 1, причем нумерация соответствует системе нумерации Кабата, описанной ниже.

Антитела по настоящему изобретению могут содержать любую подходящую каркасную последовательность вариабельного домена, при условии, что активность связывания гепсина является по существу сохраненной. Например, в некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению содержат каркасную консенсусную последовательность тяжелой цепи подгруппы III человека. В одном из вариантов осуществления этих антител, каркасная консенсусная последовательность содержит замену в положении 71, 73 и/или 78. В некоторых вариантах осуществления этих антител, положение 71 соответствует A, 73 соответствует T и/или 78 соответствует A. В одном из вариантов осуществления эти антитела содержат каркасные последовательности вариабельного домена тяжелой цепи huMAb4D5-8 (HERCEPTIN^®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (также упоминаемые в патентах США 6407213 и 5821337 и Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-1093). В одном из вариантов осуществления антитела дополнительно содержат каркасную консенсусную последовательность легкой цепи κI человека. В некоторых вариантах осуществления каркасная консенсусная последовательность содержит замену в положении 66. В некоторых вариантах осуществления, положение 66 соответствует G. В одном конкретном варианте осуществления антитела содержат последовательности HVR легкой цепи huMAb4D5-8, описанные в патентах США 6407213 и 5821337). В одном из вариантов осуществления антитела содержат последовательности легкой цепи вариабельного домена huMAb4D5-8 (HERCEPTIN^®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (также упоминаемые в патентах США 6407213 и 5821337, и Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-1093).

В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению изобретение содержит вариабельный домен тяжелой цепи, где каркасная последовательность содержит последовательности, описанные на фигурах 2А-В, и последовательности HVR H1, H2 и H3 являются SEQ ID NO:4, 5 и/или 6, соответственно.

В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, где каркасная последовательность содержит последовательность SEQ ID NO:14-15, 48 и/или 16, и последовательности HVR H1, H2 и H3 являются SEQ ID NO:4, 5 и/или 6, соответственно. В другом варианте осуществления, каркасная последовательность содержит последовательность SEQ ID NO:14-15, 43 и/или 16 и последовательности HVR H1, H2 и H3 являются SEQ ID NO:4, 5 и/или 6, соответственно.

В одном конкретном варианте осуществления, антитело по настоящему изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность содержит последовательность SEQ ID NO:17-20; 49-51 и 20; 52-54 и 20; и/или 55-57 и 20, соответственно, и последовательности HVR L1, L2 и L3 являются SEQ ID NO:1, 2 и/или 3, соответственно. В другом варианте осуществления, антитело по настоящему изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность содержит последовательность SEQ ID NO:17-18, 58 и/или 20, и последовательности HVR L1, L2 и L3 являются SEQ ID NO:1, 2 и/или 3, соответственно. В другом варианте осуществления антитело по настоящему изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность содержит последовательность SEQ ID NO:17, 18, 19 и/или 20, и последовательности HVR L1, L2 и L3 являются SEQ ID NO:1, 2 и/или 3, соответственно.

В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, где каркасная последовательность содержит последовательность SEQ ID NO:14-15, 43 и/или 16, и последовательности HVR H1, H2 и H3 являются SEQ ID NO:4, 5 и/или 6, соответственно, и вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность содержит последовательность SEQ ID NO:17-18, 58 и/или 20, и последовательности HVR L1, L2 и L3 являются SEQ ID NO:1, 2 и/или 3, соответственно.

В другом аспекте антитело по настоящему изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:10, и/или вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:9.

В другом аспекте антитело по настоящему изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:10, и вариабельный домен легкой цепи.

В другом аспекте антитело по настоящему изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:9, и вариабельный домен тяжелой цепи.

Некоторые варианты осуществления антител по настоящему изобретению содержат вариабельный домен легкой цепи гуманизированного антитела 4D5 (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (также упоминаемого в патентах США 6407213 и Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93), как представлено в SEQ ID NO:11, ниже.

1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID NO:11)

(остатки HVR подчеркнуты)

В одном из вариантов осуществления последовательность вариабельного домена легкой цепи huMAb4D5-8 модифицирована в одном или нескольких положениях 30, 66 и 91 (Asn, Arg и His, как указано жирным шрифтом/курсивом выше, соответственно). В одном из вариантов осуществления модифицированная последовательность huMAb4D5-8 содержит Ser в положении 30, Gly в положении 66 и/или Ser в положении 91. Таким образом, в одном из вариантов осуществления, антитело по настоящему изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:45, ниже:

1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID NO:45)

(остатки HVR подчеркнуты).

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителу против гепсина, которое конкурирует с любым из вышеупомянутых антител за связывание с гепсином. В одном из аспектов изобретение относится к антителу против гепсина, которое связывается с тем же самым или сходным эпитопом на гепсине, что и вышеупомянутые антитела.

Как известно в данной области и как описано более подробно в настоящем описании ниже, положение/граница аминокислоты, определяющие гипервариабельную область антитела, могут варьироваться в зависимости от контекста и различных определений, известных в данной области (как описано ниже). Некоторые положения в вариабельном домене могут рассматриваться как гибридные гипервариабельные положения, в том смысле, что можно считать, что эти положения находятся в пределах гипервариабельного домена при одном наборе критериев, тогда как можно считать, что они находятся вне гипервариабельного домена при другом наборе критериев. Одно или несколько этих положений могут быть также обнаружены в растянутых гипервариабельных областях (как определено ниже).

В некоторых вариантах осуществления антитело является моноклональным антителом. В других вариантах осуществления антитело является поликлональным антителом. В некоторых вариантах осуществления антитело выбрано из группы, состоящей из химерного антитела, аффинно зрелого антитела, гуманизированного антитела и антитела человека. В некоторых вариантах осуществления антитело является фрагментом антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело является Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂ или scFv.

В одном из вариантов осуществления антитело является химерным антителом, например, антителом, содержащим антиген-связывающие последовательности из донора-не-человека, трансплантированные в гетерологичную последовательность, которая не относится к области человека, человека или гуманизированную последовательность (например, каркасные последовательности и/или последовательности константного домена). В одном из вариантов осуществления, этим донором, не являющимся человеком, является мышь. В следующем варианте осуществления, антиген-связывающая последовательность является синтетической, например, полученной мутагенезом (например, скринингом фагового дисплея и т.д.). В одном конкретном варианте осуществления химерное антитело по настоящему изобретению имеет V-области мыши и С-область человека. В одном из вариантов осуществления V-область мыши легкой цепи слита с легкой цепью каппа человека. В другом варианте осуществления V-область мыши тяжелой цепи слита с С-областью IgG1 человека.

Гуманизированные антитела по настоящему изобретению включают антитела, которые имеют аминокислотные замены в каркасной области (FR), и аффинно зрелые варианты с изменениями в трансплантированных CDR. Замененные аминокислоты в CDR или FR не ограничиваются аминокислотами, присутствующими в донорском или реципиентном антителе. В других вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению дополнительно содержат изменения в аминокислотных остатках в Fc-области, которые приводят к улучшенной эффекторной функции, в том числе повышенной CDC- и/или ADCC-функции и B-клеточном убивании. Другие антитела по настоящему изобретению включают антитела, имеющие специфические изменения, которые улучшают стабильность. В других вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению содержат изменения в аминокислотных остатках в Fc-области, которые приводят к уменьшенной эффекторной функции, например, CDC- и/или ADCC-функции и/или уменьшенному В-клеточному убиванию. В некоторых вариантах осуществления, антитела по настоящему изобретению характеризуются уменьшенным связыванием (например, отсутствием связывания) с фактором комплемента C1q человека и/или Fc-рецептором человека на природных клетках-киллерах (NK). В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению характеризуются уменьшенным связыванием (например, отсутствием связывания) с FcγRI, FcγRIIA и/или FcγRIIIA человека. В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению являются антителами класса IgG (например, IgG1 или IgG4) и содержат по меньшей мере одну мутацию в E233, L234, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 и/или P329 (нумерация согласно EU индексу). В некоторых вариантах осуществления эти антитела содержат мутации L234A/L235A или D265A/N297A.

В одном из аспектов изобретение относится к гепсин-связывающим полипептидам, содержащим любую из антиген-связывающих последовательностей, обеспеченных в настоящем описании, где гепсин-связывающие полипептиды специфически связываются с гепсином, например, с гепсином человека и/или собакоподобной обезьяны и/или мыши.

Антитела по настоящему изобретению связываются (например, специфически связываются) с гепсином и в некоторых вариантах осуществления могут модулировать (например, ингибировать) один или несколько аспектов активности гепсина (например, ферментативную активность гепсина), и/или разрушать любой биологически релевантный гепсин и/или биологический путь полипептидного субстрата гепсина, и/или лечение и/или предотвращение опухоли, клеточно-пролиферативного нарушения или рака; и/или лечение и/или предотвращение нарушения, связанного с экспрессией и/или активностью гепсина (например, увеличенной экспрессии и/или активности гепсина). В некоторых вариантах осуществления антитело против гепсина специфически связывается с полипептидом, состоящим или по существу состоящим из гепсина (например, гепсина человека и/или мыши). В одном из вариантов осуществления ферментативная активность гепсина включает расщепление полипептидного субстрата гепсина. В одном из вариантов осуществления полипептидным субстратом гепсина является один или несколько из стимулирующего про-макрофага белка (pro-MSP), pro-uPA, Фактора VII и pro-HGF.

В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению не является антителом против гепсинам, описанным в Cancer Research, Volume 66, pages 3611-3619, опубликованным в 2006 году (например, антителом 1A12, 85B11, 94A7, A6, A174, A21 и/или A24, описанным на фигуре 4), или выделенным антителом гепсина, описанным в PCT публикациях WO2004/033630 (например, антителом 47A5, 14C7, 46D12, 38E2, 37G10, 31C1, 11C1 и/или 72H6, описанным на странице 93 и на фигурах 15A-D), или выделенным антителом гепсина, описанным в Xuan et al (2006) Cancer Res 66(7), 3611, или антителом гепсина, описанным в WO2007/149932.

В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению не конкурирует за связывание с гепсином человека с антителом против гепсина, описанным в Cancer Research, Volume 66, pages 3611-3619, опубликованным в 2006 году (например, антителом 1A12, 85B11, 94A7, A6, A174, A21 и/или A24, описанным на фигуре 4), или выделенным антителом гепсина, описанным в PCT публикациях WO2004/033630 (например, антителом 47A5, 14C7, 46D12, 38E2, 37G10, 31C1, 11C1 и/или 72H6, описанным на странице 93 и на фигурах 15A-D), или выделенным антителом гепсина, описанным в Xuan et al (2006) Cancer Res 66(7), 3611, или антителом гепсина, описанным в WO2007/149932.

В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению не связывается с тем же самым эпитопом на гепсине человека, что и антитело против гепсина, описанное в Cancer Research, Volume 66, pages 3611-3619, опубликованном в 2006 году (например, антитело 1A12, 85B11, 94A7, A6, A174, A21 и/или A24, описанное на фигуре 4), или выделенное антитело гепсина, описанное в PCT публикациях WO2004/033630 (например, антитело 47A5, 14C7, 46D12, 38E2, 37G10, 31C1, 11C1 и/или 72H6, описанное на странице 93 и на фигурах 15A-D), или выделенное антитело гепсина, описанное в Xuan et al (2006) Cancer Res 66(7), 3611, или антитело гепсина, описанное в WO2007/149932.

В одном из аспектов изобретение относится к композициям, содержащим одно или несколько антител по настоящему изобретению и носитель. В одном из вариантов осуществления носитель является фармацевтически приемлемым.

В другом аспекте изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим антитело гепсина по настоящему изобретению.

Еще в одном из аспектов изобретение относится к векторам, содержащим нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению.

В следующем аспекте изобретение относится к композициям, содержащим одну или несколько нуклеиновых кислот по настоящему изобретению и носитель. В одном из вариантов осуществления носитель является фармацевтически приемлемым.

В одном из аспектов изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим нуклеиновую кислоту или вектор по настоящему изобретению. Вектор может быть вектором любого типа, например, рекомбинантным вектором, таким как вектор экспресии. Может быть использовано множество клеток-хозяев. В одном из вариантов осуществления клетка-хозяин является прокариотической клеткой, например, E. coli. В другом варианте осуществления клетка-хозяин может быть эукариотической клеткой, например, клеткой млекопитающего, такой как Клетка Яичника Китайского Хомячка (CHO).

В следующем аспекте изобретение относится к способам получения антитела по настоящему изобретению. Например, изобретение относится к способам получения антитела против гепсина (которое в данном контексте включает полноразмерное антитело и его фрагменты), предусматривающим культивирование клетки-хозяина, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую гуманизированное антитело, таким образом, что нуклеиновая кислота экспрессируется. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает выделение антитела из культуры клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления антитело извлекают из культуральной среды клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает объединение выделенного антитела с фармацевтически приемлемым носителем, эксципиентом или носителем для приготовления фармацевтической композиции, содержащей гуманизированное антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам получения антитела против гепсина, предусматривающим отбор антител, которые связывают комплекс, содержащий (а) гепсин и (b) ингибитор сериновой протеазы, который связывает субсайт S1 гепсина. В некоторых вариантах осуществления гепсин, присутствующий в комплексе, является инактивированным. В некоторых вариантах осуществления, ингибитором сериновой протеазы является 3,4-дихлоризокумарин (DCI). В некоторых вариантах осуществления ингибитор сериновой протеазы связывает каталитические аминокислотные остатки гепсина Ser195 и His 57, посредством чего гепсин инактивируется. В некоторых вариантах осуществления перед отбором антитела, антитело инкубируют с гепсином и ингибитором сериновой протеазы. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию отбора антител, которые конкурируют за связывание с гепсином с доменом Кунитца. В некоторых вариантах осуществления домен Кунитца является KD1.

В одном из аспектов изобретение относится к изделию, содержащему контейнер; и композиции, содержащейся в этом контейнере, где композиция содержит одно или несколько антител гепсина по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления композиция содержит нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления композиция, содержащая антитело, дополнительно содержит носитель, который в некоторых вариантах осуществления является фармацевтически приемлемым. В одном из вариантов осуществления изделие изобретения дополнительно содержит инструкции для введения этой композиции (например, антитела) индивидууму (такие как инструкции для любого из описанных в настоящем описании способов).

В другом аспекте изобретение относится к набору, содержащему первый контейнер, содержащий композицию, содержащую одно или несколько антител против гепсина по настоящему изобретению; и второй контейнер, содержащий буфер. В одном из вариантов осуществления буфер является фармацевтически приемлемым. В одном из вариантов осуществления, композиция, содержащая антитело, дополнительно содержит носитель, который в некоторых вариантах осуществления является фармацевтически приемлемым. В другом варианте осуществления набор дополнительно содержит инструкции для введения этой композиции (например, антитела) индивидууму.

Путь гексина участвует во множественных биологических и физиологических функциях, включающих, например, активацию пути HGF/c-met, активацию пути MSP/Ron, разрушение/деградацию базальной мембраны и т.д. Эти функции, в свою очередь, часто являются нарушенными в таких нарушениях, как рак. Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к способу ингибирования нарушения/деградации базальной мембраны и/или матриксной деградации, предусматривающему приведение в контакт клетки или ткани с антагонистом по настоящему изобретению, посредством чего ингибируется разрушение/деградация базальной мембраны и/или матриксная деградация. Еще в одном из аспектов изобретение относится к способу ингибирования нарушения/деградации базальной мембраны и/или матриксной деградации, предусматривающему введение в клетку, ткань и/или индивиду с состоянием, связанным с аномальными разрушением/деградацией базальной мембраны и/или матриксной деградацией, антагониста по настоящему изобретению, посредством чего ингибируется разрушение/деградация базальной мембраны и/или матриксная деградация.

В одном из аспектов изобретение относится к