Биомаркеры старения сердца и способы их применения

Биомаркеры старения сердца и способы их применения

Реферат

Перекрестные ссылки на имеющие отношение заявки

Эта заявка претендует на приоритет предварительной заявки на патент США серийный №61/280879, поданной 10 ноября 2009, раскрытие которой включено в настоящий документ путем отсылки.

Уровень техники

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение, в общем, относится к области дополнительного питания для поддержания здоровья и долголетия у животных. В особенности, изобретение обеспечивает набор биомаркеров старения в сердце, включающий несколько генов, вовлеченных в Wnt-сигнальный путь. Изобретение дополнительно обеспечивает применение этих биомаркеров для установления питательных веществ и режимов питания для замедления старения сердца и для модуляции самих генов, чтобы замедлить старение сердца.

Описание уровня техники

Старение организма и составляющих его органов в настоящее время является предметом пристального внимания в биологических и медицинских исследованиях. Признаки старения включают снижение функции стволовых клеток и клеток-предшественников и снижение регенерации тканей (Rando, 2006, Nature 441: 1080-1086). Стареющие ткани демонстрируют снижение присущей им устойчивости к повреждению или поражению. Резидентные и циркулирующие стволовые клетки и клетки-предшественники представляют собой неспециализированные клетки, которые являются критическими для текущего восстановления поврежденных тканей. Эта регенеративная функция снижается при старении ткани. Было предположено, что нарушение функции стволовых клеток и клеток-предшественников может вносить вклад в старение и заболевание.

В последних сообщениях описывают связь между сигнальным путем Wnt/бета-катенин и старением стволовых клеток (см., например, White et al., 2007, Current Biology 17(21): R923-925; Brack et al., 2007, Science 317:807-810; Liu et al., 2007, Science 317: 803-806; Nusse, 2008, Cell Research 18: 523-527; Rando, 2006, supra). Бета-катенин представляет собой ключевой медиатор сигнального пути Wnt (Willert & Nusse, 1998, Current Opinion in Genetics & Development 8: 95-102; Nusse, 2008, supra). Когда белок Wnt связывается со своими рецепторами на мембране клетки, то внутри клетки запускается цепь биохимических реакций. В конечном итоге, сигнальный каскад входит в ядро через бета-катенин, который передает Wnt-сигнал из цитозоля в ядро для регуляции экспрессии генов другими ядерными белками (Huelsken & Birchmeirer, 2001, Curr. Op.Genet. & Devel. 11:547-553).

Сообщалось о том, что передача Wnt-сигнала усиливается в различных тканях и органах в моделях ускоренного старения на животных (Liu et al., 2007, supra). Сообщалось о том, что длительное воздействие Wnt вызывает клеточное старение. Также сообщалось об усилении передачи Wnt-сигнала в стволовых клетках старых скелетных мышц (Brack et al., 2007, supra). Кроме того, сообщалось о том, что передача Wnt-сигнала активирует превращение мышечных стволовых клеток из миогенных в фиброгенные и торможение этого сигнала сохраняет миогенное состояние.

Deb et al. сообщили о том, что в сердце торможение передача Wnt-сигнала путем секреции связанного с ожогом белка 2 (SFRP2), внеклеточного антагониста Wnt ингибирует дифференциацию и поддерживает эмбриональные и взрослые сердечные клетки-предшественники в недифференцированном состоянии (Deb et al., 2008, Stem Cells 26: 35-44). Затем эти же исследователи выдвинули гипотезу о том, что передача Wnt-сигнала усиливается со старением и этот сигнал переводит сердечные стволовые клетки и клетки-предшественники в фиброгенную линию (Deb, 2008, Research Proposal Summary - New Scholar Award in Aging, Ellison Medical Foundation at URL ellisonfoundation.org/). Ashton et al. сообщили о понижающей регуляции сигнального пути Wnt в «старом» сердце по сравнению с молодым сердцем (Ashton et al., 2005, Experimental Gerontology 41: 189-204), но в этом исследовании не сообщалось об экспрессии бета-катенина. Кроме того, хотя даже было показано то, что пик функционально компетентных сердечных клеток-предшественников у мышей приходится на возраст 20 месяцев (Gonzales et al., 2008, Circulation Research 102: 597-606), возраст мышей в «старой» группе в исследовании Ashton et al. варьировал от 16-18 месяцев. Таким образом, мыши, примененные в исследовании Ashton et al., не были действительно старыми.

Было показано, что ограничение в калорийности потребляемой пищи до уровня много ниже ad libitum увеличивает продолжительность жизни, снижает или откладывает наступление многих связанных с возрастом состояний, улучшает устойчивость к стрессу и замедляет ухудшение функций организма у многих видов животных, включая млекопитающих, таких как грызуны и приматы. Действительно, начались клинические испытания для оценки стимулирующего долголетие эффекта ограничения в калорийности пищи (CR) у людей. Но у людей, как и у животных, маловероятно, что CR представляет собой эффективную стратегию для увеличения долголетия у большинства индивидуумов, из-за степени и продолжительности требуемых ограничений. Именно поэтому поиск был сосредоточен на идентификации веществ, например фармацевтических средств, питательных веществ и т.п., способных имитировать эффект CR без существенного изменения в пищевом рационе.

Усилия были направлены на идентификацию средств, которые могут имитировать один или несколько физиологических или биохимических эффектов CR (например, Barger et al., 2008, PLoS ONE 3(6): е2264. doi:10.1371/joumal.pone.0002264), или которые могут воспроизводить профиль экспрессии генов, связанных с CR в определенных тканях и органах (например, Spindler, патент США 6,406,853; публикация патента США 2003/0124540; Barger et al., 2008, supra). В связи с последним, были раскрыты способы анализа генов, связанных с CR, и основанный на получении профиля экспрессии генов скрининг, проводимый для обнаружения миметиков CR (Spindler et al., публикации патента США 2004/0180003, 2004/0191775 и 2005/0013776; Pan et al., публикация патента США 2007/0231371).

Сообщали о ряде веществ, которые взаимодействуют с бета-катенином и/или с передачей Wnt-сигнала в различных, не относящихся к сердечным, клеточных и тканевых системах, включая: альгинат (Dettmar et al., 2007, Biomater Sci Polym Ed 18: 317-333), апигенин Shukia et al., 2007, Cancer Res. 67: 6925-6935), аскорбиновую кислоту (Quintanilla et al., 2005, JBiol Chem 280:1 1615-11625), куркумин (Mahmoud et al., 2000, Carcinogenesis 21: 921-927), флаванон (Park et al., 2005, Biochem Biophys Res Commun 331: 1222-1228), генистеин (Guo et al., 2002, Am J Physiol Cell Physiol 283: C.722-734), гиалуроновую кислоту (Bowguignon et al., 2007, J Biol Chem 282: 1265-1280), магний (Caveda et al., 1996, J din Invest 98: 886-893), моноолеилфосфатидную кислоту (Malbon, 2005, Sci STKE 292: pe35), нарингенин (Lee et al., 2005, Biochem Biophys Res Commun 335: 771-776), оксид азота (нитроглицерин) (Prevotat et al., 2006, Gastroenterology 131: 1142-1152), кверцитин (van Erk et al., 2005, Eur J Nutr 44: 143-556), ресвератрол (Hope et al., 2008, MolNutr Food Res 52: S52-S61), S-карбамилцистеин (Proweller et al., 2006, Cancer Res 66: 7438-7444), бутират натрия (Abramova et al., 2006, J Biol Chem 281: 21040-21051), салицилат натрия (Lee et al., 2003, Int J Oncol 23: 503-508), спермидин (Guo et al., 2002, Am J Physiol Cell Physiol 283: C722-734), сфингозин (Olsson et al., 2004, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 287: G929-937), тролокс (производное витамина Е) (Quintanilla et al., 2005, supra) и глюкозу (Lin et al., 2006, J Am Soc Nephrol 17: 2812-2820). Однако механизмы, посредством которых происходят такие взаимодействия, и эффект таких взаимодействий во многих случаях остались неясными.

Несмотря на доступность подходов, изложенных выше, остается необходимость в более надежных, быстрых и менее дорогостоящих способах скрининга средств, которые могут замедлить или обратить процесс старения, или всего организма, или специфических тканей и органов, стимулировать здоровое старение и увеличить долголетие. Кроме того, несмотря на доступность описанных выше способов и лекарственных средств остается необходимость в способах и композициях, которые могут замедлять старение, или всего организма, или специфических тканей и органов, таких как сердце, или имитировать эффекты CR без необходимости для индивидуумов существенно изменять калорийность потребляемой ими пищи. Настоящее изобретение удовлетворяет эти потребности,

Раскрытие изобретения

Следовательно, цель настоящего изобретения заключается в обеспечении одного или нескольких генов или сегментов генов, которые дифференциально экспрессируются в клетках и тканях сердца старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами.

Дополнительная цель изобретения заключается в обеспечении комбинации, включающей множество полинуклеотидов, которые дифференциально экспрессируются в клетках и тканях сердца старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами.

Еще одна цель изобретения заключается в обеспечении композиции из двух или нескольких полинуклеотидных или полипептидных зондов, подходящих для обнаружения экспрессии генов, дифференциально экспрессируемых в клетках и тканях сердца старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами.

Дополнительная цель изобретения заключается в обеспечении способов измерения биологического старения клеток или тканей сердца.

Еще одна цель изобретения заключается в обеспечении способа измерения эффекта тестируемого вещества на профиль экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в клетках и тканях сердца старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами или стандартным образцом.

Еще одна цель изобретения заключается в обеспечении способа замедления старения сердца у индивидуума.

Одну или несколько из этих других целей достигают, применяя новые комбинации полинуклеотидов или полипептидов, представляющих гены и сегменты генов, которые дифференциально экспрессируются в клетках и тканях сердца старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, в которых связь между генами заключается в их вовлечении в сигнальный путь Wnt в сердце, в снижении их экспрессии в старой в сравнении с молодой тканью сердца и в обращении такого связанного с возрастом снижения под действием CR или путем приема ресвератрола. Полинуклеотиды применяют для получения композиций, зондов, устройств, основанных на зондах, и способов определения статуса полинуклеотидов, дифференциально экспрессируемых в выбранных тканях старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами или стандартным образцом, которые полезны для вышеуказанных целей, например для прогнозирования и диагностирования связанных с возрастом состояний в сердце и для скрининга веществ при определении того, могут ли они оказывать противовозрастной эффект в сердце. Полинуклеотиды дополнительно применяют для модуляции экспрессии или активности генов и генных продуктов, вовлеченных в передачу Wnt-сигнала в сердце, в особенности генов бета-катенина и белков бета-катенина. Также обеспечивают наборы, включающие комбинации реагентов, таких как зонды, устройства с применением зондов и веществ, а также упаковки, содержащие такие наборы, компьютерные программы с информацией по их применению, и информационные ресурсы для передачи информации, относящейся к дифференциально экспрессируемым генам и способам их применения.

Другие и дополнительные цели, признаки и преимущества изобретения будут понятны специалистам в этой области техники.

Осуществление изобретения

Определения

Термин «старение» означает биологическое или физиологическое старение организма, органа, ткани или любой из их частей. Термин включает развитие связанных с возрастом заболеваний в организме, органе, ткани или в любой из их частей. Подобным образом, «старение сердца» означает биологического или физиологическое старение сердца или любой его части, включая развитие связанных с возрастом заболеваний в сердце или в любой его части. Отсылка к сердцу или к любому другому органу, указанная в настоящей заявке, предназначена для включения всех клеток и тканей, составляющих сердце или другой орган.

Термин «животное» означает человека или другое животное, включая птиц, коров, собак, лошадей, кошек, коз, мышей, овец и свиней. Если термин применяют в контексте сравнения исследуемых субъектов, то сравниваемые животные представляют собой животных одних и тех же видов и, по возможности, одной и той же расы или породы. Термин «животное, не относящееся к человеку» может быть применен в настоящей заявке для отсылки ко всем животным, кроме человека. Термин «животное-компаньон» означает любое одомашненное животное и включает, без ограничений, кошек, собак, кроликов, морских свинок, хорьков, хомяков, мышей, песчанок, лошадей, коров, коз, овец, ослов, свиней и т.п. В особенности животное представляет собой человека или животное-компаньона, такое как собака или кошка.

Термин «антитело» означает любой иммуноглобулин, который связывается со специфическим антигеном, включая антитела IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Термин включает поликлональные, моноклональные, моновалентные, гуманизированные антитела, гетероконъюгаты, композиции антител с полиэпитопной специфичностью, химерные, биспецифические антитела, диатела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител, такие как Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, или другие антигенсвязывающие фрагменты.

Термин «чип» означает упорядоченное расположение, по меньшей мере, двух зондов на подложке. По меньшей мере, один из зондов представляет собой контроль или стандарт и, по меньшей мере, один из зондов представляет собой диагностический зонд. Упорядоченное размещение от примерно двух до примерно 40000 зондов на подложке обеспечивает индивидуальное различие по размеру и интенсивности сигнала для каждого меченого комплекса, образовавшегося между зондом и полинуклеотидом или полипептидом образца.

Термин «комплекс связывания» означает комплекс, сформировавшийся при условии, что полипептид в образце специфически связывается (как определено в этой заявке) с партнером по связыванию, такому как антитело или его функциональный фрагмент.

Термин «ограничение в калориях» или «ограничение в калорийности пищи» («CR») означает любой режим питания с низким содержанием калорий без недостаточности питания. В общем, ограничение представляет собой общее количество калорий, полученных из углеводов, жиров и белков. Ограничение обычно равно, хотя не ограничивается, от примерно 25% до примерно 40% калорийности потребляемой пищи по сравнению с потреблением ad libitum.

«Пищевая добавка» представляет собой продукт, который предназначен для приема внутрь сверх нормального питания животного. Пищевые добавки могут быть в любой форме, например твердые, жидкие, в виде гелей, таблеток, капсул, порошков и т.п. Предпочтительно, чтобы их обеспечивали в удобных лекарственных формах. В некоторых воплощениях их обеспечивают в многодозовых розничных упаковках, таких как нерасфасованные порошки или жидкости. В других воплощениях добавки обеспечивают в виде крупных партий для включения в другие пищевые изделия, такие как сухой завтрак, лакомства для домашних животных, батончики с добавками, напитки и т.п.

Термин «эффективное количество» означает количество соединения, материала, композиции, лекарственного средства или другого материала, или условия режима, такого как режим питания или курс физических упражнений, которые будут эффективны для достижения определенного биологического результата, такого как обращение или замедление старения в выбранной ткани, такой как сердце, как описано в этой заявке.

Термин «экспрессия», например «экспрессии генов», означает транскрипцию гена с образованием мРНК и трансляцию мРНК с образованием белка. Увеличение в скорости транскрипции или трансляции или увеличение в образовании продукта транскрипции или трансляции, например, мРНК или белка включают в термины «увеличение в экспрессии генов», «повышающая регуляция экспрессии генов» и т.п. Подобным образом, снижение в скорости транскрипции или трансляции или снижение в образовании продукта транскрипции или трансляции, например, мРНК или белка, включают в термины «снижение экспрессии генов», «понижающая регуляция экспрессии генов» и т.п. Термины «модуляция экспрессии генов», «воздействие на экспрессию генов» и т.п. относятся к увеличению или снижению экспрессии генов. Термин «дифференциальная экспрессия» или «дифференциально экспрессируемый» означает усиленную экспрессию или повышающую регуляцию экспрессии генов или сниженную экспрессию или пониженную регуляцию экспрессии генов, которая детектируется по отсутствию, присутствию или, по меньшей мере, по 1,2-кратному изменению в количестве транскрипируемой информационной РНК или транслируемого белка в образце.

«Пролонгированное» введение, как применено в настоящей заявке, в общем, относится к периодам длительностью свыше одного месяца. Рассматриваются периоды длительностью свыше двух, трех или четырех месяцев. Также включают более продолжительные периоды длительностью свыше 5, 6, 7, 8, 9 или 10 месяцев. Периоды, превышающие 11 месяцев или 1 год, также включены. В настоящей заявке рассматривают также сроки, превышающие 1, 2, 3 или более лет. В случае определенных животных предусматривается, что животному будут вводить вещества, идентифицированные с помощью настоящих способов на постоянной основе. Термины «постоянная основа», «постоянное введение» и/или «постоянный прием внутрь», как применены в настоящей заявке, означают, по меньшей мере, еженедельное введение. Предусматривается более частое введение, такое как два раза или три раза в неделю. Также включены режимы, которые включают введение, по меньшей мере, один раз, два раза, три раза или более раз в день. Любая частота приема лекарственного средства, вне зависимости от того, приведена ли в явной форме в настоящей заявке, рассматривается как применимая. Специалистам понятно, что частота приема лекарственного средства будет представлять собой функцию вещества, которое предполагается вводить, и что некоторые композиции могут требовать более или менее частого введения для поддержания желаемого биохимического, физиологического эффекта или влияния на экспрессию генов, а именно эффекты включают один или несколько из следующего: прием пищи, чувство сытости, метаболизм липидов и утилизация жиров и профиль экспрессии ассоциированных с ними генов. Термины «пролонгированное на постоянной основе», «пролонгированное постоянное введение» и/или «пролонгированный постоянный прием внутрь», как применены в настоящей заявке, означают пролонгированное введение вещества на постоянной основе.

Термин «пища» или «пищевая композиция» означает композицию, которая предназначена для потребления животным, включая человека, и обеспечивает его питание. «Пищевое изделие, составленное для потребления человеком» представляет собой любую композицию, специфически предназначенную для приема внутрь человеком. «Корма для домашних животных» представляют собой композиции, предназначенные для потребления домашними животными, предпочтительно животными-компаньонами. «Полный и сбалансированный по питательным веществам корм для домашних животных» - это такой корм, который содержит все известные необходимые питательные вещества для реципиента или потребителя, которому эта пища предназначена, в соответствующих количествах и пропорциях, основанных, например, на рекомендациях признанных авторитетов в области питания животных-компаньонов. Такие корма, следовательно, могут служить в качестве единственного источника пищевого рациона для поддержания жизни или стимулируют продуктивность, без введения дополнительных источников питательных веществ. Композиции сбалансированных по питательным веществам кормов для домашних животных широко известны и широко применяются в этой области техники.

Термин «фрагмент» означает (1) олигонуклеотидную или полинуклеотидную последовательность, которая представляет собой часть полной последовательности и которая обладает такой же или похожей активностью при определенном применении, как и полная полинуклеотидная последовательность, или (2) пептидную или полипептидную последовательность, которая представляет собой часть полной последовательности и которая обладает такой же или похожей активностью при определенном применении, как и полная полипептидная последовательность. Такие фрагменты могут включать любое число нуклеотидов или аминокислот, считающееся подходящим для определенного применения. В общем, олигонуклеотидные или полинуклеотидные фрагменты содержат, по меньшей мере, примерно 10, 50, 100 или 1000 нуклеотидов, и полипептидные фрагменты содержат, по меньшей мере, примерно 4, 10, 20 или 50 следующих друг за другом аминокислот из полной последовательности. Термин охватывает полинуклеотидные и полипептидные варианты фрагментов.

Термин «ген» или «гены» означает полный или частичный сегмент ДНК, вовлеченный в продукцию полипептида, включая области, предшествующие и следующие за кодирующей областью (лидерная и трейлерная последовательности) и встроенные последовательности (интроны) между индивидуальными кодирующими сегментами (экзонами). Термин охватывает любую последовательность ДНК, которая гибридизуется с цепью комплементарной кодирующей последовательности гена.

Термин «генный продукт» означает продукт транскрипции гена, такой как мРНК или ее производные (например, кДНК), или трансляции генного транскрипта. Термин «генный продукт», в общем, относится к продукту трансляции, который представляет собой белок. В настоящей заявке термин «генный продукт» может быть применен взаимозаменяемо с термином «белок» или «полипептид».

Термин «гомолог» означает (1) полинуклеотид, включая полинуклеотиды от одних и тех же или разных видов животных, обладающие более чем 30%, 50%, 70% или 90% сходством в последовательности с последовательностью сравнения, имеющий такие же или практически такие же свойства и демонстрирующий такую же или практически такую же функцию, как полинуклеотид сравнения, или обладающий способностью специфически гибридизоваться с последовательностью сравнения в жестких условиях, или (2) полипептид, включая полипептиды от одних и тех же или разных видов животных, обладающие более чем 30%, 50%, 70% или 90% сходством в последовательности с полипептидом сравнения, имеющий такие же или практически такие же свойства и демонстрирующий такую же или практически такую же функцию, как полипептид сравнения, или обладающий способностью специфически связываться с полипептидом сравнения. При отсылке к фрагментам полной длины, кодирующим последовательности, функция этих фрагментов может заключаться просто в кодировании выбранной части полипептида определенной последовательности или в том, что они представляют собой соответственно похожую последовательность для гибридизации с другим полинуклеотидным фрагментом, кодирующим этот полипептид. При отсылке к фрагментам полипептидов функция этих фрагментов может заключаться просто в формировании эпитопа, подходящего для генерации антитела. Сходство в последовательности двух полипептидных последовательностей или двух полинуклеотидных последовательностей устанавливают с помощью способов, известных специалистам, например алгоритм Карлина и Альтшуля (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990)). Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST в работе Altschul et al., 1990 (J. Mol. Biol. 215:403-410). Для получения выравниваний, содержащих пробелы, для целей сравнения, может быть применена программа Gapped Blast, такая как описана в работе Altschul et al., 1997 (Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402). При использовании программ BLAST и Gapped BLAST применяют параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST).

Термин «комплекс гибридизации» означает комплекс, который формируется между полинуклеотидами образца, когда пурины одного полинуклеотида образуют водородную связь с пиримидинами комплементарного полинуклеотида, например 5'A-G-T-C-3'пары оснований с 3'T-C-A-G-5'. Степень комплементарности и применение аналогов нуклеотидов влияет на эффективность и жесткость реакций гибридизации.

Термин «совместно с» означает, что лекарственное средство, пищу или другое вещество вводят животному (1) вместе с композицией, в особенности с пищевой композицией, или (2) раздельно с такой же или с другой частотой, применяя те же или другие пути введения, примерно в то же время или через определенные промежутки времени. «Через определенные промежутки времени» означает, что вещество вводят по схеме применения, подходящей для специфического вещества. «Примерно в одно и то же время», в общем, означает, что вещество (пищу или лекарственное средство) вводят в одно и то же время или в течение примерно 72 часов друг от друга. «Совместно с» специфически включает схемы введения, в которых вещества, такие как лекарственные средства, вводят в течение предписанного периода и композиции изобретения вводят в течение неопределенного времени.

Термин «индивидуум» при отсылке к животному означает индивидуальное животное любого вида или породы. Этот термин применяют взаимозаменяемо с термином «субъект».

Термин «полинуклеотид» или «олигонуклеотид» означает полимер нуклеотидов. Термин охватывает молекулы ДНК и РНК (включая кДНК и мРНК), как одноцепочечные, так и двуцепочечные, и, если молекулы одноцепочечные, то их комплементарную последовательность или в линейной, или в кольцевой форме. Термин также охватывает фрагменты, варианты, гомологи и аллели, в соответствии с последовательностью, которая имеет такие же или практически такие же свойства и демонстрирует такую же или практически такую же функцию, как исходная последовательность. В особенности, термин охватывает гомологи из различных видов, например мышь и собака или кошка. При выравнивании последовательности могут быть полностью комплементарны (без нарушения комплементарности) или могут иметь вплоть до примерно 30% нарушений в комплементарности последовательности. Необязательно, для полинуклеотидов, цепь содержит от примерно 50 до 10000 нуклеотидов, более предпочтительно от примерно 150 до 3500 нуклеотидов. Необязательно, для олигонуклеотидов, цепь содержит от примерно 2 до 100 нуклеотидов, более предпочтительно от примерно 6 до 30 нуклеотидов. Точный размер полинуклеотида или олигонуклеотида будет зависеть от различных факторов и от конкретного приложения и применения полинуклеотидов или олигонуклеотидов. Термин включает нуклеотидные полимеры, которые синтезируют и которые изолируют и очищают из природных источников. Термин «полинуклеотид» охватывает термин «олигонуклеотид».

Термин «полипептид», «пептид» или «белок» означает полимер аминокислот. Термин охватывает природные и неприродные (синтетические) полимеры и полимеры, в которых одна или несколько аминокислот заменены на искусственные химические миметики. Термин также охватывает фрагменты, варианты и гомологи, которые имеют такие же или практически такие же свойства, и демонстрирует такую же или практически такую же функцию, как исходная последовательность. Термин охватывает полимеры любой длины, необязательно полимеры, содержащие от примерно 2 до 1000 аминокислот, более специфически от примерно 5 до 500 аминокислот. Термин включает полимеры аминокислот, которые синтезируют и которые изолируют и очищают из природных источников.

Термин «зонд» означает (1) олигонуклеотид, или полинуклеотид, или РНК, или ДНК, как природный, так и очищенный путем ограниченного ферментного расщепления или полученный синтетически, который способен к отжигу или к специфической гибридизации с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную зонду, или (2) соединение или вещество, включая пептид или полипептид, способное к специфическому связыванию с конкретным белком или белковым фрагментом со значительным исключением других белков или белковых фрагментов. Олигонуклеотидный или полинуклеотидный зонд может быть как одноцепочечным, так и двухцепочечным. Точная длина зонда будет зависеть от многих факторов, включая температуру, источник и применение. Например, для приложения в области диагностики, в зависимости от сложности целевой последовательности, олигонуклеотидный зонд обычно содержит от примерно 10 до 100, от 15 до 50 или от 15 до 25 нуклеотидов. В некоторых диагностических приложениях полинуклеотидный зонд содержит примерно 100-1000, 300-600 нуклеотидов, предпочтительно примерно 300 нуклеотидов. Зонды в настоящей заявке выбирают так, чтобы они были «практически» комплементарны различным нитям определенной целевой последовательности. Это означает, что зонды должны быть практически комплементарны для специфической гибридизации или отжига со своими соответственно целевыми последовательностями в заданном наборе условий. Следовательно, последовательность зонда не должна точно отражать точную комплементарную последовательность мишени. Например, некомплементарный нуклеотидный фрагмент может быть прикреплен к 5' или 3'-концу зонда, тогда когда оставшаяся часть последовательности зонда будет комплементарной целевой последовательности. Альтернативно, некомплементарные основания или более длинные последовательности могут быть вставлены в зонд, если последовательность зонда достаточно комплементарна последовательности целевого полинуклеотида для специфического отжига с целевым полинуклеотидом. Пептидный или полипептидный зонд может представлять собой любую молекулу, с которой белок или пептид специфически связывается, включая ДНК (для ДНК-связывающих белков), антитела, рецепторы клеточной мембраны, пептиды, кофакторы, пектины, сахара, полисахариды, клетки, клеточные мембраны, органеллы и мембраны органелл.

Термин «образец» означает любую животную ткань или жидкость, содержащую, например, полинуклеотиды, полипептиды, антитела, метаболиты и т.п., включая клетки и другие ткани, содержащие ДНК и РНК. Примеры включают жировую ткань, кровь, хрящевую, соединительную, эпителиальную, лимфатическую, мышечную, нервную ткань, мокроту и т.п. Образец может быть твердым или представлять собой жидкость и может представлять собой ДНК, РНК, кДНК, жидкости организма, такие как кровь или моча, клетки, клеточные препараты или растворимые фракции или аликвоты среды из них, хромосомы, органеллы и т.п.

Термин «единая упаковка» означает, что компоненты набора физически объединены в одном или нескольких контейнерах или с одним или несколькими контейнерами и рассматриваются как единица для производства, распространения, продажи или применения. Контейнеры включают, но не ограничиваются, пакеты, коробки, бутылки, упаковки в термоусадочной пленке, присоединенные скобками или иным способом зафиксированные компоненты или их комбинации. Единая упаковка может представлять собой контейнеры с индивидуальными пищевыми композициями, физически объединенные так, чтобы их можно было рассматривать как единицу для производства, распространения, продажи или применения.

Термин «специфически связывается» означает специальное и точное взаимодействие между двумя молекулами, которое зависит от их структуры, в особенности от боковых групп их молекулы. Например, интеркаляция регуляторного белка в большую бороздку молекулы ДНК, образование водородной связи вдоль углеродного скелета между двумя одноцепочечными нуклеиновыми кислотами или связывание между эпитопом белка и агонистом, антагонистом или антителом.

Термин «специфически гибридизуется» означает ассоциацию между двумя одноцепочечными полинуклеотидами, имеющими достаточную комплементарную последовательность для того, чтобы гибридизация могла проходить в заданных условиях, в общем, применяемых в этой области техники (иногда называемую «практически комплементарную»). Например, термин может означать гибридизацию полинуклеотидного зонда с практически комплементарной последовательностью, содержащейся внутри молекулы одноцепочечной ДНК или РНК, в соответствии с аспектом изобретения, с существенным исключением гибридизации полинуклеотидного зонда с одноцепочечными полинуклеотидами некомплементарной последовательности.

Термин «стандарт» или «сравнение» означает (1) контрольный образец, который содержит ткань от индивидуума, которому вводили контрольное вещество или вещество-сравнение, или не вводили вещество, по сравнению с образцом, который содержит ткань от индивидуума, которому вводили тестируемое вещество, например, для определения того, вызывает ли тестируемое вещество избирательную экспрессию генов, в случаях, соответствующих контексту его применения.

Термин «жесткие условия» означает (1) гибридизацию в 50% (объем/объем) формамиде с 0,1% бычьим сывороточным альбумином, 0,1% Фиколле, 0,1% поливинилпирролидоне, 50 мМ натрий фосфатном буфере при рН 6,5 с 750 мМ NaCl, 75 мМ цитрате натрия при 42°С, (2) гибридизацию в 50% формамиде, 5х SSC (0,75 М NaCl, 0,075 М цитрат натрия), 50 мМ фосфате натрия (рН 6,8), 0,1% пирофосфате натрия, 5х растворе Денхардта, с обработанной ультразвуком ДНК из молок лососевых (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% сульфате декстрана при 42°С; с промыванием при 42°С в 0,2х SSC и 0,1% SDS или промыванием с 0,015 М NaCl, 0,0015 М цитратом натрия, 0,1% Na₂SO₄ при 50°С или аналогичные процедуры, при которых применяют те же реагенты для промывки и сходные денатурирующие агенты при низкой ионной силе и высокой температуре.

Термин «вариант» означает (1) полинуклеотидную последовательность, содержащую любое замещение, изменение, модификацию, перестановку, делецию или вставку одного или нескольких нуклеотидов из полинуклеотидной последовательности или в полинуклеотидную последовательность, и которая обладает такими же или практически такими же свойствами и демонстрирует такую же или практически такую же функцию, как исходная последовательность, и (2) полипептидную последовательность, содержащую любое замещение, изменение, модификацию, перестановку, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот из полипептидной последовательности или в полипептидную последовательность, и которая обладает такими же или практически такими же свойствами и демонстрирует такую же или практически такую же функцию, как исходная последовательность. Термин, следовательно, включает одиночные нуклеотидные полиморфизмы (SNP) и аллельные варианты и включает консервативные и неконсервативные аминокислотные замены в полипептидах. Термин также охватывает химические производные полинуклеотида или полипептида и замещение нуклеотидов или аминокислот на нуклеотиды или аминокислоты, которые не встречаются в природе, по необходимости.

Термин «виртуальная упаковка» означает, что компоненты набора объединены путем направления к одному или нескольким физическим или виртуальным компонентам набора, инструктирующим потребителя, как получить другие компоненты, например, в пакете, содержащем один компонент и указания, инструктирующие потребителя обратиться к веб-сайту, воспользоваться аудиосообщением, просмотреть видеосообщение или обратиться к лицу, осуществляющему уход за больными, или к консультанту для получения инструкций о способе применения набора.

Термины «сигнальный путь Wnt», «Wnt-путь» и т.п. означают хорошо известный путь передачи сигнала, в который вовлечена сложная сеть генов и кодируемые ими белки, вовлеченные в эмбриогенез, а также в нормальные физиологические процессы у взрослых животных. Эти гены и белки, иногда обозначаемые в настоящей заявке как «Wnt-связанные» гены или белки, продуцируют или регулируют продукцию молекул передачи Wnt-сигнала, их взаимодействия с рецепторами на клетках-мишенях и физиологические ответы клеток-мишеней, которые возникают в результате воздействия на клетки внеклеточных Wnt-лигандов.

«Молодой» означает, в общем, индивидуума в раннем периоде взрослого состояния, т.е. зрелый постпубертатный период или юность, который будет определяться видом или линией, породой или этнической группой внутри вида, в соответствии с известными параметрами. «Состарившийся» или «старый», как применено в настоящей заявке, означает индивидуума, который физически или хронологически находится в периоде последних 30% своей средней продолжительности жизни, которая будет определяться видом или линией, породой или этнической группой внутри вида, в соответствии с известными параметрами.

Диапазоны в настоящей заявке применяют в краткой форме, для того чтобы избежать перечисления и описания каждой и всех величин внутри диапазона. По необходимости, в диапазоне может быть выбрано любое подходящее значение, как верхнее значение, нижнее значение или граница диапазона.

Как применено в настоящей заявке, единственная форма слова включает множественную форму, и наоборот, если только из контекста ясно не следует иное. Таким образом, термины в единственном числе, в общем, включают множественное число соответствующих терминов. Например, отсылка к термину «индивидуум», «животное», «способ» или «заболевание» включает множество таких «субъектов» «живот