Диагностические и терапевтические способы

Диагностические и терапевтические способы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области идентификации пациентов с ревматическим пороком сердца (RHD), связанным с инфекцией Streptococcus pyogenes (Streptococcus группы A; GAS) и идентификации пациентов с риском развития RHD, связанного с инфекцией GAS. Изобретение также относится к способам и композициям для профилактики и лечения RHD, связанного с инфекцией GAS.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Патоген человека Streptococcus группы A (Streptococcus pyogenes, GAS) широко известен как основная причина общего фарингита. Кроме того, инфекции этой бактерией могут приводить к тяжелым инвазивным заболеваниям, а также к негнойным аутоиммунным осложнениям. Острая ревматическая лихорадка (ARF) представляет собой многоочаговое аутоиммунное заболевание, возникающее у 0,1-3% индивидуумов после нелеченой инфекции GAS.

ARF диагностируют по обновленным критериям Джонса, которые впервые опубликованы в 1944 годы. По обновленным критериям Джонса диагноз ARF можно поставить при наличии двух больших критериев (мигрирующий полиартрит; кардит; подкожные узелки; ревматоидная эритема; хорея Сиденгама), или одного большого критерия и большого критерия и двух малых критериев (лихорадка; артралгия; повышенные скорость осаждения эритроцитов или C-реактивный белок; лейкоцитоз; ECG, демонстрирующая признаки блокады сердца), наряду с признаками инфекции GAS.

Основным клинически значимым осложнением ARF является ревматический порок сердца (RHD). RHD может приводить к опасному поражению сердца с миокардитом или вальвулитом, приводящим к гибели или протезированию клапанов. Во всех развивающихся странах, RHD остается основной причиной приобретенных заболеваний сердца у индивидуумов в возрасте <50 лет. В развитых странах, ARF и RHD являются менее частыми вследствие доступности антибиотиков для лечения инфекций GAS. Однако в середине 1980-х годов сообщалось о возврате ARF и RHD в некоторых областях Соединенных Штатов Америки, и что они продолжали существовать в межгорной области, окружающей Salt Lake City, UT.

В настоящее время для подтверждения наличия у пациента развитого RHD после диагноза ARF применяют тесты, такие как ЭКГ и эхокардиограмма. В настоящее время, не существует доступных анализов для идентификации индивидуумов с наличием или с риском развития RHD в результате инфекции GAS.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способам идентификации индивидуумов с наличием или с риском развития RHD в результате инфекции GAS. Изобретение также относится к белковым чипам, которые можно использовать в таких способах. Изобретение также относится к способам и композициям для профилактики и лечения RHD, связанного с инфекцией GAS.

Способы диагностики

Изобретение относится к способу диагностики у пациента ревматического порока сердца (RHD), связанного с инфекцией GAS, или идентификации пациента с риском развития RHD, связанного с инфекцией GAS, где указанный способ включает стадии:

a) приведения биологического образца, взятого у пациента, в контакт по меньшей мере с одним антигеном GAS в условиях, подходящих для связывания любых антител, присутствующих в биологическом образце, по меньшей мере с одним антигеном GAS, и

b) сравнения реакционноспособности антител в биологическом образце, взятом у пациента, по меньшей мере в отношении одного антигена GAS с реакционноспособностью антител в контрольном биологическом образце, взятом у здорового индивидуума, по меньшей мере в отношении одного антигена GAS,

где меньшая реакционноспособность в биологическом образце, взятом у пациента, по сравнению с контрольным биологическим образцом, взятым у здорового индивидуума, указывает на то, что пациент страдает ревматическим пороком сердца (RHD), связанным с инфекцией GAS, или что у пациента существует риск развития RHD, связанного с инфекцией GAS.

В одном из аспектов изобретение относится к способу диагностики у пациента ревматического порока сердца (RHD), связанного с инфекцией GAS, или идентификации пациента с риском развития RHD, связанного с инфекцией GAS, где указанный способ включает стадии:

a) приведения биологического образца, взятого у пациента, в контакт по меньшей мере с одним антигеном GAS, выбранным из группы, включающей аминокислотные последовательности

SEQ ID NO:1 (GAS5),

SEQ ID NO:2 (GAS5F),

SEQ ID NO:3 (GAS25),

SEQ ID NO:4 (GAS40),

SEQ ID NO:5 (GAS57),

SEQ ID NO:6 (GAS97),

SEQ ID NO:7 (GAS380) и

SEQ ID NO:8 (SpeA),

или их функциональные эквиваленты, в условиях, подходящих для связывания любых антител, присутствующих в биологическом образце, по меньшей мере с одним антигеном GAS или с их функциональными эквивалентами;

b) оценки реакционноспособности любых антител в биологическом образце, взятом у пациента, связывающихся по меньшей мере с одним антигеном GAS или с их функциональными эквивалентами, и

c) сравнения реакционноспособности на стадии b) с реакционноспособностью антител в контрольном биологическом образце, взятом у здорового индивидуума, связывающихся по меньшей мере с одним антигеном GAS или с их функциональными эквивалентами,

где меньшая реакционноспособность в биологическом образце, взятом у пациента, по сравнению с реакционноспособностью в контрольном биологическом образце, взятом у здорового индивидуума, указывает на то, что пациент страдает ревматическим пороком сердца (RHD), связанным с инфекцией GAS, или что у пациента существует риск развития RHD, связанного с инфекцией GAS.

Термин "ревматический порок сердца (RHD)" включает состояния, поражающие сердце после острой ревматической лихорадки, включая повреждение митрального клапана и/или аортального клапана, миокардит и перикардит.

Анализ образцов сыворотки пациентов, пораженных RHD, и здоровых индивидуумов привел к неожиданному открытию того, что сыворотки пациентов, пораженных RHD, демонстрируют значительно меньшую реакционноспособность в отношении определенных антигенов GAS по сравнению с реакционноспособностью сывороток здоровых пациентов. Эти открытия предоставили первое обоснование того, что реакционноспособность в отношении антигенов GAS можно использовать для различения сывороток, получаемых у здоровых индивидуумов, и сывороток, получаемых от пациентов, страдающих RHD. В частности выявлено, что сыворотки, получаемые от пациентов с RHD, демонстрируют меньшую реакционноспособность с восемью антигенами GAS, указанными в таблице 1 ниже:

Таблица 1Антигены GAS, применяемые в способах диагностики по изобретению
SEQ ID NO	Внутреннее обозначение GAS	Номер Spy	Номер gi
1	GAS5	spy0019	gi-15674263
2	GAS5F	spy0019 (фрагмент из аминокислот 224-398)	gi-15674263
3	GAS25	spy0167	gi-15674372
4	GAS40	spy0269	gi-15674449
5	GAS57	spy0416	gi-15674549
6	GAS97	spy1801	gi-15675636
7	GAS380	spy1813	gi-15675644
8	SpeA	spyM3_1301	gi-21910837

Таким образом, детекцию низкой реакционноспособности в отношении этих восьми антигенов GAS в образцах, взятых у пациентов, по сравнению с реакционноспособностью в контрольных образцах, взятых у здоровых индивидуумов, можно использовать для диагностики RHD, связанной с инфекцией GAS или для идентификации пациентов с повышенным риском развития RHD, связанного с инфекцией GAS. И наоборот, детекция реакционноспособности антител в отношении этих восьми антигенов GAS в образце, взятом у пациента, являющейся сходной с реакционноспособностью, присутствующей в контрольном образце, взятом у здорового индивидуума, указывает на то, что пациент не страдает RHD и у него снижен риск развития RHD, связанного с инфекцией GAS.

Способы по изобретению могут включать приведение биологического образца, взятого у пациента, в контакт с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или всеми 8 антигенами GAS, перечисленными выше, или с их функциональными эквивалентами.

Когда биологический образец, взятый у пациента, приводят в контакт с 2 из антигенов GAS, способы могут включать приведение образца в контакт с: SEQ ID NO:1 и 2; SEQ ID NO:1 и 3; SEQ ID NO:1 и 4; SEQ ID NO:1 и 5; SEQ ID NO:2 и 3; SEQ ID NO:2 и 4; SEQ ID NO:2 и 5; SEQ ID NO:3 и 4; SEQ ID NO:3 и 5; SEQ ID NO:4 и 5 или их функциональными эквивалентами. Способы также могут включать приведение образца в контакт с SEQ ID NO:1 и 6; SEQ ID NO:1 и 7; SEQ ID NO:1 и 8; SEQ ID NO:2 и 6; SEQ ID NO:2 и 7; SEQ ID NO:2 и 8; SEQ ID NO:3 и 6; SEQ ID NO:3 и 7; SEQ ID NO:3 и 8; SEQ ID NO:4 и 6; SEQ ID NO:4 и 7; SEQ ID NO:4 и 8; SEQ ID NO:5 и 6; SEQ ID NO:5 и 7; SEQ ID NO:5 и 8; SEQ ID NO:6 и 7; SEQ ID NO:6 и 8, или SEQ ID NO:7 и 8 или с их функциональными эквивалентами.

Когда биологический образец, взятый у пациента, приводят в контакт с 3 из антигенов GAS, способы могут включать приведение образца в контакт с любой комбинацией из 3 антигенов GAS из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. Например, способы могут включать приведение образца в контакт с SEQ ID NO:1, 2 и 3; SEQ ID NO:1, 3 и 4; SEQ ID NO:1, 4 и 5; SEQ ID NO:2, 3 и 4; SEQ ID NO:2, 4 и 5; SEQ ID NO:3, 4 и 5 или с их функциональными эквивалентами.

Когда биологический образец, взятый у пациента, приводят в контакт с 4 из антигенов GAS, способы могут включать приведение образца в контакт с любой комбинацией из 4 антигенов GAS из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. Например, способы могут включать приведение образца в контакт с: SEQ ID NO:1, 2, 3 и 4; SEQ ID NO:2, 3, 4 и 5; SEQ ID NO:1, 3, 4 и 5 или с их функциональными эквивалентами.

Когда биологический образец, взятый у пациента, приводят в контакт с 5 из антигенов GAS, способы могут включать приведение образца в контакт с любой комбинацией из 5 антигенов GAS из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. Например, способы могут включать приведение образца в контакт с SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 и 5 или с их функциональными эквивалентами.

Когда биологический образец, взятый у пациента, приводят в контакт с 6 из антигенов GAS, способы могут включать приведение образца в контакт с любой комбинацией из 6 антигенов GAS из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8.

Когда биологический образец, взятый у пациента, приводят в контакт с 7 из антигенов GAS, способы могут включать приведение образца в контакт с: SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, и 7; SEQ ID NO:1, 3, 4, 5, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 4, 5, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6 и 8 или с их функциональными эквивалентами.

Альтернативно, биологический образец, взятый у пациента, можно приводить в контакт со всеми 8 антигенами GAS, т.е. с SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 или с их функциональными эквивалентами.

Реакционноспособность антител, связывающихся с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или всеми 8 этими антигенами GAS или их функциональными эквивалентами в биологическом образце, взятом у пациента, сравнивают с реакционноспособностью антител, связывающихся с этими антигены GAS в контрольном биологическом образце, взятом у здорового индивидуума. Контрольный биологический образец, взятый у здорового индивидуума, приводят в контакт с той же комбинацией антигенов GAS что и биологический образец, взятый у пациента. Как правило, средняя реакционноспособность антител, связывающихся с комбинациями этих антигенов GAS, в контрольных биологических образцах, взятых у здоровых индивидуумов, уже определена. Подходящие способы оценки реакционноспособности антител известны в данной области и более подробно описаны ниже.

Детекция антител:

Все способы по изобретению, описанные выше, включают оценку реакционноспособности антител, т.е. детекцию антител, связывающихся с антигенами GAS, и титров этих антител. Способы детекции антител, связывающихся с антигенами и определения титров антител хорошо известны специалистам в данной области и можно использовать любой из таких способов.

Например, антиген или антигены GAS (или функциональные эквиваленты) можно иммобилизовать в известных положениях на поверхности, такой как поверхность чипа, как описано ниже. Иммобилизованные антигены можно инкубировать с иммобилизованными антигенами в условиях, позволяющих связывание с антигенами любых антител, присутствующих в образце. Подходящий период инкубации может составлять приблизительно 1 час. После отмывки с удалением любых несвязавшихся антител, можно проводить детекцию антител, связывающихся с антигенами, с использованием молекулы, связывающейся и распознающей связанные антитела.

Например, стадия оценки реакционноспособности любых антител, связывающихся с антигенами GAS, в любом из способов, описанных выше, может включать приведение биологического образца и антигенов GAS в контакт с меченным вторичным антителом, таким как меченое антитело против IgG, в условиях, подходящих для связывания вторичного антитела с любыми антителами в биологическом образце, связанными с иммобилизованными антигенами GAS.

Вторичное антитело, такое как антитело против IgG, можно метить такой флуоресцентной или ферментной меткой, что посредством детекции метки осуществляют детекцию связывания вторичного антитела и, таким образом, присутствия антител против антигенов GAS в биологическом образце. Когда метка представляет собой флуоресцентную метку, сравнение интенсивности флуоресценции можно использовать для оценки относительной реакционноспособности антител и, таким образом, определения того, демонстрирует ли конкретный образец, взятый у пациента, сниженную реакционноспособность антител по сравнению с контрольным биологическим образцом. Можно ожидать, что фоновая интенсивность флуоресценции составляет приблизительно 5000. Учитывая стандартное отклонение, на присутствие в образце антитела, связывающегося с антигеном GAS, может указывать интенсивность флуоресценции по меньшей мере 15000. Интенсивность флуоресценции по меньшей мере 30000 можно рассматривать как свидетельство высокой реакционноспособности, указывающий на высокий титр антител, связывающихся с антигеном GAS, в образце. Таким образом, в определенных аспектах изобретения интенсивность флуоресценции 15000-30000 может указывать на низкую реакционноспособность, вероятно связанную с RHD.

Описанные выше способы можно проводить на белковом чипе, таком как чипы, более подробно описанные ниже или с использованием стандартных способов ELISA или дот-блоттинга.

Биологические образцы:

Биологические образцы, которые можно тестировать в способах по изобретению, могут представлять собой любой образец, для которого известно, что он содержит антитела против антигенов GAS. Примеры подходящих образцов представляют собой образцы слюны, образцы крови или образцы сыворотки. В частности, образец может представлять собой образец сыворотки.

Биологический образец, взятый у пациента, получают у пациента-человека. Пациент-человек, может представлять собой взрослого, подроста в возрасте приблизительно от 12 до приблизительно 18 лет или ребенка до 12 лет. У пациента могут выявлять клинические симптомы острого ревматизма, включая мигрирующий полиартрит; кардит; подкожные узелки; ревматоидную эритему; хорею Сиденгама, лихорадку; артралгию; повышенные скорость оседания эритроцитов или C-реактивный белок; лейкоцитоз или ЭКГ, демонстрирующую признаки блокады сердца. У пациента могут выявлять признаки текущей инфекции GAS. В некоторых случаях у пациента могут отсутствовать симптомы текущей инфекции GAS и острого ревматизма.

Контрольный биологический образец можно получать у здорового индивидуума из того же географического положения, что и биологический образец, взятый у пациента.

Способы по изобретению можно проводить in vitro. Способы по изобретению могут дополнительно включать стадию получения биологического образца у пациента.

Белковые чипы:

Для облегчения скрининга биологических образцов на несколько антигенов GAS одновременно, антигены GAS, используемые в способах по изобретению, можно представлять на одном или нескольких белковых чипах. Например, каждый из антигенов GAS можно представлять на отдельном чипе или на одном чипе можно представлять несколько антигенов GAS одновременно. По дополнительному аспекту изобретения предоставлены белковые чипы. Эти чипы пригодны для использования в любом из описанных выше способов.

Изобретение относится к белковому чипу, содержащему по меньшей мере два антигена GAS с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8 или их функциональных эквивалентов.

Белковый чип может содержать 2, 3, 4, 5, 6, 7 или все 8 из этих антигенов GAS или их функциональных эквивалентов.

Когда чип содержит 2 антигена GAS, он может содержать антигены, содержащие аминокислотные последовательности: SEQ ID NO:1 и 2; SEQ ID NO:1 и 3; SEQ ID NO:1 и 4; SEQ ID NO:1 и 5; SEQ ID NO:2 и 3; SEQ ID NO:2 и 4; SEQ ID NO:2 и 5; SEQ ID NO:3 и 4; SEQ ID NO:3 и 5; SEQ ID NO:4 и 5, или их функциональные эквиваленты. Альтернативно, чип может содержать антигены, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1 и 6; SEQ ID NO:1 и 7; SEQ ID NO:1 и 8; SEQ ID NO:2 и 6; SEQ ID NO:2 и 7; SEQ ID NO:2 и 8; SEQ ID NO:3 и 6; SEQ ID NO:3 и 7; SEQ ID NO:3 и 8; SEQ ID NO:4 и 6; SEQ ID NO:4 и 7; SEQ ID NO:4 и 8; SEQ ID NO:5 и 6; SEQ ID NO:5 и 7; SEQ ID NO:5 и 8; SEQ ID NO:6 и 7; SEQ ID NO:6 и 8 или SEQ ID NO:7 и 8 или их функциональные эквиваленты

Когда чип содержит 3 антигена GAS, он может содержать любую комбинацию из 3 антигенов GAS SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. Например, чип может содержать антигены GAS: SEQ ID NO:1, 2 и 3; SEQ ID NO:1, 3 и 4; SEQ ID NO:1, 4 и 5; SEQ ID NO:2, 3 и 4; SEQ ID NO:2, 4 и 5; SEQ ID NO:3, 4 и 5 или их функциональные эквиваленты.

Когда чип содержит 4 антигена GAS, он может содержать любую комбинацию из 4 антигенов GAS из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. Например, чип может содержать антигены GAS: SEQ ID NO:1, 2, 3 и 4; SEQ ID NO:2, 3, 4 и 5; SEQ ID NO:1, 3, 4 и 5 или их функциональные эквиваленты.

Когда чип содержит 5 антигенов GAS, он может содержать любую комбинацию из 5 антигенов GAS из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. Например, чип может содержать антигены GAS: SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 и 5 или их функциональные эквиваленты.

Когда чип содержит 6 антигенов GAS, он может содержать любую комбинацию из 6 антигенов GAS из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8.

Когда чип содержит 7 антигенов GAS, он может содержать антигены GAS: SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7; SEQ ID NO:1, 3, 4, 5, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 4, 5, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6 и 8 или их функциональные эквиваленты.

Альтернативно, чип может содержать все 8 антигенов GAS, т.е. SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 или их функциональные эквиваленты.

Белковый чип может содержать дополнительные антигены GAS.

В способе по изобретению можно использовать любой тип белкового чипа, известный в данной области. Получение белковых чипов описано в Cretich, M., Damin F., et al., (Biomolecular Engineering 23, 77-88 (2006)) и Zhu, H & Snyder, M. (Current Opinion in Chemical Biology, 7:55-63 (2003)).

Например, белковый чип может представлять собой предметное стекло, на котором закреплены антиген или антигены. В его простейшей форме чип может представлять собой предметное стекло, на котором представлен простой антиген, получаемое просто посредством покрытия предметных стекол микроскопа аминосиланом (Ansorge, Faulstich), добавления к стеклам содержащего антиген раствора и высушивания. Стекла, покрытые аминосиланом, для покрытия антигеном можно получать из Telechem и Pierce.

Альтернативно, на чипе могут быть представлены несколько антигенов. Например, на покрытые нитроцеллюлозой стекла можно точечно наносить нанолитры нескольких антигенов GAS. На таких чипах могут быть представлены повторы каждого антигена GAS. Точки антигенов в таких чипах могут составлять приблизительно 150 мкм в диаметре и содержать ~0,35 нг белка.

Другие типы белковых чипов включают 3D слой геля и чипы с микролунками. Как очевидно читателю-специалисту, по настоящему изобретению вполне могут оказаться пригодными для использования типы белковых чипов, которые еще сконструированы, но которые будут разработаны в будущем.

Изобретение дополнительно относится к набору, содержащему белковый чип по изобретению и инструкции для использования чипа для диагностики пациентов с наличием или с риском развития ревматического порока сердца, связанного с инфекцией GAS.

Способы и композиции для лечения и профилактики RHD

В настоящее время, для всех пациентов с диагнозом ARF рекомендована профилактика антибиотиком (как правило, пенициллином) в течение периода по меньшей мере 5 лет после диагноза для снижения риска последующей инфекции GAS и развития RHD. Идентификация, пациентов у которых существует риск RHD и не существует риска RHD, позволяет подбирать медицинское лечение для пациентов, у которых диагностирована ARF.

Изобретение дает возможность, что когда способом по изобретению пациента идентифицируют как страдающего RHD, связанным с инфекцией GAS, с риском развития RHD, связанного с инфекцией GAS, пациента можно лечить антибиотиками. И наоборот, когда пациента способом по изобретению идентифицируют как пациента с низким риском развития RHD, связанного с инфекцией GAS, лечение антибиотиками может быть необязательным.

Понимание авторами изобретения того, что сыворотки здоровых индивидуумов демонстрируют высокую реакционноспособность в отношении антигенов GAS, описываемую выше, позволяет предположить, что антитела против этих антигенов GAS могут играть защитную роль в профилактики развития RHD. Таким образом, изобретение относится к композиции, содержащей по меньшей мере один антиген GAS, выбранный из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их функциональные эквиваленты. Изобретение также относится к композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело, специфически связывающееся по меньшей мере с одним антигеном GAS, выбранным из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их функциональные эквиваленты. Эти композиции могут представлять собой иммуногенные композиции, например, вакцинные композиции.

По дополнительному аспекту изобретение относится к способу лечения или профилактики RHD, связанного с инфекцией GAS, включающему введение нуждающемуся в этом пациенту по меньшей мере одного антигена GAS, выбранного из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их функциональные эквиваленты. Изобретение дополнительно относится по меньшей мере к одному антигену GAS, выбранному из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их функциональные эквиваленты, для применения для лечения или профилактики RHD, связанного с инфекцией GAS. Изобретение также относится к использованию по меньшей мере одного антигена GAS, выбранного из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их функциональные эквиваленты, в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики RHD, связанного с инфекцией GAS. Альтернативно, можно использовать молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие эти антигены GAS.

Изобретение также относится к способу лечения или профилактики RHD, связанного с инфекцией GAS, включающему введение нуждающемуся в этом пациенту по меньшей мере одного антитела, специфически связывающегося по меньшей мере с одним антигеном GAS, выбранным из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их функциональные эквиваленты. Изобретение дополнительно относится по меньшей мере к одному антителу, специфически связывающемуся по меньшей мере с одним антигеном GAS, выбранным из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их функциональные эквиваленты, для применения для лечения или профилактики RHD, связанного с инфекцией GAS. Изобретение также относится к использованию по меньшей мере одного антитела, специфически связывающегося по меньшей мере с одним антигеном GAS, выбранным из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их функциональные эквиваленты, в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики RHD, связанного с инфекцией GAS.

Как правило, антитела по изобретению специфически связываются с антигеном GAS с аффинностью 1 мкМ, 100 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 100 пМ или выше. Термин "антитело" включает интактные молекулы иммуноглобулинов, а также их фрагменты, которые способны к связыванию полипептида. Они включают гибридные (химерные) молекулы антител [1, 2]; фрагменты F(ab')₂ и F(ab) и молекулы Fv; нековалентные гетеродимеры [3, 4]; молекулы одноцепочечных Fv (sFv) [5]; конструкции димерных и тримерных фрагментов антител; минитела [6, 7]; молекулы гуманизированных антител [8-10] и любые функциональные фрагменты, получаемые из таких молекул, а также антитела, получаемые нетрадиционными способами, такими как фаговый дисплей. В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой моноклональные антитела. Способы получения моноклональных антител хорошо известны в данной области. В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой гуманизированные антитела или антитела человека полностью.

В композициях и способах лечения по изобретению можно использовать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или все 8 антигенов GAS, описанных выше, или антитела, которые специфически связываются с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или всеми 8 из этих антигенов GAS. Можно использовать комбинации антигенов GAS и антител, специфично связывающихся c этими антигенами.

Примеры комбинаций антигенов GAS, которые можно использовать в композициях и способах лечения по этому аспекту изобретения включают SEQ ID NO:1 и 2; SEQ ID NO:1 и 3; SEQ ID NO:1 и 4; SEQ ID NO:1 и 5; SEQ ID NO:2 и 3; SEQ ID NO:2 и 4; SEQ ID NO:2 и 5; SEQ ID NO:3 и 4; SEQ ID NO:3 и 5; SEQ ID NO:4 и 5; SEQ ID NO:1 и 6; SEQ ID NO:1 и 7; SEQ ID NO:1 и 8; SEQ ID NO:2 и 6; SEQ ID NO:2 и 7; SEQ ID NO:2 и 8; SEQ ID NO:3 и 6; SEQ ID NO:3 и 7; SEQ ID NO:3 и 8; SEQ ID NO:4 и 6; SEQ ID NO:4 и 7; SEQ ID NO:4 и 8; SEQ ID NO:5 и 6; SEQ ID NO:5 и 7; SEQ ID NO:5 и 8; SEQ ID NO:6 и 7; SEQ ID NO:6 и 8, или SEQ ID NO:7 и 8; SEQ ID NO:1, 2 и 3; SEQ ID NO:1, 3 и 4; SEQ ID NO:1, 4 и 5; SEQ ID NO:, 2, 3 и 4; SEQ ID NO:2, 4 и 5; SEQ ID NO:3, 4 и 5; SEQ ID NO:1, 2, 3 и 4; SEQ ID NO:2, 3, 4 и 5; SEQ ID NO:1, 3, 4 и 5; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 и 5; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7; SEQ ID NO:1, 3, 4, 5, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 4, 5, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6 и 8 или их функциональные эквиваленты. Также можно использовать антитела, связывающиеся с этими комбинациями антигенов GAS.

Композиции и способы, описанные выше, в основном могут быть подходящими при лечении и профилактики инфекции GAS, а также при лечении и профилактики RHD, связанного с инфекцией GAS.

Состав композиций для лечения и профилактики RHD

Как подробно описано выше, композиции по изобретению могут быть подходящими в качестве вакцин. Вакцины по изобретению могут быть профилактическими (т.е. для профилактики инфекции) или терапевтическими (т.е. для лечения инфекции), но, как правило, являются профилактическими.

Таким образом, композиции могут быть фармацевтически приемлемыми. Как правило, кроме антигенов они включают дополнительные компоненты, например, как правило, они включают один или несколько фармацевтических носителей и/или эксципиентов.

Как правило, композиции вводят человеку в водной форме. Однако перед введением композиция может находиться в неводной форме. Например, хотя некоторые вакцины производят в водной форме, а затем их заполняют и распределяют и вводят также в водной форме, другие вакцины при производстве лиофилизируют и восстанавливают в водную форму во время использования. Таким образом, композиция по изобретению может быть высушенной, такой как лиофилизированный состав.

Композиция может содержать консерванты, такие как тиомерсал или 2-феноксиэтанол. Однако, предпочтительно, чтобы вакцина по существу не содержала (т.е. содержала менее 5 мкг/мл) веществ с ртутью, например, не содержала тиомерсала. Более типичными являются вакцины не содержащие ртути. Особенно предпочтительными являются вакцины, не содержащие консервантов.

Для улучшения термостабильности композиция может содержать термозащитное средство. Дополнительные подробности о таких средствах предоставлены далее.

Для контроля тоничности, как правило, она содержит физиологическую соль, такую как натриевая соль. Как правило, используют хлорид натрия (NaCl), который может присутствовать в количестве 1-20 мг/мл, например, приблизительно 10±2 мг/мл NaCl. Другие соли, которые могут присутствовать, включают хлорид калия, дигидрофосфат калия, дегидрат двузамещенного фосфата натрия, хлорид магния, хлорид кальция и т.д.

Как правило, осмоляльность композиции составляет от 200 мосмоль/кг до 400 мосмоль/кг, более часто 240-360 мосмоль/кг, а более типично находится в диапазоне 290-310 мосмоль/кг.

Композиции могут содержать один или несколько буферов. Характерные буферы включают: фосфатный буфер; буфер Tris; боратный буфер; сукцинатный буфер; гистидиновый буфер (в частности, с адъювантом гидроксидом алюминия) или цитратный буфер. Как правило, буферы добавляют в диапазоне 5-20 мМ.

Как правило, pH композиции составляет 5,0-8,1, а более характерно 6,0-8,0 например, 6,5 и 7,5, или 7,0-7,8.

Как правило, композиция является стерильной. Как правило, композиция также является апирогенной, например, содержащей <1 ЕЭ (единиц эндотоксинов, стандартный показатель) на дозу, например, <0,1 ЕЭ на дозу. Часто композиция не содержит глютена.

Композиция может содержать вещество для одной иммунизации, или может содержать вещество для нескольких иммунизаций (т.е. набор из "нескольких доз"). Для средств из нескольких доз типичным является введение консерванта. В качестве альтернативы (или дополнительно к) введению консерванта в композиции из нескольких доз, композиции могут содержаться в контейнере с асептическим адаптером для извлечения вещества.

Как правило, вакцины для человека вводят в объеме дозирования приблизительно 0,5 мл, хотя детям можно вводить половину дозы (т.е. приблизительно 0,25 мл).

Композиции по изобретению также могут содержать одно или несколько иммунорегулирующих средств. Часто одно или несколько иммунорегулирующих средств содержат один или несколько адъювантов. Адъюванты могут включать адъювант TH1 и/или адъювант TH2, дополнительно описываемые далее.

Адъюванты, которые можно использовать в композициях по изобретению, в качестве неограничивающих примеров включают:

A. Композиции, содержащие неорганические вещества

Композиции, содержащие неорганические вещества, подходящие для использования в качестве адъювантов по изобретению, включают соли неорганических кислот, такие как соли алюминия и кальциевые соли (или их смеси). Кальциевые соли включают фосфат кальция (например, частицы "CAP", описываемые в ссылке 11). Соли алюминия включают гидроксиды, фосфаты, сульфаты и т.д., где соли находятся в любой подходящей форме (например, геля, кристаллической, аморфной и т.д.). Часто используют адсорбцию к этим солям. Композиции, содержащие неорганические вещества, также можно формулировать в виде частиц соли металла [12].

Можно использовать адъюванты, известные как гидроксид алюминия и фосфат алюминия. Эти названия являются общепринятыми, но их используют только для удобства, так как ни одно не является точным описанием действительно присутствующего химического соединения (например, см. главу 9 ссылки 13)). В изобретении можно использовать любые "гидроксидные" или "фосфатные" адъюванты, которые, как правило, используют в качестве адъювантов. Адъюванты, известные как "гидроксид алюминия", как правило, представляют собой соли гидроксида алюминия, которые, как правило, по меньшей мере частично являются кристаллическими. Адъюванты, известные как "фосфат алюминия", как правило, представляют собой гидроксифосфаты алюминия, часто также содержащие небольшое количество сульфата (т.е. сульфат гидроксифосфата алюминия). Их можно получать посредством осаждения, а условия реакции и концентрации при осаждении влияют на степень замещения фосфата на гидроксил в соли.

Для адъювантов гидроксида алюминия типична волокнистая морфология (например, как видно на микрофотографии с трансмиссионного электронного микроскопа). pI адъювантов гидроксида алюминия, как правило, составляет приблизительно 11 т.е. сам адъювант обладает положительным поверхностным зарядом при физиологическом pH. Опубликованная адсорбционная емкость для адъювантов гидроксида алюминия составляет 1,8-2,6 мг белка на мг Al⁺⁺⁺ при pH 7,4.

Как правило, молярное отношение PO₄/Al адъювантов фосфата алюминия составляет 0,3-1,2, например, 0,8-1,2, как правило, 0,95±0,1. Как правило, фосфат алюминия является аморфным, особенно в форме гидроксифосфатных солей. Типичный адъювант представляет собой аморфный гидроксифосфат алюминий с молярным отношением PO₄/Al 0,84-0,92, содержащий 0,6 мг Al³⁺/мл. Как правило, фосфат алюминия является частицей (например, пластиновидная морфология как видно на микрофотографиях с трансмиссионного электронного микроскопа). Типичные диаметры частиц после адсорбции любого антигена находятся в диапазоне 0,5-20 мкм (например, приблизительно 5-10 мкм). Опубликованная адсорбционная емкость для адъювантов фосфата алюминия составляет 0,7-1,5 мг белок на мг Al⁺⁺⁺ при pH 7,4.

Точка нулевого заряда (PZC) фосфата алюминия обратно пропорционально связана со степенью замещения фосфата гидроксилом, и эта степень замещения может варьировать в зависимости от условий реакции и концентрации реагентов, используемых для получения соли посредством осаждения. PZC также изменяется при изменении концентрации свободных ионов фосфата в растворе (больше фосфата = более кислая PZC) или при добавлении буфера, такого как гистидиновый буфер (делает PZC более основной). Как правило, PZC фосфатов алюминия, используемых по изобретению, составляет 4,0-7,0, например, 5,0-6,5 например, приблизительно 5,7.

Суспензии солей алюминия, используемые для получения композиций по изобретению, могут содержать буфер (например, фосфатный или гистидиновый или буфер Tris), но это не всегда необходимо. Суспензии часто являются стерильными и апирогеными. Суспензия может содержать свободные водные фосфатные ионы, например, присутствующие в концентрации 1,0-20 мМ, например, 5-15 мМ, например, приблизительно 10 мМ. Суспензии также может содержать хлорид натрия.

По изобретению можно использовать смесь гидроксида алюминия и фосфата алюминия. В этом случае может присутствовать больше фосфата алюминия, чем гидроксида, например, при массовом отношении по меньшей мере 2:1, например, ≥5:1, ≥6:1, ≥7:1, ≥8:1, ≥9:1 и т.д.

Концентрация Al⁺⁺⁺ в композиции для введения млекопитающему, как правило, составляет менее 10 мг/мл, например, ≤5 мг/мл, ≤4 мг/мл, ≤3 мг/мл, ≤2 мг/мл, ≤1 мг/мл и т.д. Предпочтительно, диапазон составляет 0,3-1 мг/мл. Предпочтительно, 0,85 мг/дозу.

Особенно предпочтительны фосфаты алюминия, особенно в композициях, содержащих антиген сахарид H. influenzae, и типичный адъювант представляет собой аморфный гидроксифосфат алюминия с молярным отношением PO₄/Al 0,84-0,92, добавляемый при 0,6 мг Al³⁺/мл. Можно использовать адсорбцию с низкой дозой фосфата алюминия, например, 50-100 мкг Al³⁺ на конъюгат на дозу. Когда в композиции присутствует более одного конъюгата, не всем конъюгатам необходимо быть адсорбированными.

B. Масляные эмульсии

Композиции масляных эмульсий, подходящие для использования в качестве адъювантов по изобретению, включают эмульсии сквален-вода, такие как MF59 [глава 10 ссылки 13; также см. ссылку 14] (5% сквалена, 0,5% Tween 80, и 0,5% Span 85, формулируемых в субмикронные частицы с использованием микрофлюидизатора). Также можно использовать полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA).

Известны различные эмульсионные адъюванты "масло-в-воде", и, как правило, они содержат по меньшей мере одно масло и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, где масло(а) и поверхностно-активное вещество(а) являются биологически разлагаемыми (метаболизируемыми) и биологически совместимыми. Как правило, для получения стабильных эмульсий капли масла в эмульсии в диаметре составляют менее 5 мкм, и в идеале имеют субмикронный диаметр, где этих малых размеров достигают с использованием микрофлюидайзера. Предпочтительными являются капли с размером менее 220 нм, так как их можно подвергать стерилизации фильтрованием.

Эмульсия может содержать масла, такие как масла животного происхождения (такие как из рыб) или из овощных источников. Источники для растительных масел включают орехи, семена и зерна. Примерами ореховых масел являются арахисовое масло, соевое масло, кокосовое масло и оливковое масло, доступные чаще всего. Например, можно использовать масло жожоба, получаемое из бобов жожоба. Масла семян включают сафлоровое масло, хлопковое масло, масло семян подсолнечника, масло семян кунжута и т.п. В группе зерновых наиболее легкодоступным является кукурузное масло, но также можно использовать масло других зерен злаков, таких как пшеница, овес, рожь, рис, тэфф, тритикале и т.п. Сложные эфиры глицерина и 1,2-пропандиола с 6-10 углеродными жирными кислотами, хотя они не встречаются в маслах семян в природе, можно получать посредством гидролиза, разделения и этерификации подходящих веществ, начиная от масла орехов и семян. Жиры и масла из молока млекопитающих являются мет