Улучшенный способ получения ферментов целлюлазы и/или гемицеллюлазы

Улучшенный способ получения ферментов целлюлазы и/или гемицеллюлазы

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к способу продуцирования ферментов для гидролиза лигноцеллюлозной биомассы.

Уровень техники

Увеличение производства биоэтанола, обладающего качествами биотоплива, является в настоящее время актуальным. Цели внедрения обсуждаются в настоящее время в Европейском Союзе, основываясь на первоначальном предложении использовать 20% возобновляемых источников энергии к 2020 году при внедрении 10% биотоплива в соответствии с критериями долговременного использования, которые должны способствовать использованию биотоплива второго поколения, получаемого из лигноцеллюлозной биомассы.

Лигноцеллюлозная биомасса характеризуется сложной структурой, состоящей из трех основных полимеров: целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина.

Традиционно способ превращения биомассы в этанол состоит из нескольких стадий. Предварительная обработка обеспечивает доступность целлюлозы и возможно гемицеллюлоз, которые являются мишенями ферментативного гидролиза, для ферментов. Целью предварительной обработки является изменение физических и физико-химических свойств лигноцеллюлозного материала для улучшения доступности целлюлозы, заключенной в матрице из лигнина и гемицеллюлозы. Стадия ферментативного гидролиза обеспечивает превращение целлюлозы и гемицеллюлоз в сахара путем использования целлюлолитических и/или гемицеллюлолитических ферментов.

Сахара, полученные гидролизом лигноцеллюлозной биомассы, представляют собой пентозы (главным образом, ксилозу и арабинозу), дисахариды (целлобиозу) и глюкозу, которые могут ферментироваться микроорганизмами. Глюкоза, например, может легко превращаться в этанол при помощи дрожжей Saccharomyces cerevisiae на стадии спиртовой ферментации.

Наконец, стадия дистилляции позволяет отделять и извлекать продукт, полученный в результате ферментации, т.е. этанол в предыдущем случае, из ферментированного сусла.

Различные технико-экономические исследования показывают необходимость снижения стоимости на стадии ферментативного гидролиза с тем, чтобы довести стоимость полученного этанола до величин, близких к стоимости этанола, получаемого из крахмала.

В настоящее время промышленные целлюлазы получают главным образом из филаментозного гриба Trichoderma reesei в связи с его высокой способностью секретировать целлюлазы.

Одно из средств уменьшения стоимости заключается в оптимизации условий осуществления способа получения целлюлаз путем повышения производительности или путем получения ферментного коктейля, обладающего улучшенной специфической активностью.

Дикие штаммы Trichoderma reesei обладают способностью секретировать в присутствии субстрата-индуктора ферментный комплекс, хорошо адаптированный к гидролизу целлюлозы. Ферменты ферментного комплекса обладают тремя типами активности: эндоглюканаз, экзоглюканазы и целлобиаз. Другие белки, такие как ксиланазы, необходимые для гидролиза лигноцеллюлозной биомассы, также продуцируются Trichoderma reesei. Присутствие субстрата-индуктора необходимо для экспрессии целлюлолитических и/или гемицеллюлолитических ферментов.

Регуляция генов целлюлазы на разных углеродных источниках подробно исследовалась. Глюкоза оказывает катаболическую репрессию на продуцирование целлюлаз. Она индуцируется в присутствии целлюлозы, продуктов ее гидролиза, таких как целлобиоза, или некоторых олигосахаридов, в частности дисахаридов, таких как лактоза или софороза (Ilmén et al. 1997, Appl.Environ.Microbiol. Vol 63 p.1298-1306). Природа углеродного субстрата имеет большое влияние на состав ферментного комплекса. Так, ксилоза в сочетании с индуцирующим углеродным субстратом, таким как целлюлоза или лактоза, позволяет существенно улучшать активность, называемую ксиланазной, если она присутствует в ограниченных концентрациях порядка от 0,5 до 1 мкМ (Mach-Aigner et al., 2010 Applied and Environmental Microbiology, Vol 76 N6, стр.1770-1776). Растворение остаточных гемицеллюлоз (ксиланов) ксиланазами способствует ферментативному гидролизу (Varnai et al., 2010 Enzyme and Microbial Technology Vol 46, стр.185-193).

Для достижения высокой производительности ферментов необходимо внести быстро ассимилируемый источник углерода для обеспечения быстрого роста Trichoderma reesei и индуцирующий субстрат, который обеспечивает экспрессию целлюлаз и секрецию в культурной среде. Целлюлоза может выполнять обе эти роли. Однако ее трудно использовать на промышленной стадии и ее заменяют растворимыми углеродными источниками, такими как лактоза, являющаяся также индуцирующим субстратом.

Другие источники, такие как целлобиоза или софороза, также описаны в качестве индукторов (Ilmen et al. (1997), Foreman et al., (2003) Biol Chem 278, стр.31988-31997, Pakula et al., (2005) Microbiology, 151, стр.135-143), но являются слишком дорогостоящими для использования в промышленности.

Главным образом было отмечено, что продуцирование целлюлаз Trichoderma reesei с использованием растворимых субстратов значительно меньше, чем продуцирование целлюлаз в режиме “batch” за счет эффекта репрессии сахаров, легко ассимилируемых в высокой концентрации.

В патенте FR-В-2555603, поданном на имя заявителя, предлагается непрерывная подача углеродных субстратов, позволяющая повысить катаболическую репрессию путем ограничения остаточной концентрации в культурах и оптимизации количества сахаров для получения лучшего выхода и лучшей ферментной производительности. В способе, описанном в этом патенте, предлагается начать подачу субстрата с использованием растворимых сахаров, таких как углеродный источник, возможно в форме смеси. Однако ограничивающее непрерывное введение глюкозы или ксилозы, не ассоциированное с лактозой или другим индуктором целлюлаз (софороза, целлобиоза, …) не позволяет получать высокую производительность ферментов.

В промышленных способах получения целлюлолитических ферментов лактоза остается одним из наиболее пригодных субстратов. Ее цена является высокой и кроме того очень колеблется и составляет примерно треть себестоимости ферментов.

Одно из предлагаемых решений, представленное в патенте ЕР-В-0448430, заключается в использовании углеродных субстратов, выходящих из фильеры, например, гидролизированных гемицеллюлоз в качестве индуцирующего источника углерода. Однако производительность остается ниже примерно на 50% по отношению к способу, в котором используют только лактозу в качестве индуцирующего субстрата.

В заявке на патент WO 2009/026716 описан способ продуцирования целлюлаз, в котором гемицеллюлолитические производные составляют более 40% углеродного источника и сахара, индуцирующие получение целлюлаз, составляют от 3 до 20% этой смеси. Этот способ позволяет получать по меньшей мере в два раза больше целлюлаз по сравнению со способом, в котором используются только сахара, полученные из гемицеллюлоз. Однако описанные рабочие характеристики продуцирования целлюлаз остаются более низкими по сравнению со способом, в котором используют только лактозу.

Современные исследования показывают, что для усовершенствования способов продуцирования целлюлолитических и/или гемицеллюлолитических ферментов необходимо разрабатывать новые индуцирующие субстраты, по меньшей мере, такие же эффективные, как и те, в которых используют лактозу, и с меньшей стоимостью.

Настоящее изобретение вписывается в эти рамки.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к способу продуцирования целлюлолитических и/или гемицеллюлолитических ферментов, в котором индуцирующий субстрат является смесью глюкозы, лактозы и ксилозы.

Подробное описание изобретения

Способ продуцирования целлюлолитических и/или гемицеллюлолитических ферментов целлюлолитическим и/или гемицеллюлолитическим микроорганизмом по настоящему изобретению включает по меньшей мере одну стадию роста в присутствии углеродного источника и по меньшей мере одну стадию продуцирования в присутствии индуцирующего субстрата, в котором указанный индуцирующий субстрат представляет собой смесь глюкозы или целлюлозных гидролизатов, лактозы и ксилозы или раствора гемицеллюлозных гидролизатов, причем содержание каждого из компонентов смеси определено в следующих границах:

- от 40 до 65% масс. глюкозы или целлюлозных гидролизатов,

- от 21 до 25% масс. лактозы и

- от 10 до 39% масс. ксилозы или раствора гемицеллюлозных гидролизатов,

причем сумма этих трех компонентов равна 100%.

Индуцирующий субстрат не содержит никакого другого сахара кроме перечисленных выше компонентов. Таким образом, относительные количества каждого из компонентов выбирают так, что сумма показателей весовых содержаний равна 100%.

Благодаря способу по изобретению, в котором используют смесь определенных сахаров в качестве индуцирующего субстрата, полученные конечные концентрации белков на 50-60% больше, чем концентрации, полученные с использованием лактозы в качестве единственного продуцирующего субстрата. Они примерно в 3 раза превышают концентрацию, полученную с использованием улучшенных смесей, богатых ксилозами, таких как описаны в WO 2009/026716 из уровня техники.

В способе по настоящему изобретению используют смесь на основе глюкозы. Более 60% лактозы, индуцирующей получение целлюлазы, можно заменить глюкозой, известной в качестве репрессирующей продуцирование целлюлаз с улучшенной конечной рабочей характеристикой индуцирующей смеси. Глюкоза имеет существенно меньшую стоимость, чем лактоза, и примерно в 3 раза большую растворимость в воде. Можно таким образом уменьшить используемые объемы. Таким образом, в этом способе глюкозу используют одновременно на стадии роста, а также на стадии продуцирования на уровне 60% в составе смеси, являющейся индуцирующим субстратом.

Глюкозу, используемую в смеси сахаров, можно также заменять глюкозой, полученной на стадии энзиматического гидролиза целлюлозы, т.е. непосредственно способом превращения лигноцеллюлозной биомассы в этанол. Это способствует снижению стоимости получении ферментов путем использования копродуктов способа. В этом случае речь идет о целлюлозных гидролизатах.

Ксилозу, используемую в смеси, являющуюся индуцирующим сахаром, можно заменить раствором гемицеллюлозных гидролизатов, полученным способом превращения лигноцеллюлозной биомассы в этанол и, в частности, полученным при предварительной обработке биомассы.

С другой стороны, возможность использовать смесь, очень насыщенную сахарами, преимущественно позволяет ограничивать риски заражения.

Введение в смесь, являющуюся индуцирующим субстратом, ксилозы позволяет существенно увеличить ксиланазную активность конечного ферментного коктейля. Ксилозу можно преимущественно заменять раствором гемицеллюлозного гидролизата, полученного гидролизом гемицеллюлоз в процессе предварительной обработки лигноцеллюлозной биомассы в способах получения биотоплива второго поколения, которая в случае необходимости может быть концентрированным.

Предпочтительно смесь, являющаяся индуцирующим субстратом, содержит от 50 до 65% масс. глюкозы или целлюлозных гидролизатов, от 22 до 24% масс. лактозы и от 15 до 25% масс. ксилозы или раствора гемицеллюлолозных гидролизатов, возможно полученного в результате предварительной обработки лигноцеллюлозной биомассы, причем сумма компонентов равна 100%.

Наиболее предпочтительно индуцирующий субстрат является смесью, состоящей из 60% масс. глюкозы или целлюлозных гидролизатов, 23% масс. лактозы и 17% масс. ксилозы или гемицеллюлозных гидролизатов.

Углеродный субстрат, используемый на стадии роста, выбирают из глюкозы, ксилозы, лактозы, остатков, полученных после этанольной ферментации мономерных сахаров ферментных гидролизатов целлюлозной биомассы и/или сырого экстракта водорастворимых пентоз, возможно полученных при предварительной обработке целлюлозной биомассы.

Наиболее предпочтительно субстрат роста представляет собой глюкозу.

Используемые промышленные источники, относящиеся к виду Trichoderma reesei, модифицированные для улучшения целлюлолитических и/или гемицеллюлолитических ферментов способами мутация-селекция. Например, можно назвать штамм IFP CL847. Могут также применяться штаммы, улучшенные технологиями генетической рекомбинации. Их следует делетировать для катаболической репрессии при помощи глюкозы (Δ CRE1), как например CL847.Также пригодными являются штаммы MCG 77 (описан в US 4275163, опубл. 23.06.1981) и MCG 80 (описан в US 4472504, опубл. 18.09.1984).

Эти штаммы культивируют в биореакторах, встряхиваемых и аэрируемых в условиях, совместимых с их ростом и продуцированием ферментов. Условия являются такими, что рН находится в диапазоне от 3,5 до 6, а температура от 20 до 35°С. Предпочтительно выбирают рН, равный 4,8, и температуру 27°С на стадии роста и рН, равный 4, и температуру 25°С на стадии продуцирования. Степень аэрации, выраженная в объеме воздуха на объем реакционной среды в минуту или vvm, используемая во время осуществления способа, составляет от 0,3 до 1,5 мин^-1, а скорость вращения или rmp должна обеспечивать регулировку давления в О₂ от 20% до 60%. Предпочтительно выбирают аэрацию 0,5 vvm и встряхивание, обеспечивающее давление в О₂ 30%.

По своей природе углеродный субстрат, выбранный для получения биомассы, вводят в биореактор до стерилизации или стерилизуют отдельно и вводят в биореактор после стерилизации этого последнего для получения исходной концентрации сахаров от 15 до 60 г/л.

На стадии продуцирования водный раствор, содержащий индуцирующий субстрат, состоящий из смеси глюкоза/лактоза/ксилоза, или раствор гемицеллюлозного гидролизата, выбранный для стадии продуцирования ферментов, готовят в концентрации от 350 до 600 г/л в используемом питательном растворе.

Предпочтительно концентрация составляет от 450 до 550 г/л.

Водный раствор впрыскивают после истощения исходного субстрата так, чтобы внести оптимальное количество. Входящий поток питательного раствора составляет от 30 до 45 мг на грамм клеток в час.

Остаточная концентрация сахара в культурной среде меньше 1 г/л на стадии продуцирования (“подпитка”), что ограничивает продуцирование биомассы. Предпочтительно эта концентрация меньше 0,5 г/л и еще более предпочтительно составляет 0,1 г/л.

ПРИМЕРЫ

Из приведенных ниже примеров в примере 1 представлена культура, в которой используется глюкоза в качестве углеродного субстрата на стадии роста и на стадии продуцирования. Этот пример демонстрирует низкую производительность белков, получаемую, если этот сахар используют в качестве единственного углеродного субстрата, даже если на стадии подпитки поток является ограничивающим (остаточная концентрация глюкозы близка к 0). Во втором примере показана контрольная ферментация с использованием лактозы в качестве углеродного субстрата на стадии роста и на стадии продуцирования, которая обеспечивает высокую производительность белков. В примере 3 воспроизводится опытный эксперимент с использованием на стадии продуцирования смеси, такой как описана в заявке на патент WO 2009/026716, с высоким содержанием ксилозы, что позволяет, по мнению авторов, существенно повысить продуцирование целлюлаз по сравнению с экспериментом, в котором ксилозу или гемицеллюлозные производные используются в качестве единственных углеродных субстратов. Примеры 4-6 относятся к патенту и способам по настоящему изобретению.

Пример 1: Продуцирование ферментов на глюкозе (не относится к изобретению)

Продуцирование целлюлаз осуществляют в биореакторе с механическим встряхиванием. Минеральная среда имеет следующий состав: КОН 1,66 г/л, Н₃РО₄ 85% 2 мл/л, (NH₄)2SO₄ 2,8 г/л, MgSO₄, 7 H₂O 0,6 г/л, CaCl₂ 0,6 г/л, MnSO₄ 3,2 мг/л, ZnSO₄, 7 H₂O 2,8 мг/л, CoCl₂ 10 4,0 мг/л, FeSO₄, 7 H₂O 10 мг/л, Corn Steep 1,2 г/л, противопенное средство 0,5 мл/л.

Биореактор, содержащий минеральную среду, стерилизуют при 120°С в течение 20 минут, углеродный источник - глюкозу стерилизуют отдельно при 120°С в течение 20 минут, затем вводят в биореактор в стерильных условиях так, чтобы получить финальную концентрацию 30 г/л. В биореактор высевают при 10% (v/v) жидкую прекультуру штамма Trichoderma reesei CL847. Минеральная среда прекультуры идентична той, что находится в биореакторе за исключением добавления фталата калия в концентрации 5 г/л^-1 для тампонирования рН. Рост грибка в прекультуре происходит с использованием глюкозы в качестве углеродного субстрата в концентрации 30 г/л. Рост инокулята продолжается от 2 до 3 дней и происходит при 28°С в инкубаторе в условиях встряхивания. Переход к биореактору осуществляется, если остаточная концентрация глюкозы меньше 15 г/л.

Эксперимент в биореакторе включает в себя две стадии:

- стадию роста на углеродном субстрате - глюкозе (исходная концентрация = 30 г/л) при температуре 27°С и рН 4,8 (регулируется аммиаком 5,5 М). Аэрация составляет 0,5 vvm и встряхивание усиливается до 200-800 rpm в зависимости от рО₂ (давление растворенного кислорода), которое поддерживается выше 30%;

- стадию получения ферментов. Когда исходный субстрат в ферментаторе истощается, раствор глюкозы 250 г/л непрерывно впрыскивают с расходом от 30 до 40 мг на 1 г клеток в час до 164 часов. Температуру понижают до 25°С и рН 4 до конца культивирования, рН регулируется путем добавления раствора аммиака 5,5н., который вносит азот, необходимый для синтеза экскретируемых белков. Содержание растворенного кислорода поддерживают выше 15-20% путем аэрации и встряхивания.

После продуцирования ферментов следует титрование экстрацеллюлярных белков методом Лоури и в соответствии со стандартом BSA после отделения мицелия фильтрованием или центрифугированием. Определенными видами целлюлолитической активности являются:

- активность фильтровальной бумаги (UPF: единица фильтровальной бумаги), которая позволяет титровать общую активность ферментного пула эндоглюканаз и экзоглюканаз;

- активность арил-β-глюкозидазы и ксиланаз для специфических видов активности.

Активность UPF измеряют по бумаге Whatman n 1 (процедура, рекомендованная комиссией по биотехнологии IUPAC) в исходной концентрации 50 г/л; берут пробу анализируемого ферментного раствора, который высвобождает эквивалент 2 г/л глюкозы (колориметрическое титрование) в течение 60 минут. Принцип активности фильтровальной бумаги заключается в определении путем титрования при помощи DNS (динитросалициловая кислота) количества восстановленных сахаров, происходящих из бумаги Whatman n 1 (процедура, рекомендованная комиссией по биотехнологии IUPAC).

Субстратом, используемым для определения активности арил-β-глюкозидазы, является п-нитрофенил-β-D-глюкопиранозид (PNPG). Он расщепляется β-глюкозидазой, которая высвобождает п-нитрофенол.

Единицу активности арил-β-глюкозидазы определяют как количество фермента, необходимое для получения 1 мкмоля п-нитрофенола из PNPG в минуту, и выражают в МЕ/мл. Принцип титрования ксиланазной активности основывается на определении путем титрования DNS количества восстановленных сахаров, происходящего из раствора гидрированной ксиланазы. В этом методе титрования используются восстанавливающие свойства сахаров и главным образом ксилозы. Ксиланазная активность выражается в IU/мл, соответствует количеству фермента, необходимому для продуцирования 1 мкмоля ксилозы в минуту.

Показатели специфической активности получают путем деления показателей активности, выраженных в IU/мл на концентрацию белков. Их выражают в МЕ/мг.

Аналитическое определение по конечному суслу из примера 1 дает следующие результаты:

Биомасса г/л 15,2

Белки г/л 2,9

UPF МЕ/мл 1,4

Ксиланаза 29,1 IU/мг

Специфическая β-глюкозидаза 0,35 МЕ/мг.

Штамм CL847 представлен как не подавляемый катаболитной репрессией, оказываемой глюкозой на продуцирование целлюлазы (она делетируется геном CRE1). Оказывается, что даже при подпитке, осуществляемой в условиях ограничения глюкозы, конечная продукция белков является очень низкой.

Пример 2: Получение ферментов на лактозе (не по изобретению)

Получение ферментов осуществляется в тех же условиях, что и в Примере 1. Углеродным субстратом на стадиях роста и продуцирования является чистая лактоза. Лактоза является важным индуктором при продуцировании целлюлаз. Это субстрат, наиболее используемый в промышленности для продуцирования целлюлаз.

Через 30 часов роста, после истощения исходного субстрата непрерывно вводят подпитывающий раствор в концентрации 250 г/л с расходом 35 мг на 1 г клеток в час до 164 часов.

Аналитическое определение по конечному суслу дает следующие результаты:

Биомасса г/л 13,5

Белки г/л 37,8

UPF МЕ/мл 22,1

Ксиланаза 408,5 МЕ/мг

Специфическая β-глюкозидаза 0,96 МЕ/мг.

Пример 3: Продуцирование с использованием смеси 97% ксилоза/3% сахаров-индукторов продуцирования целлюлаз или CIC (не по изобретению)

Эксперимент проводится в тех же условиях, что и в примере 1, с использованием чистой ксилозы в качестве единственного углеродного субстрата на стадии роста и на стадии продуцирования смеси 97% ксилоза/3% CIC, представленной в патентной заявке WO 2009/026716 А1. CIC (сахара-индукторы продуцирования целлюлаз) представляют собой смесь сахаров, обеспечивающую индукцию продуцирования целлюлаз. Ее состав является следующим: 56% гентиобиозы, 14% софорозы, 10% трегалозы, 6% целлобиозы, 6% мальтотриозы, 8% глюкозы.

После истощения исходного субстрата смесь 97% ксилоза/3% CIC в концентрации 360 г/л впрыскивают в соответствии с описанными рекомендациями с расходом 0,4 г углерода .L-1.h-1.

Аналитическое определение по конечному суслу дает следующие результаты:

Биомасса 14,3 г/л

Белки 18,7 г/л

UPF 6,4 IU/мл

Ксиланаза 6000,1 МЕ/мг

Специфический UPF 0,34 МЕ/мг

Специфическая β-глюкозидаза 1,15 МЕ/мг.

Конечная продукция белков близка к представленной в патенте WO 2009/026716 А1, где авторы получили конечную концентрацию белков 25 г/л со штаммом P59G. Специфическая активность FPase (Filter paper activity for ceelulases, способ измерения активности целлюлазы на фильтровальной бумаге)(0,34 МЕ/мг) является слабой, тогда как активность ксиланазы является очень высокой.

Пример 4: Продуцирование с использованием смеси лактоза (23%)/глюкоза(60%)/ксилоза (17%) в концентрации 500 г/л (по изобретению)

Эксперимент в примере 4 проводится в тех же условиях, что и в примере 1, с использованием глюкозы в качестве углеродного субстрата роста в концентрации 60 г/л. Затем на стадии продуцирования в режиме «подпитки» используют раствор, в котором три углеродных субстрата смешаны в следующих пропорциях: лактоза (23%)/ глюкоза(60%)/ксилоза (17%) в концентрации 500 г/л. Эту смесь впрыскивают из расчета 45 мг.г^-1.час^-1.

Аналитическое определение по конечному суслу дает следующие результаты:

Биомасса 26,1 г/л

Белки 61,8 г/л

UPF 33,7 МЕ/мл

Ксиланаза 4017 МЕ/мг

Специфический UPF 0,55 МЕ/мг

Специфическая β-глюкозидаза 1,2 IU/мг.

Конечная продукция белков более чем в 3 раза превышает конечную продукцию из примера 3. Активность фильтровальной бумаги, которая является показателем целлюлазной активности, примерно в 5 раз выше.

Ксиланазная активность в 10 раз выше, чем в примере 2, выполненном с использованием лактозы в качестве единственного углеродного субстрата роста и продуцирования, но примерно на 50% ниже, чем в примере 3.

Пример 5: Использование смеси лактоза (23%)/глюкоза(60%)/раствор С5-сахаров (17%) в концентрации 500 г/л (по изобретению)

Пример 5 осуществляется в тех же условиях, что и пример 4. Глюкозу используют на стадии роста в концентрации 15 г/л. Ксилозу подпитывающего раствора заменяют растворимым гемицеллюлозным раствором или раствором С5-сахаров, полученным из пшеничной соломы, пропитанной серной кислотой 0,08н. и предварительно обработанной паровым взрывом (19 бар, 5 минут). Смесь впрыскивают из расчета 30 мг.г^-1.час.^-1 в течение 170 часов.

Аналитическое определение по конечному суслу дает следующие результаты:

Биомасса 19,1 г/л

Белки 57,3 г/л

UPF 25,1 МЕ/мл

Ксиланаза 1151 МЕ/мг

Специфический UPF 0,44 МЕ/мг

Специфическая β-глюкозидаза 1,4 IU/мг.

Этот эксперимент позволил повысить продукцию белков более чем на 50% по сравнению с примером 2 и ксиланазную активность почти в 3 раза. Большую часть лактозы заменили на стадии роста и продуцирования глюкозой и раствором С5-сахаров. Концентрация глюкозы на стадии роста уменьшилась по сравнению с примером 4 с 60 до 15 г/л. Концентрация биомассы уменьшилась с 26 до 19 г/л, но это незначительно повлияло на конечную концентрацию белков (снижение на 7%). Таким образом достигнуто максимальное использование сахаров и существенное снижение стоимости углеродного источника.

Пример 6: Использование смеси: лактоза (23%)/С6-гидролизаты (56%)/ксилоза (21%) в концентрации 500 г/л (по изобретению)

Пример 6 осуществляли в тех же условиях, что и пример 4. Глюкозу использовали на стадии роста в концентрации 15 г/л. Глюкозу в подпитывающем растворе заменили раствором гидролизата, полученным ферментативным гидролизом пшеничной соломы, пропитанной серной кислотой 0,08н. и предварительно обработанной паровым взрывом (19 бар, 5 минут). Ферментативный гидролиз пшеничной соломы осуществляли при 50°С и рН 4,8. Он привел к гидролизу 95% целлюлозы на глюкозе. Лактозу и ксилозу растворяли в этом растворе для получения смеси: лактоза (23%)/С6-гидролизаты (56%)/ксилоза (21%) в концентрации 500 г/л.

Смесь впрыскивали из расчета 30 мг.г^-1.час^-1 в течение 170 часов на стадии подпитки.

Аналитическое определение по конечному суслу дает следующие результаты:

Биомасса 16,1 г/л

Белки 43,1 г/л

UPF 31,4 МЕ/мл

Ксиланаза 6595,1 МЕ/мг

Специфический UPF 0,73 МЕ/мг

Специфическая β-глюкозидаза 1,2 МЕ/мг.

Полученный ферментный коктейль имеет очень хорошее качество, т.к. конечная активность FPase является близкой к активности, достигнутой в примере 4, даже если концентрация белков является более слабой. Конечная активность FPase примерно в 5 раз превышает ту, которая получена в примере 3, и примерно на 50% выше полученной в примере 2, в котором лактоза используется в качестве единственного углеродного субстрата на стадии подпитки.

1. Способ получения ферментов целлюлазы и/или гемицеллюлазы микроорганизма вида Trichoderma ressei, включающий по меньшей мере одну стадию роста в присутствии углеродного источника и по меньшей мере одну стадию продуцирования в присутствии индуцирующего субстрата, в котором указанный индуцирующий субстрат представляет собой смесь глюкозы или целлюлозных гидролизатов, лактозы и ксилозы или раствора гемицеллюлозных гидролизатов, причем содержание каждого из компонентов смеси определено в следующих границах:- от 40 до 65 мас.% глюкозы или целлюлозных гидролизатов,- от 21 до 25 мас.% лактозы и- от 10 до 39 мас.% ксилозы или раствора гемицеллюлозных гидролизатов,причем суммарное количество этих трех компонентов равно 100%.

2. Способ по п.1, в котором микроорганизм вида Trichoderma reesei делетирован для катаболитной репрессии глюкозой.

3. Способ по п.1 или 2, в котором внесение индуцирующего субстрата осуществляется в растворе, причем концентрация индуцирующего субстрата в питательном растворе, используемом на стадии продуцирования, составляет от 350 до 600 г/л.

4. Способ по п.3, в котором концентрация составляет от 450 до 550 г/л.

5. Способ по п.1 или 2, в котором смесь, являющаяся индуцирующим субстратом, содержит от 50 до 65 мас.% глюкозы или целлюлозных гидролизатов, от 22 до 24 мас.% лактозы и от 15 до 25 мас.% ксилозы или раствора гемицеллюлозных гидролизатов, причем суммарное количество компонентов смеси равно 100%.

6. Способ по п.5, в котором индуцирующий субстрат является смесью, состоящей из 60% масс. глюкозы или целлюлозных гидролизатов, 23% масс. лактозы и 17% масс. ксилозы или гемицеллюлозных гидролизатов.

7. Способ по п.1 или п. 2, в котором углеродный субстрат, используемый на стадии роста, выбирают из глюкозы, ксилозы, лактозы, остатков, полученных после этанольной ферментации мономерных сахаров ферментативных гидролизатов целлюлозной биомассы и/или сырого экстракта водорастворимых пентоз, возможно полученных при предварительной обработке целлюлозной биомассы.

8. Способ по п.1 или 2, в котором значение рН поддерживают в диапазоне от 3,5 до 6, а температура составляет от 20 до 35°С.

9. Способ по п.1 или 2, в котором входящий поток питательного раствора составляет от 30 до 45 мг на 1 г клеток в час.

10. Способ по п.1 или 2, в котором остаточная концентрация сахара в культурной среде на стадии продуцирования меньше 1 г/л, предпочтительно 0,5 г/л и еще более предпочтительно 0,1 г/л.