Способ и композиция для уменьшения агрегации макромолекул при физиологических условиях

Способ и композиция для уменьшения агрегации макромолекул при физиологических условиях

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение связано со способом минимизации воспаления в месте инъекции, при подкожном введении макромолекул, путем уменьшения агрегации макромолекул при физиологических условиях.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В последние два десятилетия технология рекомбинантной ДНК привела к существенному увеличению количества лекарственных средств, являющихся биологическими молекулами, в частности, белками. Увеличение количества лекарственных средств на основе биомолекул приводит к возникновению новых задач, связанных с технологией приготовления лекарственных препаратов. Высокие дозы белковых лекарственных препаратов, таких как антитела, могут быть доставлены пациенту путем внутривенной инфузии, однако такой путь доставки лекарственного средства является затруднительным, и обычно, если это возможно, предпочтительной является лекарственная форма препарата для подкожного введения. Однако объем раствора лекарственного средства для подкожной инъекции значительно меньше, чем для внутривенной инфузии, а следовательно, белок в ней должен присутствовать в большей концентрации. При высоких терапевтических концентрациях белка в десятки миллиграммов в миллилитре важно поддерживать такие терапевтические белки в стабильно растворенном состоянии в течение продолжительного времени. В растворах с высокой концентрацией белков повышается вероятность межбелковых взаимодействий, способствующих агрегации; предотвращение агрегации становится основной проблемой при приготовлении белковых композиций лекарственных средств. Агрегация приводит к целому ряду проблем, включая уменьшение биодоступности лекарственного белка, изменение фармакокинетики и нежелательную иммуногенность. (Frokjaer, S. and Otzen, D. E., Nat. Rev. Drug. Discov. 4: 298-306 (2005); Jiskoot, W. and Crommelin, D.J.A., EJHP Practice 12: 20-21 (2006)).

Предотвращение агрегации остается в основном эмпирической проблемой, поскольку нюансы процесса агрегации на молекулярном уровне остаются в основном неизвестными. Типичной стратегией является добавление стабилизаторов к белковому раствору. Общеизвестные стабилизаторы включают сахара, соли, свободные аминокислоты, такие как L-аргинин и L-глутамин (Golovanov, A.P. et al., J. Am. Chem. Soc. 126: 8933-8939 (2004)), полиолы (Singh, S. and Singh, J., AAPS Pharm. Sci. Tech 4: 1-9 (2003); Mishra, R. et al., J. Biol. Chem. 280: 15553-15560 (2005)), полиэтиленгликоли (ПЭГ) и другие полимеры, такие как полисорбаты или полоксамеры, которые могут уменьшать межбелковых взаимодействия (Frokjaer and Otzen, выше; Lee, R. C. et al., Ann. Biomed. Eng. 34: 1190-1200 (2006); (Nema, S. et al., PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 51: 166-171 (1997)).

Циклодекстрины (ЦД) являются циклическими олигосахаридами, имеющими d-глюкопиранозные звенья, соединенные альфа-(l,4)-гликозидными связями. ЦД получают из кукурузного крахмала или других видов крахмала под действием амилазы, циклодекстринтрансглюкозилазы. Наиболее часто встречающимися и образующимися природным путем циклодекстринами являются альфа-циклодекстрин, бета-циклодекстрин и гамма-циклодекстрин, состоящие, соответственно, из 6, 7 и 8 глюкопиранозных звеньев. Поскольку природные циклодекстрины, в частности, бета-циклодекстрин, имеют низкую растворимость в воде, синтезирован целый ряд их производных, имеющих улучшенную растворимость и другие физико-химические свойства. Коммерчески доступные производные ЦД включают в себя метилированные ЦД, 2-гидроксипропилированные ЦД, ацетилированные ЦД, разветвленные ЦД и сульфобутил-циклодекстрины. Синонимы циклодекстрина включают кавитрон, циклический олигосахарид, циклоамулозу и циклоглюкан. (В качестве обзора, см. Loftsson, T., and Brewster, M. E., J. Pharm. Sci. 85: 101 (1996); Uekama, K. et al., Chem. Rev. 98: 2045-2076 (1998); Me, T. and Uekama, K., Advanced Drug Delivery Reviews 36: 101-123 (1999); и Szjetli, J., Pure Appl. Chem. 76: 1825-1845 (2004)). Циклодекстрины имеют молекулярную массу менее чем 25000 дальтон и, следовательно, могут быть удалены из общей системы кровообращения путем клубочковой фильтрации в почках, поэтому можно ожидать, что они не будут накапливаться в организме. Документально подтверждено отсутствие токсичности природных циклодекстринов, также как и количество фармацевтически приемлемых релевантных производных, таких как гидроксипропил-бета-ЦД и сульфобутил-бета-ЦД (Uekama et al., выше; Szjetli, выше).

Циклодекстрины принимают форму усеченного конуса, когда внутреннее окружение является гидрофобным, а внешнее - гидрофильным. Гидрофобная полость обеспечивается окружением, в которое могут быть включены неполярные соединения подходящего размера, с образованием комплексов. ЦД и их производные используются в качестве солюбилизаторов для лекарственных средств, плохо растворимых в воде. Например, итраконазол (Sporanox^(TM)) растворяют с помощью гидроксипропил-бета-ЦД, а зипразидона мезилат (Geodon^(TM)) растворяют с помощью сульфобутилового эфира бета-циклодекстрина. Другие применения ЦД включают таковые для стабилизации лекарственных средств, для маскировки вкуса, их также используют в качестве адсорбента для эфирных масел. Доступные в настоящее время лекарственные продукты, которые содержат циклодекстрин, включают Sporanox^(TM) (Janssen, Бельгия), проставазин^(TM) (Ono, Япония; Schwarz, Германия), простандин-500^(TM) (Ono, Япония), Geodon^(TM) (Pfizer, США), VFEND^(TM)(Pfizer, США), MitoExtra Mitozytrex^(TM) (Novartis, Швейцария) и вольтарен^(TM) (Novartis, Швейцария). См. также таблицу 1 в публикации Szjetli, выше. Все указанные композиции ограничены низкомолекулярными соединениями. Высокомолекулярные лекарственные средства, такие как пептиды и белки, также могут образовывать комплексы с циклодекстринами. Полагают, что улучшенная биодоступность пептидных лекарственных средств, образующих комплексы с ЦД, отчасти возникает вследствие ингибирующего эффекта ЦД в отношении клеточных выкачивающих насосов (Challa, R. et al., AAPS Pharm. Sci. Tech. 6: E329-357 (2005)). Механизм стабилизации белков и пептидов также качественно отличается от такового в случае низкомолекулярных лекарственных средств. Несмотря на то, что ЦД могут образовывать комплексы включения с низкомолекулярными лекарственными средствами, ЦД обнаруживают способность связываться со специфическими обращенными в сторону растворителя аминокислотными остатками белка или пептида (Aachmann, F. L. et al., Protein Engineering 16: 905-912 (2003)). Максимально благотворный эффект обычно достигается при низких концентрациях циклодекстрина, и такой благотворный эффект зачастую лишь отчасти зависит от концентрации. Например, агрегация IL-2 оптимальным образом ингибируется 0,5% гидроксипропил-бета-циклодекстрином. (Loftsson и Brewster, выше). Растворимость гормона роста человека улучшается в присутствии приблизительно 2-6% ЦД, при этом обнаружено, что альфа- и гамма-ЦД в несколько раз менее эффективны, чем бета-циклодекстрины. (Otzen, D. E. et al., Protein Sci. 11: 1779-1787 (2002)).

Антиген CD20 (также называемый человеческим ограниченным B-лимфоцитами дифференцировочным антигеном, Bp35) является гидрофобным трансмембранным белком с молекулярной массой приблизительно в 35 кДа, локализованным на пре-B- и зрелых B-лимфоцитах (Valentine et al., J. Biol. Chem. 264(19): 11282-11287 (1989); и Einfeld et al., EMBO J. 7(3): 711-717 (1988)). Указанный антиген экспрессируется также на более чем 90% B-клеточных неходжкинских лимфом (НХЛ) (Anderson et al., Blood 63(6): 1424-1433 (1984)), однако не обнаруживается на гематопоэтических стволовых клетках, про-B-клетках, нормальных плазматических клетках или других нормальных тканях (Tedder et al., J. Immunol. 135(2): 973-979 (1985)). Считается, что CD20 регулирует раннюю стадию (стадии) в процессе активации инициации и дифференцировки клеточного цикла (Tedder et al., выше) и, возможно, функционирует в качестве канала иона кальция (Tedder et al., J. Cell. Biochem. 14D: 195 (1990)).

Если рассматривать экспрессию CD20 в B-клеточных лимфомах, данный антиген является полезной терапевтической мишенью для лечения таких лимфом. Например, антитело ритуксимаб (RITUXAN®, MABTHERA®), которое является созданным генно-инженерным путем химерным мышино-человеческим моноклональным антителом, направленным на человеческий антиген CD20 (коммерчески доступный в компаниях Genentech, Inc., к югу от Сан-Франциско, Калифорния, США, и F. Hoffmann-La Roche AG, Базель, Швейцария), используется для лечения пациентов с рецидивирующей или стойкой высокодифференцированной или фолликулярной, CD20-положительной B-клеточной неходжкинской лимфомой. Ритуксимаб является антителом, обозначаемым "C2B8" в патенте США № 5736137, опубликованном 7 апреля 1998 г. (Anderson et al.), и в патенте США № 5776456. Другие анти-CD20-антитела, предписанные для лечения НХЛ, включают мышиное антитело Zevalin^(TM), которое соединено с радиоактивным изотопом иттрием-90 (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA), и Bexxar^(TM), которое является еще одним полностью мышиным антителом, конъюгированным с ¹³¹I (Corixa, WA).

CD20 является также полезным антигеном-мишенью для лечения аутоиммунных заболеваний. Действие ритуксимаба изучали также и при различных незлокачественных аутоиммунных заболеваниях, при которых B-клетки и аутоантитела, вероятно, играют роль в патофизиологии заболевания - см., например, Edwards et al., Biochem Soc. Trans. 30: 824-828 (2002). Сообщалось о том, что ритуксимаб потенциально способен смягчать признаки и симптомы, например, ревматоидного артрита (РА) (Leandro et al., Ann. Rheum. Dis. 61: 883-888 (2002); Edwards et al., Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S46 (2002); Stahl et al., Ann. Rheum. Dis., 62 (Suppl. 1): OP004 (2003); Emery et al., Arthritis Rheum. 48(9): S439 (2003)), волчанки (Eisenberg, Arthritis. Res. Ther. 5: 157-159 (2003); Leandro et al Arthritis Rheum. 46: 2673-2677 (2002); Gorman et al., Lupus, 13: 312-316 (2004)), иммунной тромбоцитопенической пурпуры (D'Arena et al., Leuk. Lymphoma 44: 561-562 (2003); Stasi et al., Blood, 98: 952-957 (2001); Saleh et al., Semin. Oncol, 27 (Supp 12): 99-103 (2000); Zaia et al., Haematolgica, 87: 189-195 (2002); Ratanatharathorn et al., Ann. Int. Med., 133: 275-279 (2000)), истинной эритроцитарной аплазии (Auner et al., Br. J. Haematol, 116: 725-728 (2002)); аутоиммунной анемии (Zaja et al., Haematologica 87: 189-195 (2002) (обнаружена ошибка: Haematologica 87: 336 (2002)), синдрома холодовой агглютинации (Layios et al., Leukemia, 15: 187-8 (2001); Berentsen et al., Blood, 103: 2925-2928 (2004); Berentsen et al., Br. J. Haematol, 115: 79-83 (2001); Bauduer, Br. J. Haematol, 112: 1083-1090 (2001); Damiani et al., Br. J. Haematol, 114: 229-234 (2001)), синдрома B-типа тяжелой резистентности к инсулину (Coll et al., N. Engl. J. Med., 350: 310-311 (2004), криоглобулинемии смешанного типа (DeVita et al., Arthritis Rheum. 46 Suppl. 9: S206/S469 (2002)), миастении гравис (Zaja et al., Neurology, 55: 1062-63 (2000); Wylam et al., J. Pediatr., 143: 674-677 (2003)), гранулематоза Вегенера (Specks et al., Arthritis & Rheumatism 44: 2836-2840 (2001)), рефрактерной обыкновенной пузырчатки (Dupuy et al., Arch Dermatol, 140: 91-96 (2004)), дерматомиозита (Levine, Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S1299 (2002)), синдрома Шегрена (Somer et al., Arthritis & Rheumatism, 49: 394-398 (2003)), активной типа-II криоглобулинемии смешанного типа (Zaja et al., Blood, 101: 3827-3834 (2003)), обыкновенной пузырчатки (Dupay et al., Arch. Dermatol, 140: 91-95 (2004)), аутоиммунной нейропатии (Pestronk et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 74: 485-489 (2003)), паранеопластического опсоклонус-миоклонус-синдрома (Pranzatelli et al. Neurology 60(Suppl.1) PO5.128: A395 (2003)) и возвратно-ремиттирующего рассеянного склероза (RRMS). Cross et al. (abstract) "Preliminary results from a phase II trial of Rituximab in MS" Eighth Annual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis, 20-21 (2003).

В настоящем изобретении предложены способы и композиции для предотвращения агрегации макромолекул, таких как антитела, в физиологических условиях. Способы согласно изобретению обеспечивают преимущества в изготовлении композиций терапевтических белков, таких как анти-CD20-антитела, описанные в настоящей заявке. Указанные преимущества включают возможность изготавливать композиции для подкожной инъекции, которая будет обладать повышенной биодоступностью терапевтического антитела и характеризоваться уменьшением воспаления в месте инъекции, а также дополнительными преимуществами, которые станут очевидными из нижеследующего подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Циклодекстрины используются биохимиками в качестве солюбилизаторов для плохорастворимых в воде лекарственных средств. Открытие авторами данного изобретения того, что различные типы циклодекстринов (например, сульфобутилэфир, гамма-гидроксипропил, бета-гидроксипропил) ингибируют агрегацию и флокуляцию белка, в частности, антител, является неожиданным, поскольку антитела являются высокорастворимыми в воде. Следовательно, открытие того, что циклодекстрины ингибируют агрегацию и флокуляцию антител в высоких концентрациях, является не чем иным как новым применением циклодекстрина. Авторы изобретения разработали также новый способ скрининга in vitro, который включает применение диализных трубок, отсекающих определенную молекулярную массу (М.м.), и адаптированные высвобождающиеся среды, при этом и то, и другое имитирует физиологические условия на участке (в месте) инъекции.

В настоящем изобретении предложен способ уменьшения агрегации и ингибирования флокуляции макромолекулы, такой как белок, при физиологических условиях, путем добавления от 2% до 30% циклодекстринов (ЦД), где указанный циклодекстрин выбран из группы, состоящей из бета-гидроксипропил- (HP-бета), гамма-гидроксипропил- (HP-гамма) и сульфобутилэфир-(SBE)-циклодекстрина. Значительное уменьшение агрегации и флокуляции при добавлении циклодекстринов коррелировало также со значительным уменьшением воспаления в месте подкожной инъекции у крыс. Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ минимизации воспаления на участке инъекции при подкожном введении макромолекулы, такой как белок, путем введения от 2% до 30% HP-бета-циклодекстрина, HP-гамма-циклодекстрина или SBE-циклодекстрина в композицию, предназначенную для подкожного введения. В различных воплощениях настоящего изобретения макромолекулой является антитело. В дополнительных воплощениях настоящего изобретения антитело представляет собой антитело терапевтического назначения или антитело диагностического назначения.

В различных воплощениях настоящего изобретения макромолекулой является анти-CD20-антитело. В определенных воплощениях настоящего изобретения анти-CD20-антитело представляет собой гуманизированное антитело. В определенных воплощениях настоящего изобретения анти-CD20-антитело содержит один из вариантов A, B, C, D, F, G, H или I из таблицы 1. В настоящем изобретении дополнительно предложены способы и композиции, в которых анти-CD20-антитело содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-15. В дополнительных воплощениях настоящего изобретения антитело содержит вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO:1 и вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:2, или вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO:3 и вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:4, или вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO:3 и вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:5. В настоящем изобретении дополнительно предложены способы и композиции, в которых антитело содержит полноразмерную легкую цепь последовательности SEQ ID NO:6 и полноразмерную тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:15. В настоящем изобретении дополнительно предложены способы и композиции, в которых антитело содержит полноразмерную легкую цепь последовательности SEQ ID NO:9 и полноразмерную тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14.

В дополнительных аспектах настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для подкожного введения макромолекулы, такой как белок, содержашая от 2% до 30% HP-бета-циклодекстрина, HP-гамма-циклодекстрина или SBE-циклодекстрина. В некоторых воплощениях настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для подкожного введения антитела, содержашая указанное антитело в концентрации в интервале от 10 мг/мл до 200 мг/мл и от 2% до 30% HP-бета-циклодекстрина, HP-гамма-циклодекстрина или SBE-циклодекстрина. В некоторых воплощениях концентрация указанного антитела варьирует в интервале от 30 мг/мл до 150 мг/мл. В дополнительных воплощениях концентрация антитела варьирует в интервале от 100 до 150 мг/мл. В определенных воплощениях фармацевтическая композиция содержит HP-бета-циклодекстрин в концентрации от 5% до 30%. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция содержит HP-гамма-циклодекстрин от 5% до 20%. В определенных воплощениях фармацевтическая композиция дополнительно содержит аргининсукцинат в концентрации от 50 мМ до 200 мМ. В определенных воплощениях фармацевтическая композиция содержит SBE-циклодекстрин в концентрации от 2% до 9%. В определенных воплощениях фармацевтическая композиция содержит антитело в концентрации, приблизительно составляющей 100 мг/мл, а HP-бета-циклодекстрин в концентрации от 15% до 30%. В определенных воплощениях фармацевтическая композиция содержит антитело в концентрации, приблизительно составляющей 150 мг/мл, а HP-бета-циклодекстрин в концентрации, приблизительно составляющей 30%. В определенных воплощениях фармацевтическая композиция содержит антитело в концентрации, приблизительно составляющей 150 мг/мл, а HP-гамма циклодекстрин в концентрации, приблизительно составляющей 10%. В определенных воплощениях фармацевтическая композиция дополнительно содержит аргининсукцинат в концентрации от 50 мМ до 200 мМ. В специфическом воплощении фармацевтическая композиция содержит гуманизированное антитело 2H7 в концентрации в интервале от 100 мг/мл до 150 мг/мл, HP-гамма циклодекстрин в концентрации от 15% до 30% и аргининсукцинат в концентрации от 50 мМ до 100 мМ. В дополнительных воплощениях фармацевтическая композиция дополнительно содержит 30 мМ ацетата натрия; 5% дигидрата трегалозы и 0,03% полисорбата-20, при pH 5,3.

В настоящем изобретении дополнительно предложены любая из указанных выше композиций, содержащих гуманизированное анти-CD20-антитело, состоящее из любого из антител, перечисленных в таблице 1. В настоящем изобретении дополнительно предложены композиции, в которых указанное анти-CD20-антитело содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-15. В дополнительных воплощениях настоящего изобретения указанное антитело содержит вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO:1 и вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:2, или вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO:3 и вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:4. В настоящем изобретении дополнительно предложены способы и композиции, в которых антитело содержит полноразмерную легкую цепь последовательности SEQ ID NO:6 и полноразмерную тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:15. В настоящем изобретении дополнительно предложены способы и композиции, в которых антитело содержит полноразмерную легкую цепь последовательности SEQ ID NO:9 и полноразмерную тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14.

В настоящем изобретении дополнительно предложен способ лечения рака B-клеток, экспрессирующих CD20, включающий введение любого из гуманизированных анти-CD20-антител из таблицы 1 в составе фармацевтической композиции, содержащей от 2% до 30% HP-бета-циклодекстрина, HP-гамма-циклодекстрина или SBE-циклодекстрина. CD20-положительным B-клеточным раком предпочтительно является B-клеточная лимфома или лейкемия. В специфических воплощениях композиции, содержащие гуманизированные антитела 2H7, которые связываются с человеческим CD20 (hCD20) и его функциональными фрагментами, используются для лечения неходжкинской лимфомы (НХЛ), НХЛ низкой степени злокачественности, включая рецидивирующую и стойкую к действию ритуксимаба НХЛ низкой степени злокачественности, лимфоцит-доминирующей болезни Ходжкина (LPHD), мелкоклеточной B-лимфоцитарной лимфомы (SLL), хронической лимфоцитарной лейкемии (ХЛЛ). В специфических воплощениях композиции, содержащие гуманизированные CD20-связывающие антитела, в частности, варианты A, B, C, D или H из таблицы 1, и их функциональные фрагменты, используются для лечения перечисленных выше CD20-положительных типов B-клеточного рака.

В настоящем изобретении предложен также способ лечения аутоиммунного заболевания, включающий введение пациенту, страдающему от указанного аутоиммунного заболевания, терапевтически эффективного количества гуманизированного антитела 2H7, указанного в таблице 1, в составе фармацевтической композиции, содержащей от 2% до 30% HP-бета-циклодекстрина, HP-гамма-циклодекстрина или SBE-циклодекстрина. В специфических воплощениях аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита (РА) и ювенильного ревматоидного артрита, а пациенты с РА являются пациентами, неадекватно реагирующими на воздействие метотрексата (Mtx) и неадекватно реагирующими на воздействие антагониста TNFα, пациентами, резистентными к воздействию ритуксимаба, или пациентами с рецидивом заболевания. В одном из воплощений пациентом с РА является пациент, резистентный к воздействию другого терапевтического анти-CD20-антитела, или пациент с рецидивом. В других воплощениях аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из системной красной волчанки (СКВ), включая волчаночный нефрит, рассеянного склероза (РС), возвратно-ремиттирующего рассеянного (или множественного) склероза (RRMS), гранулематоза Вегенера, воспалительного заболевания кишечника, язвенного колита, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP), тромботической тромбоцитопенической пурпуры (TTP), аутоиммунной тромбоцитопении, рассеянного склероза, псориаза, IgA-нефропатии, IgM-полиневропатий, миастении гравис, ANCA-ассоциированного васкулита, сахарного диабета, синдрома Рейно, синдрома Шегрена, оптиконевромиелита (NMO) и гломерулонефрита. В специфических воплощениях композиции, содержащие гуманизированные CD20-связывающие антитела, в частности, варианты A, B, C, D или H из таблицы 1, или их функциональные фрагменты, используются для лечения перечисленных выше аутоиммунных заболеваний.

В определенных воплощениях способов лечения указанных выше заболеваний, субъект или пациент, страдающий от указанного заболевания, является приматом, предпочтительно человеком.

В настоящем изобретении дополнительно предложен способ улучшения или поддержания растворимости или минимизации выпадения в осадок антитела в составе водной композиции для подкожного введения при ее инъецировании в место введения пациенту, где указанный способ включает добавление от 2% до 30% HP-бета-циклодекстрина, HP-гамма-циклодекстрина или SBE-циклодекстрина к водной композиции для подкожного введения. В определенных воплощениях фармацевтическая композиция содержит HP-бета-циклодекстрин в концентрации от 5% до 30%. В определенных воплощениях фармацевтическая композиция содержит HP-гамма-циклодекстрин в концентрации от 5% до 20%. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция дополнительно содержит аргининсукцинат в концентрации от 50 мМ до 200 мМ. В определенных воплощениях фармацевтическая композиция содержит SBE-циклодекстрин в концентрации от 2% до 9%.

В настоящем изобретении дополнительно предложен способ повышения биодоступности вводимого подкожно антитела, включающий добавление от 2% до 30% HP-бета-циклодекстрина, HP-гамма-циклодекстрина или SBE-циклодекстрина к водной композиции для подкожного введения, содержащей указанное антитело. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция содержит HP-бета-циклодекстрин в концентрации от 5% до 30%. В определенных воплощениях фармацевтическая композиция содержит HP-гамма-циклодекстрин в концентрации от 5% до 20%. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция дополнительно содержит аргининсукцинат в концентрации от 50 мМ до 200 мМ. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция содержит SBE-циклодекстрин в концентрации от 2% до 9%.

В настоящем изобретении дополнительно предложен способ диализа in vitro для оценки способности эксципиента уменьшать агрегацию антитела или другой макромолекулы в физиологических условиях, включающий диализ композиций макромолекулы, в присутствии или в отсутствие тестируемого эксципиента, против тестируемой среды, для имитации физиологических условий при 37°C, при постоянном перемешивании; взятие образцов раствора модифицированной среды; и измерение внешних проявлений, таких как мутность образцов и количество белка, присутствующего в высвобождаемой среде, такими методами, как УФ-фотометрическое сканирование, при этом увеличение концентрации белка и уменьшение мутности в высвобождаемой среде в образце для анализа, содержащем тестируемый эксципиент, по сравнению с контрольным образцом, не содержащим эксципиент, являются показателем того, что тестируемый эксципиент способен уменьшать агрегацию указанной макромолекулы. В специфических воплощениях указанную среду сопоставляют с модифицированным раствором PBS, таким как раствор PBS, содержащий 167 мМ натрия, 140 мМ хлорида, 17 мМ фосфата, 4 мМ калия. В специфических воплощениях указанного способа диализная трубка отсекает макромолекулы с молекулярной массой выше, чем 1 миллион дальтон. В дополнительных специфических воплощениях указанного способа, концентрацию белка и мутность в тестируемых образцах измеряют с использованием УФ-спектрометрии. В дальнейших воплощениях указанного способа, такой способ включает визуальный осмотр модифицированной высвобождаемой среды и раствора внутри диализной трубки на предмет осаждения, при этом уменьшение осаждения в диализной трубке, содержащей тестируемый эксципиент, по сравнению с контрольным образцом, не содержащим эксципиент, являются показателем того, что тестируемый эксципиент способен уменьшать агрегацию указанной макромолекулы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 показана агрегация антитела 2H7 при физиологических условиях. 2H7 в концентрации 150 мг/мл диализовали против буфера PBS в течение двух дней при 37°C.

На фиг. 2 показана модель диализа in vitro, используемая для оценки эффектов, оказываемых эксципиентами, в отношении агрегации антитела 2H7 при физиологических условиях. 250-мл стеклянный сосуд заполняли 220 мл модифицированного раствора PBS (167 мМ натрия, 140 мМ хлорида, 17 мМ фосфата, 4 мМ калия) при 37°C. 12-миллиметровую диализную трубку длиной в 6 см зажимали с одного конца, заполняли приблизительно 1 мл тестируемого образца, избыточный воздух удаляли, и другой конец трубки перехватывали зажимом. Стеклянный сосуд помещали в условия при 37°C и при постоянном перемешивании.

На фиг. 3 показано поведение контролей в диализной модели in vitro. Как 2H7, так и rhuMab CD11a тестировали в диализной модели, представленной на фиг. 2. Кумулятивное процентное содержание белка, высвобождаемого в раствор PBS, измеряли во временных точках, соответствующих 2,5, 6, 12, 24, 33 и 48 часам.

На фиг. 4 показано воздействие 2-9% SBE-циклодекстрина на высвобождение 2H7 в указанной модели in vitro.

На фиг. 5 показано воздействие 5-20% HP-гамма-циклодекстрина на высвобождение 2H7 в указанной модели in vitro.

На фиг. 6 показано воздействие 5-20% HP-бета-циклодекстрина на высвобождение 2H7 в указанной модели in vitro.

На фиг. 7 показано воздействие HP-гамма-циклодекстрина и аргининсукцината на высвобождение 2H7 в указанной модели in vitro.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВОПЛОЩЕНИЙ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Различные формы глагола "агрегировать" относятся к процессу, при котором индивидуальные белковые молекулы или комплексы ассоциируют с образованием агрегатов. "Агрегат" представляет собой совокупность полимеров, включающую молекулы или комплексы белка. Агрегация может происходить до такой степени, что образуется видимый осадок. Образование такого видимого осадка называется здесь также "флокуляцией".

Относительное количество преципитата макромолекул может быть определено, например, путем сравнения с визуальным контролем. Дополнительные способы анализа преципитации известны в данной области и описаны ниже, например, способ диализа in vitro, подробно описанный в примере 2, или модель in vivo, описанная в примере 3.

Термин "биодоступность" относится к степени, в которой - или к скорости, при которой - лекарственное средство или другое вещество абсорбируется или становится доступным в области физиологической активности в месте его введения. Биодоступность макромолекулы может быть изучена с помощью фармакокинетических методов in vivo, известных в данной области.

Термин "макромолекула" относится к молекуле с молекулярной массой, по меньшей мере составляющей 10000 дальтон, и может включать в себя белки, такие как антитела.

Термины "эксципиент" или "фармацевтический эксципиент" относятся к соединениям, которые могут уменьшить агрегацию макромолекулы. Эксципиенты могут включать сахара, соли, свободные аминокислоты, такие как L-аргинин и L-глутамин, полиолы, полиэтиленгликоли (ПЭГ) и другие полимеры, такие как полисорбаты, полоксамеры или поливинилпирролидон.

Термин "циклодекстрин" (или "ЦД") относится к циклическим олигосахаридам, имеющим d-глюкопиранозные звенья, соединенные альфа-(l,4)-гликозидными связями. Наиболее часто встречающимися, образующимися природным путем циклодекстринами являются альфа-циклодекстрин, бета-циклодекстрин и гамма-циклодекстрин, состоящие, соответственно, из 6, 7 и 8 глюкопиранозных звеньев. Синонимы циклодекстрина включают кавитрон, циклический олигосахарид, циклоамулозу и циклоглюкан. Используемый здесь термин "циклодекстрин" может дополнительно включать в себя производные циклодекстрина, включая, но не ограничиваясь указанным, метилированные ЦД, 2-гидроксипропилированные ЦД, ацетилированные ЦД, разветвленные ЦД и сульфобутил-циклодекстрины.

Термин "терапевтическое антитело" относится к антителу, которое используется при лечении заболевания. Терапевтическое антитело может иметь различные механизмы дейтвия. Терапевтическое антитело может связываться с мишенью и нейтрализовать ее нормальную функцию. Например, моноклональное антитело, которое блокирует активность белка, необходимого для выживания раковых клеток, вызывает гибель таких клеток. Другое терапевтическое моноклональное антитело может связываться с мишенью и активировать его нормальную функцию. Например, моноклональное антитело может связываться с белком на клеточной поверхности и запускать сигнал апоптоза. Наконец, если моноклональное антитело связывается с мишенью, экспрессируемой только на пораженной болезнью ткани, путем конъюгации токсичного вещества (эффективный агент), такого как химиотерапевтический или радиоактивный агент, с моноклональным антителом можно создать средство для специфической доставки токсичного вещества к пораженной болезнью ткани, уменьшая, таким образом, вред, наносимый здоровой ткани.

Термин "диагностическое антитело" относится к антителу, которое используется в качестве диагностического антитела в отношении того или иного заболевания реагента. Такое диагностическое антитело может связываться с мишенью, которая специфически ассоциирована с конкретным заболеванием или которая при указанном заболевании экспрессируется в повышенном количестве. Диагностическое антитело может быть использовано, например, для детектирования мишени в биологическом образце, полученном из организма пациента, или для диагностической визуализации у пациента пораженных болезнью участков, таких как опухоли.

Антиген "CD20" является негликозилированным трансмембранным фосфопротеином с молекулярной массой, приблизительно составляющей 35 кДа, который обнаруживается на поверхности более чем 90% B-клеток из периферической крови или лимфоидных органов. CD20 экспрессируется в процессе ранней стадии развития пре-B-клеток и сохраняется до стадии дифференцировки в плазматические клетки; указанный антиген не обнаруживается на стволовых клетках человека, лимфоиднык клетках-предшественниках или нормальных плазматических клетках. CD20 присутствует как на нормальных B-клетках, так и на злокачественных B-клетках. Другие названия, встречающиеся в литературе для CD20, включают в себя "ограниченный B-лимфоцитами дифференцировочный антиген" и "Bp35". Антиген CD20 описан, например, у Clark and Ledbetter, Adv. Can. Res. 52: 81-149 (1989) и Valentine et al. J. Biol. Chem. 264(19): 11282-11287 (1989).

Термин "антитело" используется в широком смысле и, в частности, охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), и фрагменты антител, при условии, что они проявляют требуемую биологическую активность или функцию.

Биологическая активность гуманизированных CD20-связывающих антител согласно изобретению будет включать по меньшей мере связывание такого антитела с человеческим антигеном CD20, более предпочтительно, связывание с антигеном CD20 другого примата (включая макак-крабоедов, макак-резус, шимпанзе). Такие антитела должны будут связываться с CD20 с Kd, составляющей не более чем 1×10^-8, предпочтительно с Kd, составляющей не более чем 1×10^-9, и будут способны уничтожать или истощать B-клетки in vivo, предпочтительно по меньшей мере на 20% по сравнению с соответствующим отрицательным контролем, не обработанным таким антителом. Истощение B-клеток может быть результатом одного или более из таких механизмов, как ADCC, CDC, апоптоз или другой механизм. В некоторых воплощениях указанного здесь лечения заболеваний, могут больше других потребоваться специфические эффекторные функции или механизмы, также как и определенные варианты гуманизированного антитела 2H7 могут оказаться более предпочтительными для достижения указанных биологических функций, таких, например, как ADCC.

Термин "фрагменты антитела" включает в себя часть полноразмерного антитела, обычно его антигенсвязывающий участок или его вариабельную область. Примеры фрагментов антитела включают Fab-, Fab'-, F(ab')₂ и Fv-фрагменты; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

"Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий участок. Такой фрагмент состоит из димера, образованного вариабельными доменами одной тяжелой и одной легкой цепи, находящимися в тесной нековалентной ассоциации друг с другом. Из пространственной упакованной структуры указанных двух доменов выступает шесть гипервариабельных петель (по 3 петли из H- и L-цепей), аминокислотные остатки которых участвуют в связывании антигена и придают антителу специфичность связывания антигена. Однако даже одиночный вариабельный домен (или половина фрагмента Fv, содержащая только три специфичных в отношении антигена участка CDR) обладает способностью распознавать антиген и связываться с ним, хоть и с меньшей аффинностью, чем полный участок связывания.

Используемый здесь термин "моноклональное антитело" относится к антителу из популяции по существу гомогенных антител, то есть индивидуальные антитела, содержащиеся в такой популяции, являются идентичными и/или связываются с одним и тем же эпитопом (эпитопами), за исключением возможных вариантов, которые могут возникать в процессе продуцирования моноклонального антитела, однако такие варианты обычно присутствуют в минорных количествах. Такое моноклональное антитело обычно включает антитело, содержащее полипептидную последовательность, которая связывается с мишенью, где связывающаяся с мишенью полипептидная последовательность была получена способом, который включает в себя выбор единственной связывающейся с мишенью полипептидной последовательности из множества полипептидных последовательностей. Например, процесс отбора может представлять собой селекцию единственного клона из множества клонов, таких как пул гибридомных клонов, фаговых клонов или клонов рекомбинантных ДНК. Следует понимать, что выбранная связывающаяся с мишенью последовательность может быть дополнительно изменена, например, для улучшения аффинности в отношении мишени, для гуманизации связывающейся с мишенью последовательности, для улучшения ее продуцирования в клеточной культуре, для уменьшения ее иммуногенности in vivo, для создания мультиспецифического антитела и т.д., и что антитело, содержащее такую измененную связывающуюся с мишенью последовательность, также является моноклональным антителом согласно настоящему изобретению. В отличие от получения препаратов поликлональных антител, которые обычно включают в себя различные антитела, направленные на разные детерминанты (эпитопы), каждое моноклональное антитело в препарате моноклональных антител направлено на единственную антигенную детерминанту. Помимо их специфичности, препараты моноклональных антител предпочтительны в том отношении, что они обычно не имеют примесей других иммуноглобулинов. Определение "моноклональное" указывает на характер антитела, то есть на то, что антитело получено из поп