Генетический тест на накопление меди в печени собак и корм для домашних животных с низким содержанием меди

Генетический тест на накопление меди в печени собак и корм для домашних животных с низким содержанием меди

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу определения вероятности защищенности собаки от накопления меди в печени и от опосредованного медью заболевания печени. Изобретение также относится к корму для собак, предназначенному для предотвращения накопления меди в печени и опосредованного медью заболевания печени у собаки, а также к способу получения данного корма.

Уровень техники

Хотя заболевания печени редко встречаются у собак, одной из наиболее распространенных форм таких заболеваний является хронический гепатит (CH). CH является гистологическим диагнозом, который характеризуется наличием фиброза, воспаления и апоптоза и некроза клеток печени. На конечной стадии заболевания может развиваться цирроз. Одной из причин CH является накопление меди в печени. Накопление меди в печени может возникать в результате повышенного потребления меди, первичного метаболического дефекта в метаболизме меди в печени или изменения в биллиарной экскреции меди. В последнем случае токсичность меди является вторичной по отношению к воспалению печени, фиброзу печени и холестазу, хотя не ясно в какой степени она встречается у собак. При вторичной болезни накопления меди данное накопление в основном ограничено перипортальной паренхимой и концентрация меди в печени ниже, чем в случае наследственных болезней накопления. Хотя природа инициирующего фактора (факторов) и сенсибилизирующего антигена неизвестна, иммунологические нарушения и морфологические признаки, характерные для первичного биллиарного цирроза, наблюдаются одновременно, свидетельствуя о наличии механизма, опосредованного иммунной системой.

Тонкий кишечник считается основным участком абсорбции пищевой меди у млекопитающих. Перенос из просвета кишечника в слизистую оболочку кишки представляет собой опосредованный носителем процесс, включающий компонент насыщаемого транспорта. После поступления в клетки слизистой оболочки примерно 80% абсорбированной меди находится в цитозоле, в основном, в состоянии, связанном с металлотионеинами (MT). Металлотионеины представляют собой низкомолекулярные индуцируемые белки, которые выполняют разные функции, включающие гомеостаз, накопление, транспорт и детоксикацию металлов. После прохождения через энтероциты медь поступает в кровообращение в системе воротной вены, где она связывается с пептидами и аминокислотами белков-носителей и транспортируется в печень и, в меньших количествах, в почки. У большинства млекопитающих медь легко выводится, причем основным путем экскреции меди является желчь.

Генетическая причина накопления меди в печени неизвестна. Ее трудно определить, поскольку медь участвует во множестве разных биологических путей, каждый из которых является очень сложным и кодируется большим числом генов. Собак с избыточным накоплением меди в печени обычно лечат D-пеницилламином, эффективным хелатором меди. Однако, в конечном счете, наиболее успешным способом лечения собак с CH является трансплантация печени. В WO 2009/044152 A2 раскрыт способ определения у собаки предрасположенности к накоплению меди в печени, включающий определение присутствия или отсутствия (a) полиморфизма в гене собаки GOLGA5, ATP7a или UBL5, который указывает на предрасположенность к накоплению меди, и/или (b) полиморфизма, находящегося в неравновесном сцеплении с указанным полиморфизмом (a). В международной заявке PCT/GB09/02355 (еще не опубликована) раскрыты другие полиморфизмы, которые можно использовать для определения предрасположенности собаки к накоплению меди в печени.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения обнаружили кодирующую мутацию в гене собаки ATP7A, которая связана с низкими уровнями меди в печени собак и, следовательно, указывает на наличие защиты от накопления меди в печени. Мутация представляет собой полиморфизм одиночных нуклеотидов (SNP), который вызывает изменение аминокислотного состава белка. В описанном в данном описании исследовании показано, что полиморфизм оказывает функциональное влияние на транспорт меди в клетках. Открытие данного полиморфизма в гене ATP7A является основой для тестирования с целью предсказания защищенности собаки от накопления меди в печени путем выявления данного полиморфизма и/или одного или более полиморфизмов, находящихся в неравновесном сцеплении с данным полиморфизмом.

Авторы настоящего изобретения также недавно обнаружили, что полиморфизмы в собачьих генах GOLGA5, ATP7A и UBL5 или в их областях, связаны с высокими уровнями меди в печени собак и, следовательно, указывают на предрасположенность к накоплению меди в печени (WO 2009/044152 A2 и неопубликованная международная заявка PCT/GB 09/02355). Следовательно, генетический тест, который объединяет результаты детекции одного или более полиморфизмов, свидетельствующих о наличии защиты от накопления меди в печени, и результаты детекции одного или более полиморфизмов, указывающих на предрасположенность к накоплению меди в печени собак, является особенно информативным в отношении вероятности того, что у собаки существует риск накопления меди в печени.

Накопление меди в печени собаки может приводить к развитию одного или более заболеваний или состояний печени, связанных с высоким уровнем меди в печени. Например, высокий уровень меди в печени может вызывать хронический гепатит, цирроз печени и, в конечном счете, печеночную недостаточность. Таким образом, изобретение позволяет идентифицировать собак, которые не защищены или имеют риск развития таких заболеваний или состояний печени, которые связаны с высоким уровнем меди. После идентификации собаки, которая не содержит мутацию, указывающую на наличие защиты от накопления меди в печени, можно определить для такой собаки подходящие профилактические меры, позволяющие поддерживать низкий или нормальный уровень меди в печени, которые включают, например, введение корма настоящего изобретения. Кроме того, собаки, идентифицированные как содержащие мутации, связанные с защитой от накопления меди в печени, идеально подходят для применения в программе улучшения породы, целью которой является выведение собак с пониженным риском развития заболеваний печени или других состояний, связанных с высоким уровнем меди.

Таким образом, изобретение предоставляет способ тестирования собаки с целью определения вероятности наличия у собаки защиты от накопления меди в печени, включающий детекцию в образце присутствия или отсутствия в геноме собаки одного или более полиморфизмов, выбранных из (a) SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO:142), и (b) одного или более полиморфизмов, находящихся в неравновесном сцеплении с указанным полиморфизмом (a).

Изобретение также предоставляет:

базу данных, содержащую информацию, относящуюся к SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO:142) и/или одному или более полиморфизмам, которые находятся с ним в неравновесном сцеплении, и к их связи с предрасположенностью собаки к накоплению меди в печени;

способ определения вероятности наличия у собаки защиты от накопления меди в печени включающий:

(a) ввод в компьютерную систему данных, касающихся присутствия или отсутствия полиморфизма в геноме собаки, как определено в данном описании;

(b) сравнение данных с компьютерной базой данных, содержащей информацию, относящуюся к указанным полиморфизмам и их связи с защищенностью собаки от накопления меди в печени или с предрасположенностью собаки к накоплению меди в печени; и

(c) определение вероятности наличия у собаки защиты от накопления меди в печени на основе сравнения;

компьютерную программу, содержащую средства программного кода, которая при выполнении на компьютерной системе инструктирует ее, как осуществлять способ настоящего изобретения;

компьютерную среду для хранения, содержащую компьютерную программу настоящего изобретения и базу данных настоящего изобретения;

компьютерную систему, приспособленную для проведения способа настоящего изобретения, которая включает:

(a) средства для получения данных, касающихся присутствия или отсутствия в геноме собаки полиморфизма, как определено в данном описании;

(b) базу данных, содержащую информацию, относящуюся к указанным полиморфизмам и/или одному или более полиморфизмам, которые находятся с ними в неравновесном сцеплении, и к их связи с наличием у собаки защиты от накопления меди в печени или с предрасположенностью собаки к накоплению меди в печени;

(c) модуль для сравнения данных с базой данных; и средства для определения вероятности наличия у собаки защиты от накопления меди в печени на основе указанного сравнения;

способ определения вероятности наличия у собаки защиты от накопления меди в печени, включающий детекцию присутствия или отсутствия в геноме собаки одного или более полиморфизмов, выбранных из (a) SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO:142), и (b) одного или более полиморфизмов, находящихся в неравновесном сцеплении с полиморфизмом (a);

применение определенного в данном описании полиморфизма для определения защищенности собаки от накопления меди в печени; и

способ отбора собаки для получения потомства, с большой вероятностью обладающего защитой от накопления меди в печени, который включает:

определение присутствия в геноме первой собаки-кандидата одного или более полиморфизмов, указывающих на наличие защиты от накопления меди в печени в соответствии с настоящим изобретением; и, как следствие, определение пригодности первой собаки-кандидата для получения потомства, с большой вероятностью обладающего защитой от накопления меди в печени;

необязательно определение присутствия в геноме второй собаки, имеющей пол, противоположный полу первой собаки, одного или более полиморфизмов, указывающих на наличие защиты от накопления меди в печени в соответствии с настоящим изобретением; и

необязательно спаривание первой собаки со второй собакой с целью получения потомства, с большой вероятностью обладающего защитой от накопления меди в печени.

Дополнительно и неожиданно, авторы настоящего изобретения обнаружили корм, который более эффективно уменьшает концентрацию меди в печени лабрадоров ретриверов, чем лекарственное средство пеницилламин. Следовательно, такой корм можно использовать для предотвращения накопления меди в печени собак породы лабрадор ретривер и для предотвращения заболевания или состояния, связанного с высоким уровнем меди в печени, такого как хронический гепатит, цирроз и печеночная недостаточность.

Соответственно, настоящее изобретение также предоставляет корм, содержащий медь в концентрации от 4,5 до 12 мг/кг сухого вещества, обеспечивающий профилактику заболевания, связанного с накоплением меди в печени собаки, имеющей генетическую наследственность породы лабрадор ретривер, предпочтительно, если с помощью способа настоящего изобретения установлено, что существует вероятность наличия у собаки защиты от накопления меди в печени.

Настоящее изобретение также предоставляет:

способ предотвращения заболевания, связанного с накоплением меди в печени собаки, имеющей генетическую наследственность породы лабрадор ретривер, предпочтительно, если с помощью способа настоящего изобретения установлено, что существует вероятность наличия у собаки защиты от накопления меди в печени, где способ включает кормление собаки кормом настоящего изобретения;

применение меди в производстве корма для собаки, имеющей генетическую наследственность породы лабрадор ретривер, предпочтительно, если с помощью способа настоящего изобретения установлено, что существует вероятность наличия у собаки защиты от накопления меди в печени, где корм содержит медь в концентрации от 4,5 до 12 мг/кг сухого вещества и предназначается для предотвращения заболевания, связанного с накоплением меди в печени указанной собаки;

упаковку, содержащую корм с концентрацией меди от 4,5 до 12 мг/кг сухого вещества и цинковую добавку, обеспечивающую концентрацию по меньшей мере 120 мг/кг сухого вещества, предназначенные для одновременного, раздельного или последовательного применения с целью предотвращения заболевания, связанного с накоплением меди в печени собаки, имеющей генетическую наследственность породы лабрадор ретривер, предпочтительно, если с помощью способа настоящего изобретения установлено, что существует вероятность наличия у собаки защиты от накопления меди в печени; и

маркированный корм настоящего изобретения или маркированную упаковку настоящего изобретения.

Краткое описание фигур

Фиг.1 иллюстрирует прогрессирование накопления меди в печени в отсутствии лечения. На фигуре показана концентрация меди в печени (мг/кг сухой массы) 11 лабрадоров ретриверов, полученная в двух исследованиях, проведенных с интервалом 8,7 месяцев (диапазон 6-15 месяцев), перед лечением. На протяжении этого периода все животные получали обычную поддерживающую диету, в которой, по утверждению производителей, концентрация пищевой меди составляет 12-25 мг/кг сухого вещества, и концентрация цинка составляет 80-270 мг/кг сухого вещества. Ромбовидные символы обозначают отклонения.

На фиг.2 показана концентрация меди в печени (мг/кг сухой массы) 24 лабрадоров ретриверов в начале исследования и в процессе получения диеты, определенной с помощью 2 контрольных анализов. Собак подразделяли на две группы следующим образом: группа 1 = диета+таблетки глюконата цинка, группа 2 = диета+плацебо. Нумерацию по оси x осуществляют следующим образом: 1+2 = до обработки, 3+4 = контрольная проверка 1 (первый контрольный анализ через 8 месяцев (в интервале 5-13 месяцев)), 5+6 - контрольная проверка 2 (второй контрольный анализ через 16 месяцев (в интервале 12-25 месяцев)). Количество тестируемых собак было следующим: 1: N=12 собак в группе 1, 2: N=12 собак в группе 2, 3: N=9 собак в группе 1, 4: N=12 собак в группе 2, 5: N=6 собак в группе 1, 6: N=10 собак в группе 2. Ромбовидные символы обозначают отклонения. Пунктирная линия обозначает нормальный уровень меди в печени взрослых собак.

Фиг.3 иллюстрирует эффективность диеты настоящего изобретения в отношении влияния на концентрацию меди в печени (мг/кг сухой массы) 18 лабрадоров ретриверов по сравнению с эффективностью одного пеницилламина. Обозначения, используемые на оси x: 1 = до получения пеницилламина, 2 = после получения пеницилламина/до получения корма, 3 = после получения корма. Прогрессирование вдоль оси x от 1 до 2 демонстрирует эффект пеницилламина, тогда как прогрессирование от 2 до 3 демонстрирует эффект корма. Пунктирная линия обозначает нормальный уровень меди в печени взрослых собак.

Фиг.4 схематически иллюстрирует варианты осуществления функциональных компонентов, организованных так, чтобы обеспечить осуществление настоящего изобретения.

На фиг.5 изображены средние уровни меди у лабрадоров ретриверов (данные, приведенные в таблице VII) в зависимости от пола и генотипа ATP7A. На оси y откладывают количество меди в пересчете на сухую массу печени (мг/кг). На оси x представлен генотип ATP7a: слева направо первые три позиции обозначают самок собак, участвующих в исследовании, и последние две обозначают самцов собак, участвующих в исследовании. Планки погрешностей соответствуют стандартной ошибке.

На фиг.6 приведена коробчатая диаграмма гистологических оценок содержания меди у лабрадоров ретриверов в зависимости от пола и генотипа ATP7a (данные, приведенные в таблице VII). На оси y откладывают значения гистологических оценок содержания меди. На оси x представлен генотип ATP7a: слева направо первые три позиции обозначают самок собак, участвующих в исследовании, и последние две обозначают самцов собак, участвующих в исследовании. p-Значение для критерия Крускала-Уоллиса составляет 0,000396.

На фиг.7A и 7B показаны изотопные измерения меди в первичных фибробластах собаки. Измерения изотопа меди (⁶⁴Cu) проводят в клетках ATP7A^C/C, ATP7A^C/T и ATP7A^T/T после (A) 24 ч или 48 ч инкубации в присутствии 10 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ ⁶⁴Cu, или (B) 24 ч инкубации с последующим экстенсивным промыванием и инкубацией в среде, не содержащей изотоп меди, в течение 2 ч. Гамма-счетчики корректируют по условиям культивирования клеток посредством анализа белка и анализа MTS. Точки на графике, представляющие результаты, полученные после 24 ч инкубации, обозначают среднее значение +/-SEM от двух независимых экспериментов, проводимых с двойными повторами, выраженное в виде числа импульсов в минуту (cpm) по отношению к содержанию общего белка в клетке. Другие точки на графике обозначают среднее значение +/-SEM от одного эксперимента с двойными повторами.

На фиг.7C и 7D показаны изотопные измерения меди в первичных фибробластах собаки. Измерения изотопа меди (⁶⁴Cu) проводят в первичных фибробластах, полученных от пациентов с болезнью Менкеса или от пациентов, у которых отсутствует болезнь Менкеса (контроль), после (C) 24 ч или 48 ч инкубации в присутствии 10 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ ⁶⁴Cu, или (D) 24 ч инкубации с последующим экстенсивным промыванием и инкубацией в среде, не содержащей изотоп меди, в течение 2 ч. Гамма-счетчики корректируют по условиям культивирования клеток посредством анализа белка. Точки на графике обозначают такие же значения, как в пунктах (A) и (B).

На фиг.8 показаны уровни экспрессии гена ATP7A в первичных фибробластах собаки. (A) Клетки ATP7A^C/C, ATP7A^C/T и ATP7A^T/T оставляют необработанными (верхний график) или инкубируют в присутствии 100 мкМ меди в течение 24 ч (нижний график), после чего проводят анализ методом количественной ПЦР 3'-области (ATP7Aiii), 5'-области (ATP7Aii) или области, содержащей мутацию (ATP7Ai). Точки на графике обозначают среднее значение +/-SD результатов двух независимых экспериментов, проводимых с тройными повторами лунок. (B) Анализ экспрессии ATP7A методом вестерн-блоттинга. Клетки оставляют необработанными (-), инкубируют со 100 мкМ BCS или со 100 мкМ меди в течение 24 ч. Образцы лизируют, белки разделяют методом SDS-PAGE в 12% геле и подвергают иммуноблоттингу с использованием куриных антител против ATP7A (разведение 1:2000) в течение 1 ч. Затем мембраны инкубируют с козлиным антителом против куриных Ig, конъюгированным с HRP (разведение 1:10000), в течение еще 1 ч и затем для развития окрашивания добавляют реагенты для детекции ECL^TM, используемые в вестерн-блоттинге. Мембраны соскребают и подвергают повторному зондированию с использованием β-тубулина (разведение 1:20000), чтобы подтвердить равную нагрузку. Стрелки указывают на предполагаемый полноразмерный белок.

На фиг.9 показаны уровни экспрессии гена металлотионеина в первичных фибробластах собаки. Клетки ATP7A^C/C, ATP7A^C/T и ATP7A^T/T инкубируют в присутствии 1, 10 или 100 мкМ меди или оставляют необработанными (UT) в течение 24 часов и затем методом количественной ПЦР анализируют ген металлотионеина. Фиг.9(A) демонстрирует степень изменения по сравнению с UT ATP7A^C/С с доверительным интервалом (CI) 95%, (B) демонстрирует степень изменения по сравнению с экспрессией UT ATP7A^{генотип} с CI 95%, и (C) демонстрирует log10 уровня экспрессии с доверительным интервалом (CI) 95%. В панели (C) верхняя линия на графике соответствует генотипу ATP7A^T/T, средняя линия соответствует генотипу ATP7A^C/T, и нижняя линия соответствует генотипу ATP7A^C/C.

На фиг.10 показаны уровни экспрессии гена металлотионеина в тканях кишечника и печени собаки. Ткани (A) печени и (B) тонкого кишечника выделяли из собак, экспрессирующих ATP7A^C/C, ATP7A^C/T и ATP7A^T/T, и затем методом количественной ПЦР анализировали ген металлотионеина. Результаты изображены в виде среднего log10 уровня экспрессии и 95% CI от 5 независимых экспериментов (правые панели) и степени изменения с CI 95% по сравнению с ATP7A^C/C.

На фиг.11 приведена характеристика опосредованного медью транспорта белка ATP7A. Клетки ATP7A^C/C (левая панель) и ATP7A^T/T (правая панель) выращивали на предметных стеклах в присутствии 100 мкМ BCS в течение 18 ч, затем промывали и инкубировали с 100 мкМ медью в течение 1, 2 или 3 ч в среде для культивирования. Клетки фиксировали и окрашивали антителом против ATP7A (первая колонка в каждой панели) и антителом против 58K (вторая колонка в каждой панели), обрабатывали для проведения непрямой микроскопии с тройной меткой и затем визуализировали методом эпифлуоресцентной микроскопии. Изображения ATP7A и 58K объединяют, чтобы выявить перекрывающиеся участки (третья колонка в каждой панели).

Краткое описание последовательностей

SEQ ID NO:1-143 показывают полинуклеотидные последовательности, охватывающие SNP настоящего изобретения.

SEQ ID NO:144-159 представляют собой последовательности праймеров.

Подробное описание настоящего изобретения

Определение защиты от накопления или предрасположенности к накоплению меди в печени

Накопление меди в печени приводит к заболеванию печени у собак разных пород, таких как лабрадор ретривер, доберман-пинчер, немецкая овчарка, кейсхонд, коккер-спаниель, вест-хайленд-уайт терьер, бедлингтон-терьер и скайтерьер. Концентрация меди в печени нормальных собак любой породы составляет от 200 до 400 мг/кг в расчете на сухую массу, хотя у новорожденных концентрация меди в печени обычно выше. Количество меди в печени собаки можно измерить путем биопсии.

Собака, защищенная от накопления меди в печени, имеет низкий риск или низкую вероятность накопления меди в печени, и концентрация меди в ее печени реже достигает уровня, превышающего 400 мг/кг в расчете на сухую массу. Концентрация меди в печени собаки, защищенной от накопления меди в печени, составляет менее 600 мг/кг, например, менее 500 мг/кг, менее 400 мг/кг или менее 300 мг/кг. Определение вероятности наличия у собаки защиты от накопления меди в печени в соответствии с настоящим изобретением включает определение вероятности накопления меди в печени собаки на уровне менее 600 мг/кг, например, менее 500 мг/кг, менее 400 мг/кг или менее 300 мг/кг.

Собака, предрасположенная к накоплению меди в печени, имеет тенденцию к накоплению меди в печени с достижением концентрации меди в печени выше 400 мг/кг в расчете на сухую массу. Определение риска или вероятности предрасположенности собаки к накоплению меди в печени включает определение риска или вероятности того, что медь накапливается в печени собаки до уровня, превышающего 400 мг/кг, например, превышающего 600 мг/кг, превышающего 800 мг/кг, превышающего 1000 мг/кг, превышающего 1500 мг/кг, превышающего 2000 мг/кг, превышающего 5000 мг/кг или превышающего 10000 мг/кг.

Накопление меди в печени можно оценить с помощью гистохимического анализа. Например, полуколичественное определение концентрации меди можно осуществить методом гистохимии по описанному ранее способу (Van den Ingh T.S.G.A.M., R.J., Cupery R. (1988) Vet Q 10: 84-89), используя окрашивание рубеановой кислотой для анализа распределения меди. Концентрацию можно оценить по шкале от 0 до 5 следующим образом: 0 = медь отсутствует, 1 = отдельные клетки печени и/или ретикулогистиоцитарные (RHS) клетки содержат несколько положительных по меди гранул, 2 = небольшие группы клеток печени и/или клеток RHS содержат положительные по меди гранулы в количестве от низкого до среднего, 3 = более крупные группы или кластеры клеток печени и/или клеток RHS содержат умеренные количества положительных по меди гранул, 4 = большие кластеры клеток печени и/или клеток RHS содержат много положительных по меди гранул, 5 = диффузное состояние клеток печени и/или клеток RHS с большим числом положительных по меди гранул. В соответствии с данной системой оценка содержания меди выше 2 соответствует аномальному состоянию.

Следовательно, определение вероятности наличия у собаки защиты от накопления меди в печени в соответствии с настоящим изобретением включает определение вероятности того, что собака получит оценку менее или равную 3, например, менее или равную 2,5, 2, 1,5, или менее или равную 1, по системе оценок, описанной в Van den Ingh et al. Определение риска или вероятности предрасположенности собаки к накоплению меди в печени может включать определение риска или вероятности того, что собака получит оценку более или равную 2, например, более или равную 2,5, 3, 3,5, или более или равную 4, по системе оценок, описанной в Van den Ingh et al.

Вероятность защиты или риск предрасположенности можно выразить, например, как фактор, процент или вероятность риска. Можно определить, накапливает ли собака медь на указанных выше уровнях. Например, способ определения вероятности защиты от накопления меди в печени может включать определение, накапливает ли собака медь на уровне, превышающем 400 мг/кг.

Накопление меди в печени на уровне, превышающем 400 мг/кг, связано с заболеванием печени и, в конечном счете, может привести к печеночной недостаточности. Следовательно, идентификация в геноме собаки одного или более полиморфизмов, указывающих на защиту от накопления меди в печени, свидетельствует о пониженной вероятности развития у собаки заболевания или состояния, обусловленного накоплением меди в печени, такого как хронический гепатит, цирроз и печеночная недостаточность. И наоборот, идентификация в геноме собаки одного или более полиморфизмов, указывающих на наличие предрасположенности к накоплению меди в печени, свидетельствует о предрасположенности собаки к такому заболеванию или состоянию. Таким образом, изобретение обеспечивает способ тестирования собаки на предрасположенность к заболеванию, связанному с накоплением меди в печени, такому как хронический гепатит, цирроз и печеночная недостаточность, или на вероятность защиты от такого заболевания.

Полиморфизмы и определение предрасположенности к накоплению меди или защиты от накопления меди

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили полиморфизм, оказывающий влияние на аминокислотную последовательность белка ATP7A, который свидетельствует о наличии защиты от накопления меди в печени, в отличие от полиморфизма, свидетельствующего о предрасположенности к накоплению меди в печени (примеры 2-5). Указанный полиморфизм изменяет последовательность белка, кодируемого геном ATP7A, по аминокислотному положению 328, приводя к замене треонина на изолейцин. Эксперименты in vitro демонстрируют, что данная мутация оказывает большое влияние на функционирование белка (пример 5). Результаты экспериментов показывают, что степень накопления меди выше в клетках, экспрессирующих мутантную форму белка; накопление выше при воздействии меди, и высвобождение происходит медленнее после воздействия меди. Кроме того, в ответ на воздействие меди в клетках, несущих мутацию, изменяется внутриклеточный транспорт ATP7A. В клетках, несущих мутацию, также наблюдается повышенная экспрессия белка, осуществляющего транспортировку меди. Клетки, несущие две формы, имеют одинаковые уровни экспрессии ATP7A. Следовательно, кодирующая мутация в ATP7A оказывает большое влияние на функционирование белка.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу определения в геноме собаки одного или более полиморфизмов, указывающих на наличие защиты от накопления меди в печени. В частности, настоящее изобретение обеспечивает способ определения вероятности защищенности собаки от накопления меди в печени, включающий детекцию присутствия или отсутствия в геноме собаки одного или более полиморфизмов, выбранных из (a) SNP ATP7a_Reg3_F_6 (положение 102 SEQ ID NO:142), и (b) одного или более полиморфизмов, находящихся в неравновесном сцеплении с указанным полиморфизмом (a).

Фраза "детекция присутствия или отсутствия полиморфизма" обычно относится к определению присутствия полиморфизма в геноме собаки. Полиморфизмы включают полиморфизмы одиночных нуклеотидов (SNP), микросателлитные полиморфизмы, инсерционные полиморфизмы и делеционные полиморфизмы. Предпочтительно полиморфизм представляет собой SNP. Детекция присутствия или отсутствия SNP включает генотипирование SNP или типирование нуклеотида (нуклеотидов), присутствующего(их) в геноме собаки, по SNP. Как правило, определяют нуклеотиды, присутствующие в одинаковых положениях на двух гомологичных хромосомах. Следовательно, собака может быть идентифицирована как гомозиготная по первому аллелю, гетерозиготная или гомозиготная по второму аллелю, содержащему SNP.

Определение фенотипа субъекта, такого как предрасположенность субъекта к заболеванию или состоянию или защищенность субъекта от заболевания или состояния, не ограничивается детекцией полиморфизма, являющегося причиной заболевания или состояния. В процессе генетического картирования определяют связь генетических вариаций в ряде маркерных локусов, выделенных из образцов субъектов, с указанным фенотипом. При наличии такой связи между конкретным маркерным локусом и фенотипом можно предположить, что вариация по данному маркерному локусу влияет на представляющий интерес фенотип, или, что вариация по данному маркерному локусу находится в неравновесном сцеплении с локусом, реально связанным с фенотипом, который не подвергают генотипированию. В случае группы полиморфизмов, которые находятся в неравновесном сцеплении друг с другом, информация о существовании каждого из таких полиморфизмов у конкретного субъекта обычно бывает излишней. Таким образом, при определении содержания в геноме собаки одного или более полиморфизмов, указывающих на предрасположенность к накоплению меди в печени или к связанному с медью заболеванию печени, или на защиту от такого накопления или заболевания, можно детектировать только один полиморфизм из такой группы полиморфизмов.

В результате неравновесного сцепления полиморфизм, который не является функциональным полиморфизмом, отвечающим за предрасположенность/защиту, но находится в неравновесном сцеплении с функциональным полиморфизмом, может действовать в качестве маркера, указывающего на присутствие функционального полиморфизма. Полиморфизм, который находится в неравновесном сцеплении с полиморфизмом настоящего изобретения, указывает на предрасположенность к накоплению меди в печени или на защиту от накопления меди в печени.

Соответственно, любое из полиморфных положений, определенных в данном описании, можно идентифицировать непосредственно, то есть, путем определения нуклеотида, присутствующего в данном положении, или косвенно, например, путем определения нуклеотида, присутствующего в другом полиморфном положении, которое находится в неравновесном сцеплении с указанным полиморфным положением.

Неравновесное сцепление представляет собой неслучайное гаметическое распределение аллелей разных локусов в популяции. Полиморфизмы, которые имеют тенденцию наследоваться вместе, вместо отдельного наследования в результате случайного распределения генов, находятся в неравновесном сцеплении. Полиморфизмы подвергаются случайному распределению или наследуются независимо друг от друга, если частота одновременной встречаемости двух полиморфизмов является суммой отдельных частот встречаемости этих полиморфизмов. Например, если два полиморфизма в разных полиморфных участках присутствуют на 50% хромосом в популяции, считается, что они случайно распределяются, если два аллеля присутствуют вместе на 25% хромосом в популяции. Более высокий процент означает, что два аллеля связаны. Отсюда следует, что первый полиморфизм находится в неравновесном сцеплении со вторым полиморфизмом, если частота одновременной встречаемости двух полиморфизмов больше, чем сумма частот отдельной встречаемости этих полиморфизмов в популяции. Предпочтительно первый полиморфизм находится в неравновесном сцеплении со вторым полиморфизмом, если частота одновременной встречаемости полиморфизмов более чем на 10%, например, более чем на 30%, более чем на 50% или более чем на 70% превышает сумму частот отдельной встречаемости двух полиморфизмов.

Исследование показало, что неравновесное сцепление широко распространено среди собак (Extensive and breed-specific linkage disequilibrium in Canis familiaris, Sutter et al., Genome Research 14: 2388-2396). Полиморфизмы, которые находятся в неравновесном сцеплении, зачастую физически располагаются близко друг от друга и, поэтому, наследуются вместе. Полиморфизмы, которые находятся в неравновесном сцеплении с приведенными в данном описании полиморфизмами, располагаются с ними на одной хромосоме. Расстояние между полиморфизмами, которые присутствуют в неравновесном сцеплении у собак, обычно находится в пределах 5 миллионов оснований, предпочтительно, в пределах 2 миллионов оснований, в пределах 1 миллиона оснований, в пределах 700 т.п.о., в пределах 600 т.п.о., в пределах 500 т.п.о., в пределах 400 т.п.о., в пределах 200 т.п.о., в пределах 100 т.п.о., в пределах 50 т.п.о., в пределах 10 т.п.о., в пределах 5 т.п.о., в пределах 1 т.п.о., в пределах 500 п.о., в пределах 100 п.о., в пределах 50 п.о. или в пределах 10 п.о.

Рутинные методы идентификации полиморфизмов, находящихся в неравновесном сцеплении с одним из полиморфных положений, в соответствии с приведенным в данном описании определением, входят в компетенцию опытных специалистов. После выбора потенциального полиморфизма специалист в данной области может легко определить, действительно ли данный полиморфизм, и какая именно версия или аллель полиморфизма, находится в существенной связи с одним из определенных в данном описании полиморфизмов.

Более подробно, чтобы определить, действительно ли полиморфизм находится в неравновесном сцеплении с одним из определенных в данном описании полиморфизмов, специалисту нужно генотипировать кандидатный полиморфизм и один или более из определенных в данном описании полиморфизмов у группы собак. Размер группы должен быть достаточным для того, чтобы получить статистически значимый результат. Как правило, генотипированию подвергают образцы, полученные по меньшей мере от 100, предпочтительно, по меньшей мере от 150 или по меньшей мере от 200 разных собак. В состав группы могут входить собаки любой породы, однако обычно они имеют одинаковый или подобный генетический фон. После генотипирования полиморфизмов в группе собак можно измерить неравновесное сцепление одной или нескольких пар полиморфизмов с помощью одного из ряда легкодоступных пакетов программ обработки статистических данных. Примером бесплатного пакета программ является Haploview (Haploview: analysis and visualisation of LD and haplotype maps, Barrett et al., 2005, Bioinformatics, 21(2): 263-265), доступный для скачивания на сайте http://www.broadinstitute.org/haploview/haploview.

Показателем неравновесного сцепления является D'. Если значение D' находится в диапазоне от 0,5 до 1, оно свидетельствует о том, что пара полиморфизмов находится в неравновесном сцеплении, причем 1 соответствует наиболее значимому равновесному сцеплению. Таким образом, если обнаружено, что для кандидатного полиморфизма и конкретного полиморфизма, определенного в данном описании, D' составляет от 0,5 до 1, предпочтительно от 0,6 до 1, от 0,7 до 1, от 0,8 до 1, от 0,85 до 1, от 0,9 до 1, от 0,95 до 1, или наиболее предпочтительно D' равен 1, можно сказать, что кандидатный полиморфизм предвещает определенный в данном описании полиморфизм и, следовательно, указывает на предрасположенность к накоплению меди в печени или на наличие защиты от накопления меди в печени. В предпочтительном способе настоящего изобретения полиморфизм, который находится в неравновесном сцеплении с определенным в данном описании полиморфизмом, находится в пределах 680 т.п.о. и располагается на той же хромосоме, что и определенный в данном описании полиморфизм, и рассчитанный показатель неравновесного сцепления для пары полиморфизмов, D', больше или равен 0,9.

Другой мерой неравновесного сцепления является R в квадрате, где R представляет собой коэффициент корреляции. R в квадрате, который также известен как "коэффициент смешанной корреляции", представляет собой долю вариаций в генотипах первого полиморфизма, которая учитывается в генотипах второго полиморфизма. Следовательно, если R в квадрате для кандидатного полиморфизма и конкретного полиморфизма, определенного в данном описании, равен 0,5, это означает, что кандидатный полиморфизм обуславливает 50% вариаций конкретного полиморфизма. R в квадрате можно определить с помощью стандартных пакетов программ, таких как Haploview. Как правило, R в квадрате, равный 0,25 или большему значению (R >0,5 или <-0,5), соответствует высокой степени корреляции. Следовательно, если обнаружено, что R в квадрате составляет 0,5 или больше, предпочтительно 0,75, 0,8, 0,9 или 0,95 или больше, для кандидатного полиморфизма и конкретного полимор