Композиция палочковидных бактерий, устойчивых к желчи и секретирующих высокие уровни незаменимых аминокислот

Композиция палочковидных бактерий, устойчивых к желчи и секретирующих высокие уровни незаменимых аминокислот

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к композиции палочковидных бактерий (бацилл), характеризующихся быстрым прорастанием и ростом в солях желчных кислот (моделированной кишечной среде) и высоким уровнем секреции незаменимых аминокислот. Композиция палочковидных бактерий может быть использована в качестве пищевой добавки в кормовой продукт для животного, где она оказывает пробиотическое воздействие (поддержание здоровья и стимуляция роста) и усиливает пищеварение и доступность нутриентов из кормовых для животных.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Пробиотические бактерии, такие как Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, используют в области кормовых продуктов для животных в качестве кормовой добавки к рациону. Их применение связано со способностью палочковидных бактерий заменять или снижать применение антибиотиков, которые используют в качестве стимуляторов роста в производстве кормовых продуктов для животных.

Christian Hansen A/S, Denmark, представляет на рынке пример такого пробиотического продукта, стимулирующего рост, под торговой маркой GalliPro^® (депонированный как DSM 17231). GalliPro^® представляет собой композицию споровых клеток Bacillus subtilis.

Кроме того, предположительный механизм действия (например, иммуномодуляция, модификатор кишечной флоры) пробиотических палочковидных бактерий приводит к продуцированию множества оказывающих положительное воздействие компонентов, таких как ферменты, которые выделяются в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) при использовании в качестве кормовой добавки к кормовому продукту для животных. Выделяющиеся ферменты, такие как фитаза, улучшают переваривание и усвоение кормового продукта для животных (более высокая перевариваемость). Рацион (корм, кормовой продукт), главным образом, включает компоненты растительного происхождения, такие как злаковые, кукуруза, соевые бобы, соевое масло и аминокислоты. В целом все это позволяет получить рентабельные кормовые продукты для животных.

Пробиотические палочковидные бактерии также способны продуцировать другие оказывающие положительное воздействие компоненты, такие как незаменимые аминокислоты.

Споры палочковидных бактерий могут проходить через кислотный желудочный барьер, прорастать и расти в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) животных. Это является огромным преимуществом, поскольку при потреблении внутрь они могут выделять различные типы оказывающих положительное воздействие компонентов, например бактериоцины, и также выделяют полезные незаменимые аминокислоты. Дополнительно, споры палочковидных бактерий термостабильны в процессе пеллетизации кормового продукта и, следовательно, они являются превосходной системой доставки для доставки бактериоцинов, например незаменимых аминокислот, в ЖКТ. В процессе выживания и пролиферации палочковидных бактерий в ЖКТ очень важна роль желчи. Желчь продуцируется в печени и хранится в желчном пузыре. Желчь содержит воду, лецитин, билирубин, биливердин и соли желчных кислот.

Из литературы известно, что желчь оказывает негативное воздействие на выживание, прорастание и рост споровых клеток палочковидных бактерий в вегетативные клетки в ЖКТ животных. Следовательно, в настоящее время проводятся исследования по обнаружению пробиотических штаммов Bacillus, устойчивых к желчи.

В статье (Antonie Van Leeuwenhoek. 2006 Aug; 90(2): 139-46. Epub 2006 Jul 4) описывается выделение образцов Bacillus/клеток непосредственно из кишечника кур. Выделенные клетки палочковидных бактерий тестируют на пробиотическую активность. Шесть палочковидных бактерий с наивысшей пробиотической активностью тестируют на устойчивость к солям желчных кислот, и было обнаружено, что специфические высоко пробиотические палочковидные бактерии имеют относительно высокий уровень устойчивости к солям желчных кислот.

В этой статье не уделяется особого внимания каким-либо временным периодам тестирования на устойчивость к желчи. В экспериментальной части споровые клетки просто тестируют на устойчивость после 5 дней присутствия в солях желчных кислот (см. абзац «Simulated small intestinal fluid tolerance test» на странице 141).

В US 2003/0124104 A описывается, что эндоспоры традиционных пробиотических палочковидных бактерий чувствительны к низким концентрациям солей желчных кислот, то есть прорастание спор и/или регидратация ингибируются присутствием даже низких концентраций солей желчных кислот. Это отличает их от других бактерий, таких как кишечные патогенны, такие как E. coli или S. aureus (см. абзацы [0014]-[0015]). Ввиду этого предлагается проводить скрининг/отбор спор палочковидных бактерий, устойчивых к ингибированию активности солями желчных кислот и прорастающих в результате в вегетативные клетки, которые затем колонизируют толстую кишку (см. [0019]).

В описании приведены рабочие примеры и отсутствуют реальные экспериментальные данные фактически полученных скринингом клеток специфических Bacillus.

Дополнительно приведены относительно общие условия скрининга на устойчивость к солям желчных кислот. В частности, нет указаний на временные периоды для отбора на устойчивость к солям. Говоря другими словами, основываясь только на широком/общем описании этого документа, могут быть выбраны клетки Bacillus, которые могут расти (прорастать) только медленно, то есть способны прорастать из спор в вегетативные клетки через, например, 20 часов в присутствии значимого количества соли желчных кислот.

В этом документе нет описания или предложения по выбору клеток палочковидных бактерий, которые могут расти (прорастать) быстро, то есть способны прорастать или расти из спор в вегетативные клетки, достигая определенной точки роста за определенный интервал времени в присутствии значимого количества солей желчных кислот.

Таким образом, в ссылках из предшествующего уровня техники, относящихся к отбору/скринингу устойчивых клеток палочковидных бактерий, не уделяется внимание быстрому росту/прорастанию палочковидных бактерий из споровых клеток в вегетативные клетки.

Международная патентная публикация PCT/EP2008/057296 подана 11/06/2008, Заявитель Chr. Hansen A/S и не опубликована на момент подачи настоящей патентной заявки.

В PCT/EP2008/057296 описываются споры новых палочковидных бактерий, характеризующихся повышенной/более быстрой скоростью прорастания и роста из спор в вегетативные клетки в присутствии среды с солями желчных кислот. Споры палочковидных бактерий, описанные здесь, имеют такую же повышенную/более быструю скорость прорастания и роста из спор в вегетативные клетки, как описано в PCT/EP2008/057296.

В PCT/EP2008/057296 описываются только вегетативные клетки палочковидных бактерий, продуцирующих повышенное количество фитазы по сравнению с контрольными клетками палочковидной бактерии DSM 19467. Не описывается и не предлагается скрининг вегетативных клеток палочковидных бактерий, продуцирующих незаменимые аминокислоты в повышенных количествах по сравнению с контрольными клетками палочковидных бактерий DSM 19467.

Следует понимать, что приведенные ниже ссылки на предшествующий уровень техники относятся к общедоступным материалам (например, опубликованные статьи, патенты) на момент подачи настоящей патентной заявки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Проблема в настоящем изобретении решается за счет обеспечения композиции палочковидных бактерий, выделяющих (продуцирующих) высокие уровни незаменимых аминокислот в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) животного.

Решение основывается на том, что авторы настоящего изобретения разработали новый способ отбора для идентификации композиций новых улучшенных палочковидных бактерий.

Новой важной стадией описанного здесь нового способа отбора является специфический скрининг/отбор споровых клеток палочковидных бактерий с повышенной/большей скоростью прорастания и роста из спор в вегетативные клетки в присутствии солей желчных кислот. Как указано выше, в предшествующем уровне техники описаны способы отбора клеток палочковидных бактерий, способных расти в присутствии солей желчной кислоты, но способы скрининга/отбора по предшествующему уровню техники не фокусируются на скорости прорастания и роста в присутствии соли желчной кислоты.

Следовательно, выбранные в предшествующем уровне техники устойчивые к соли желчных кислот клетки палочковидных бактерий не прорастают и не растут достаточно быстро для того, чтобы соответствовать критериям скорости прорастания и роста, описанным здесь. Например, клетки палочковидной бактерии, выделенные непосредственно из кишечника, например, кур (как, например, описано выше в статье Antonie Van Leeuwenhoek) не выбирают в кишечной среде (при атмосферном давлении) для быстрого прорастания и роста в кишечнике.

Как показано в рабочих примерах в настоящем описании, это также справедливо для коммерчески доступной композиции Bacillus GalliPro®, содержащей бациллы, которые просто прорастают или растут слишком медленно и не достигают заданной точки роста в первые 20 часов в присутствии физиологических уровней солей желчных кислот для того, чтобы соответствовать критериям скорости прорастания и роста, описанным здесь. GalliPro® представляет композицию Bacillus subtilis, которая является коммерчески доступной.

Описанный здесь новый DSM 19467 отобран с использованием в качестве исходного штамма GalliPro® и при использовании способа селективного давления с последующим выделением для быстрого прорастания и роста из спор в вегетативные клетки в присутствии соли желчных кислот, как описано в настоящем изобретении.

Дополнительные детали смотрите, например, в Таблице 1 (GalliPro®, который также может быть указан здесь как DSM).

Это показано схематически на Фигуре 1.

Кроме того, считается, что в предшествующем уровне техники не описана выделенная композиция Bacillus, включающая в пределах от 10⁵ до 10¹² КОЕ/г клеток палочковидных бактерий, где клетки композиции палочковидных бактерий отвечают условиям быстрого прорастания и роста в присутствии соли желчных кислот, как описано в настоящем изобретении.

Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения определили, что быстрое прорастание и рост являются очень важным аспектом настоящего изобретения, поскольку споры палочковидной бактерии, которые устойчивы к желчи, но не достаточно быстро прорастают и растут, будут экскремированы до того как проявятся любые положительные характеристики, такие как продуцирование незаменимой аминокислоты вегетативными клетками палочковидных бактерий. Споры Bacillus, прорастая слишком медленно, просто проходят через желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) до того как бактерии начнут продуцировать какое-либо значительное количество, например, незаменимых аминокислот.

После множества детальных тестов и анализов авторы настоящего изобретения, таким образом, выбрали для работы временные пределы вплоть до 20 часов и отобрали в этом временном пределе самые быстро прорастающие и растущие споры в присутствии высоких физиологических концентраций солей желчной кислоты. Не желая быть ограниченными какой-либо теорией и основываясь на описанной здесь тщательной экспериментальной работе, авторы настоящего изобретения определили, что важно иметь высокие скорость прорастания и рост в первые 18-19 часов в присутствии в пределах от 4 до 6 мМ соли желчных кислот соответственно.

Затем авторы настоящего изобретения установили, что если отобраны клетки палочковидных бактерий с быстрыми прорастанием и ростом в среде с солями желчных кислот, эти клетки становятся весьма полезными в качестве исходных клеток для мутагенеза для получения новых клеток усиленным продуцированием незаменимой аминокислоты.

Как схематически показано на Фиг. 1 и в Примере 4, быстро прорастающий устойчивый к соли желчных кислот отобранный штамм DSM 19467 используют в качестве исходного штамма для классической мутации и выбирают штамм, продуцирующий незаменимую аминокислоту. Как видно из Примера 4, некоторые из отобранных штаммов продуцируют по меньшей мере в 5 раз больше незаменимой аминокислоты лейцина, чем DSM 19467 и GalliPro®.

Новые пробиотические клетки палочковидных бактерий по настоящему изобретению, следовательно, являются устойчивыми к соли желчных кислот, быстро прорастают, растут и выделяют большие количества незаменимой аминокислоты. Полученные штаммы в высшей степени подходят для использования в качестве композиций пробиотических палочковидных бактерий для добавления в кормовой продукт для животных. Они объединяют все оказывающие положительное воздействие способности пробиотических бактерий выживать и размножаться в кишечнике животных (в присутствии высоких уровней соли желчных кислот), ингибировать патогенные бактерии (продуцирование бактериоцинов), и, кроме того, выделяют большие количества оказывающих положительное воздействие незаменимых аминокислот.

Следовательно, в первом аспекте настоящее изобретение относится к композиции палочковидных бактерий, включающей от 10⁵ до 10¹² КОЕ/г споровых клеток палочковидных бактерий, где композиция палочковидных бактерий характеризуется тем, что:

(i): споры палочковидных бактерий быстро прорастают и растут из спор в вегетативные клетки в присутствии среды с солями желчных кислот, включающей от 4 до 6 мМ солей желчных кислот, причем споры палочковидных бактерий достигают точки роста вегетативных клеток 0,4 OD₆₃₀ за менее чем 18-19 часов, соответственно, где точка роста вегетативных клеток является точкой на кривой роста, где показатель OD начинает повышаться (ввиду роста вегетативных клеток) непрерывно и достигает OD₆₃₀, равное 0,4;

(I): причем среда с солями желчных кислот является стандартной известной неселективной средой телячьего мясного бульона (VIB) из примера 1, в которую добавлена смесь солей желчных кислот, включающая конъюгированные соли желчной кислоты тауродеоксихолата и гликодеоксихолата и деконъюгированные соли желчной кислоты тауродеоксихолата в пропорциях 60% тауродеоксихолата, 30% гликодеоксихолата и 10% деоксихолата;

где OD анализ проводят, осуществляя следующие стадии:

(a): заполнение лунок пластины микротитратора 0,150 мл среды с солями желчных кислот с 10⁸ спор палочковидных бактерий на мл среды (то есть это время ноль);

(b): инкубирование пластины при температуре 37°C при атмосферном давлении и измерение показателей OD₆₃₀, используя спектрофотометр с перемешиванием перед каждым снятием данных для получения репрезентативной кривой роста во времени; и где

(ii) вегетативные клетки палочковидных бактерий продуцируют по меньшей мере одну незаменимую аминокислоту в количестве, большем, чем клетки контрольных палочковидных бактерий DSM 19467, причем количество продуцированной незаменимой аминокислоты измеряют при использовании стандартного ГХ-МС метода (газовой хроматографии-массовой спектрометрии) на основе анализа аминокислоты по примеру 2 через два дня роста при температуре 37°C в известной стандартной с минимальным содержанием солей ростовой среде по примеру 2.

Как указанно выше, клетки контрольных палочковидных бактерий DSM 19467 отбирают для быстрого прорастания и роста в присутствии соли желчной кислоты, используя GalliPro^® в качестве исходного штамма. DSM 19467 не является отобранным для повышенного продуцирования незаменимой аминокислоты. Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения считают, что продуцирование релевантного количества незаменимой аминокислоты DSM 19467 соответствует GalliPro^®.

Что касается точки (i), то точка роста вегетативных клеток GalliPro^® наступает по меньшей мере через 20 часов инкубации с солями желчной кислоты в пределах от 4 до 6 мМ, а для нового штамма DSM 19467, как описано в настоящем изобретении, через 14-15 часов инкубации с солями желчной кислоты в пределах от 4 до 6 мМ соответственно (см. Фиг. 2 и рабочий пример 3 настоящего описания).

Следует отметить, что авторы настоящего изобретения также протестировали коммерчески доступный продукт CALSPORIN® (Calpis Co., Ltd., Japan) для определения точки роста вегетативных клеток в условиях точки (i) первого аспекта. Как и GalliPro®, коммерческий продукт CALSPORIN® является композицией Bacillus subtilis, используемой в качестве пробиотической кормовой добавки. Точка роста вегетативных клеток при условиях точки (i) первого аспекта для CALSPORIN® составляет более 20 часов при инкубации с солями желчной кислоты в пределах от 4 до 6 мМ соответственно. Это значительно больше, чем 18-19 часов, требуемые в точке (i), и это показывает, что коммерчески доступные продукты до сих пор не отбирали для быстрого прорастания и роста. Используемый здесь термин «натуральные» клетки палочковидных бактерий относится к таковым, не подвергшимся какому-либо селективному давлению для достижения быстрых прорастания и роста. Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения считают, что «натуральные» клетки палочковидных бактерий не отвечают условиям точки (i) первого аспекта.

Оба, как анализ на устойчивость к желчи [точка (i)], так и анализ на незаменимую аминокислоту [точка (ii)], основаны на использовании известных коммерчески доступных стандартных элементов (таких как, например, стандартная среда, соли желчных кислот; стандартные измерения OD и стандартные тесты). Контрольные клетки палочковидных бактерий депонированы как DSM 19467 и, следовательно, общедоступны. Клетки Bacillus subtilis GalliPro^® депонированы как DSM 17231 (названный «GalliPro^®») и, следовательно, общедоступны.

Следовательно, основываясь на детальном описании анализа на устойчивость к желчи, см., например, пример 1, и анализа на незаменимую аминокислоту - пример 2, специалист в данной области техники способен рутинно повторить эти анализы для объективного определения, отвечают ли клетки интересующих специфических палочковидных бактерий условиям устойчивости к желчи [точка (i)] и условиям по незаменимой аминокислоте [точка (ii)] уровням первого аспекта настоящего изобретения.

Композиция новых палочковидных бактерий по настоящему изобретению может быть использована в качестве пробиотической кормовой добавки к кормовому продукту для животного. Дозировка и введение могут выбираться согласно предшествующему уровню техники, как, например, выбрано из предшествующего уровня техники для композиций палочковидных бактерий GalliPro^®.

Следовательно, во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу кормления животного, включающему введение композиции палочковидных бактерий по первому аспекту, и здесь описаны соответствующие варианты воплощения настоящего изобретения для животного совместно с другими ингредиентами кормового продукта для животного.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга и выделения новых клеток палочковидной бактерии, включающему следующие стадии:

(a): отбор и выделение из пула отдельных споровых клеток палочковидных бактерий новых споровых клеток палочковидных бактерий, способных прорастать и расти так быстро, чтобы достичь точки роста вегетативных клеток за менее чем 18-19 часов при условиях точки (i) первого аспекта;

(b): получение вегетативных клеток палочковидных бактерий из выделенных споровых клеток стадии (a) и мутирование новых отобранных и выделенных клеток с получением пула новых отдельных вегетативных клеток палочковидных бактерий;

(c): отбор и выделение из пула новых отдельных вегетативных клеток палочковидных бактерий стадии (b) новых вегетативных клеток палочковидных бактерий, способных продуцировать по меньшей мере одну незаменимую аминокислоту в количестве, большем, чем у контрольных клеток палочковидных бактерий DSM 19467 при условиях точки (ii) первого аспекта; и

(d): анализ высокой степени продуцирования вегетативных клеток палочковидных бактерий стадии (c) для подтверждения того, что сохраняется быстрое прорастание и рост, как на стадии (a), и выделение отобранных клеток палочковидных бактерий.

Для специалиста в области техники, к которой относится настоящее изобретение, очевидно, что поскольку авторы настоящего изобретения описали здесь релевантные тестовые анализы (в частности, анализ для тестирования быстрого прорастания и роста по примеру 1) плюс контрольный штамм DSM 19467, то для специалиста в области техники, к которой относится настоящее изобретение, является рутинной работа по отбору других новых клеток палочковидных бактерий, отвечающих условиям первого аспекта настоящего изобретения.

Как описано здесь, при использовании нового способа скрининга/отбора по настоящему изобретению авторы настоящего изобретения отобрали и выделили новые улучшенные клетки палочковидных бактерий.

Описанный ниже вариант воплощения настоящего изобретения приведен только для целей иллюстрации.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Все определения соответствующих терминов имеют общепринятое значение и толкование в области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Используемый здесь термин «клетки палочковидных бактерий» относится как к спорам палочковидных бактерий (бацилл), так и к вегетативным клеткам палочковидных бактерий.

Используемый здесь термин «споры палочковидных бактерий» относится к споровым клеткам, которые согласно предшествующему уровню техники могут характеризоваться как спящие, труднообрабатываемые, без репродуктивной структуры, продуцированные палочковидными бактериями. Первичной функцией спор, как правило, является гарантия выживания бактерий во время стресса, вызываемого окружающей средой. Следовательно, они устойчивы к ультрафиолету, гамма-излучению, дегидратации, лизоциму, температуре, истощению и химическим дезинфицирующим средствам. Споры, как правило, находятся в почве и в воде, где они могут выживать в течение длительного периода времени. Покрытие споры непроницаемо для большинства токсических молекул и также может содержать ферменты, способствующие прорастанию. Ядро имеет нормальные клеточные структуры, такие как ДНК и рибосомы, но метаболически не активно. Когда бактерия определяет, что условия среды становятся неблагоприятными, она может начать процесс споруляции, который занимает около восьми часов.

Используемый здесь термин «вегетативные клетки палочковидных бактерий» относится к функциональным вегетативным клеткам палочковидных бактерий, которые могут делиться с получением большего количества вегетативных клеток.

Используемый здесь термин «прорастание и рост» относится к прорастанию спор палочковидных бактерий и к росту вегетативных клеток палочковидных бактерий. Как известно специалисту в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение, реактивация спор происходит, когда условия благоприятны и включается прорастание и рост. Прорастание включается, спящие споры начинают метаболическую активность и, следовательно, прерывается спящий режим. Оно обычно характеризуется разрушением или абсорбцией покрытия спор, разбуханием спор, повышением метаболической активности и потерей устойчивости к стрессовым условиям окружающей среды. За прорастанием следует рост, и ядро споры производит новые химические компоненты, и отмирает старое покрытие спор для развития в функциональные вегетативные клетки палочковидных бактерий, которые могут делиться с продуцированием множества клеток. Кривые роста (OD по времени) клеток палочковидных бактерий демонстрируют различные фазы роста. Поскольку споры помещают в среду, богатую ингредиентами, то после временного снижения OD (фаза I) начинается прорастание, которое происходит благодаря высвобождению дипиколиновой кислоты и, следовательно, гидратации покрытия спор. Вторая фаза (фаза II = фаза роста) - это период с относительно незначительными изменениями OD до тех пор, пока споры развиваются в функциональные вегетативные клетки бактерий, которые могут делиться с продуцированием множества клеток и, следовательно, дают непрерывное повышение показателя OD. Точку, когда она начинает давать непрерывное повышение показателей OD, достигая OD 0,4, определяют как «точку роста вегетативных клеток».

Используемый здесь термин «оптическая плотность» относится к измерению коэффициента оптического поглощения при использовании спектрофотометра. Оптическая плотность (OD) представляет собой коэффициент поглощения оптически заданной длины волны λ на единицу расстояния. Если показатель OD, например, измерен при длине волны 630 нм, он может быть указан, как OD₆₃₀.

ЧЕРТЕЖИ

Фиг. 1: на этой Фигуре приведены стадии получения новых улучшенных штаммов. Рабочие примеры начинаются с DSM 17231 (GalliPro®), который классически мутируют и проводят скрининг/отбор на быстрое прорастание и рост в присутствии солей желчных кислот с получением нового отобранного штамма DSM 19467. DSM 19467 используют в качестве исходного штамма для классической мутации и отбора штаммов, продуцирующих высокие уровни незаменимой аминокислоты.

Фиг. 2A и 2B: на этих Фигурах ясно видно, что споры палочковидных бактерий DSM 19467 имеют улучшенное быстрое прорастание и рост по сравнению с DSM 17231 в присутствии от 4 до 6 мМ солей желчных кислот.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Композиция палочковидных бактерий

Используемый здесь термин «композиция палочковидных бактерий» следует понимать и толковать в значении, известном из предшествующего уровня техники. Следует понимать, что композиция палочковидных бактерий включает множество споровых клеток палочковидных бактерий с интересующими характеристиками.

Композиция палочковидных бактерий может включать различные типы клеток палочковидных бактерий (например, B. subtilis и Bacillus licheniformis). По существу композиция должна просто включать споровые клетки палочковидных бактерий по первому аспекту настоящего изобретения, где клетки палочковидных бактерий отвечают условиям первого аспекта.

Как известно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, коммерчески релевантные композиции споровых клеток палочковидных бактерий, как правило, получают культивированием. Полученные споровые клетки, как правило, концентрируют, сушат, смешивают с носителем и расфасовывают в подходящий контейнер.

Релевантное количество, например, в пределах от 10⁵ до 10¹² КОЕ/г клеток палочковидных бактерий композиции может присутствовать в коммерчески релевантной форме, известной специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Следовательно, в одном варианте воплощения настоящего изобретения присутствует от 10⁵ до 10¹² КОЕ/г споровых клеток палочковидных бактерий композиции в форме высушенных (например, распылительная сушка) клеток или замороженных споровых клеток.

В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения композиция палочковидных бактерий включает от 10⁶ до 10¹² КОЕ/г споровых клеток палочковидных бактерий, более предпочтительно в пределах от 10⁷ до 10¹² КОЕ/г споровых клеток палочковидных бактерий.

Используемый здесь термин «КОЕ/г» относится к массе в граммах композиции как таковой, включая подходящие релевантные добавки, присутствующие в композиции. Он не включает массу подходящего контейнера, используемого для расфасовки композиции палочковидных бактерий.

Вариант воплощения настоящего изобретения относится к таковому, где композиция палочковидных бактерий расфасована в подходящий контейнер.

Как известно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, коммерчески релевантная бактериальная композиция, как правило, также включает другие релевантные добавки, такие как, например, один носитель/ингредиент из группы, принадлежащей к сыворотке, пермеату сыворотки, карбонату кальция/кальциевому известняку и агентам против слеживания, таким как силикаты алюминия и кизельгур (диатомовая земля). Помимо этого в настоящем изобретении релевантные клетки палочковидных бактерий композиции также могут включать другие релевантные интересующие микроорганизмы, такие как, например, интересующие молочнокислые бактерии.

Клетки палочковидных бактерий

Клетки палочковидных бактерий могут представлять собой любые интересующие релевантные клетки палочковидных бактерий.

В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения клетки палочковидных бактерий представляют по меньшей мере клетки палочковидных бактерий, отобранных из видов палочковидных бактерий, выбранных из группы, состоящей из:

Bacillus subtilis, Bacillus uniflagellates, Bacillus lateropsorus, Bacillus laterosporus BOD, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, и Bacillus sterothermophilus, Bacillus coagulans, Bacillus thermophilus, Bacillus mycoides, Bacillus cereus, и Bacillus circulans.

В более предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения клетки палочковидных бактерий представляют клетки B. subtilis или Bacillus licheniformis.

Наиболее предпочтительно, когда клетки палочковидных бактерий представляют клетки B. subtilis.

Анализ для отбора на быстрое прорастание и рост в присутствии солей желчных кислот

Как указанно, анализ на устойчивость к желчи точки (i) по первому аспекту основывается на использовании известных коммерчески доступных стандартных элементов (таких как, например, стандартная среда, соли желчных кислот, измерения стандарта OD).

Следовательно, основываясь на детальном описании анализа в описании настоящего изобретения (см., например, пример 1), специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение, способен рутинно повторить этот анализ для объективного подтверждения, отвечают ли интересующие споровые клетки специфических палочковидных бактерий условиям быстрого прорастания и роста из споровых в вегетативные клети, как указано в точке (i).

В точке (i) это объясняется тем, что точка роста вегетативных клеток является точкой на кривой роста, начинающейся с 10⁸ спор/мл соответствующих OD в пределах около 0,2-0,3 до того момента времени, когда показатель OD возрастает (ввиду роста вегетативных клеток) непрерывно до достижения OD 0,4. Это находится в соответствии с тем, как специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение, понимает такую точку роста вегетативных клеток, основанную на кривой роста, специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение, рутинно определяет это с ограниченной варьируемостью около ±30 минут, как указанно здесь. Рабочий пример 1 по настоящему изобретению обеспечивает детальное описание анализа на устойчивость к желчи, подходящего для отбора на быстрое прорастание и рост в присутствии солей желчных кислот. Детально описанные условия Примера 1 по настоящему изобретению являются предпочтительным анализом для определения, отвечают ли интересующие споровые клетки палочковидных бактерий условиям точки (i) первого аспекта.

Используемый здесь термин «соли желчных кислот» относится к солям желчных кислот. Желчные кислоты являются стероидными кислотами, которые встречаются преимущественно в желчи млекопитающих. Они продуцируются в печени окислением холестерина, хранятся в желчном пузыре и выделяются в кишечник в форме солей. Они действуют как поверхностно-активные вещества, эмульгирующие липиды и помогающие их абсорбции и перевариванию. Соли желчных солей, используемые в примере 1, получают, имитируя физиологические концентрации и композиции солей желчных кислот у свиней. Как известно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, композиции солей желчных кислот у свиней могут рассматриваться как относительно «жесткие» условия по сравнению с композициями солей желчных кислот у птиц.

Используемый здесь термин «среда с солями желчных кислот» относится к среде, включающей релевантные ингредиенты роста палочковидных бактерий, такие как релевантные нутриенты и соли желчных кислот.

Точка роста вегетативных клеток в анализе на устойчивость к солям желчных кислот - точка (i) первого аспекта

Как указано выше, в отношении точки (i) первого аспекта споровые клетки палочковидных бактерий по настоящему изобретению имеют прорастание из спор в вегетативные клетки и рост, который происходит так быстро, что они достигают точки роста вегетативных клеток 0,4 OD за менее чем 18-19 часов при 4-6 мл солей желчных кислот соответственно. Как указано выше, новый штамм DSM 19467 достигает точки роста вегетативных клеток через 14-15 часов инкубации с солями желчных кислот в пределах от 4 до 6 мМ соответственно.

Следовательно, в предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения споры палочковидных бактерий достигают точки роста вегетативных клеток через 17-18 часов инкубации с солями желчных кислот в пределах от 4 до 6 мМ при условиях точки (i) первого аспекта, более предпочтительно споры палочковидных бактерий достигают точки роста вегетативных клеток через 15-16 часов инкубации с солями желчных кислот в пределах от 4 до 6 мМ при условиях точки (i) первого аспекта.

Как указано и схематически показано выше на Фиг. 1, новый штамм DSM 19467 по настоящему изобретению отбирают при использовании коммерчески доступного GalliPro^® в качестве исходного штамма для мутагенеза и отбора для быстрого роста в присутствии солей желчных кислот, как указано выше.

GalliPro^® является композицией, включающей клетки Bacillus subtilis и Bacillus subtilis, депонированных как DSM 17231. Следовательно, GalliPro® может быть использован в настоящем изобретении в качестве контрольного штамма. Как указано выше, точка начала роста вегетативных клеток GalliPro® через 20 часов инкубации с солями желчных кислот в пределах от 4 до 6 мМ при условиях точки (i) первого аспекта. Следовательно, в одном варианте воплощения настоящего изобретения споры палочковидных бактерий достигают точки роста вегетативных клеток по меньшей мере на 3 часа раньше, чем споровые клетки контрольной Bacillus subtilis, депонированной как DSM 17231 («GalliPro^®») при условиях точки (i) первого аспекта, более предпочтительно споры палочковидных бактерий достигают точки роста вегетативных клеток по меньшей мере на 4 часа раньше, чем споровые клетки контрольной Bacillus subtilis, депонированной как DSM 17231 («GalliPro^®»), при условиях точки (i) первого аспекта, и наиболее предпочтительно споры палочковидных бактерий достигают точки начала роста вегетативных клеток по меньшей мере на 5 часов раньше, чем споровые клетки контрольной Bacillus subtilis, депонированной как DSM 17231 («GalliPro^®»), при условиях точки (i) первого аспекта.

Незаменимые аминокислоты

Как известно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, незаменимая аминокислота может представлять незаменимую аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из фенилаланина, валина, треонина, триптофана, изолейцина, метионина, лейцина, лизина, цистеина, тирозина, гистидина и аргинина.

В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения незаменимая аминокислота представляет по меньшей мере одну незаменимую аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из фенилаланина, валина, треонина, триптофана, изолейцина, метионина, лейцина и лизина.

В более предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения незаменимая аминокислота представляет по меньшей мере одну незаменимую аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из валина, изолейцина и лейцина.

Наиболее релевантной незаменимой аминокислотой является лейцин.

Специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, следует понимать, что вегетативные клетки палочковидных бактерий могут продуцировать более высокие количества более чем одной незаменимой аминокислоты, такое как, например, более высокое количество двух, или трех, или более различных незаменимых аминокислот.

Анализ на аминокислоту

Как указанно выше, анализ на аминокислоту точки (ii) по первому аспекту основывается на использовании стандартных, известных коммерчески доступных элементов (таких как, например, стандартная среда, стандартный тест). Следовательно, основываясь на детально описанном анализе (см., например, пример 2 настоящего описания), специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение, способен рутинно повторить этот анализ для объективного подтверждения, отвечают ли вегетативные клетки специфических интересующих пало