Фармацевтический состав, содержащий молекулы антител с улучшенными свойствами

Фармацевтический состав, содержащий молекулы антител с улучшенными свойствами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к составу, содержащему полипептид и/или антитело, в частности, к стабильному жидкому составу, содержащему модифицированное антитело против рецептора IL-6 в высокой концентрации.

Предшествующий уровень техники

В последние годы были разработаны различные составы антител, и эти составы были использованы в практических целях. Многие из этих составов были использованы для внутривенных инъекций. При этом необходимо получить такие антитело-содержащие составы для подкожных инъекций, которые имели бы высокую концентрацию антитела в жидкости (примерно от 100 мг до 200 мг), а их объем для подкожных инъекций был бы, в основном, ограничен.

В растворах, содержащих высокую концентрацию антитела, происходит нежелательное разложение, что приводит к образованию нерастворимых и/или растворимых агрегатов. Такие нерастворимые и растворимые агрегаты, вероятно, образуются в жидком состоянии, что обусловлено ассоциацией молекул антитела. В случае хранения жидкого состава в течение длительного периода времени, биологическая активность молекул антител может теряться или снижаться, что обусловлено дезамидированием аспарагиновых остатков. Проведение циклов замораживания и оттаивания также приводит к образованию расщепленных и агрегированных молекул антител.

Были предложены различные идеи по приготовлению стабилизированного состава, в котором потери активного компонента снижаются после хранения данного состава даже в течение длительного периода времени. Такие составы получают путем растворения активного компонента и различных добавок в буферном растворе. Поэтому возникает необходимость в получении высококонцентрированного антитело-содержащего состава, в котором димеризация и дезамидирование ингибируется в процессе длительного хранения, и который является стабильным и может быть использован для подкожного введения.

Антитела представляют особый интерес как фармацевтические средства, поскольку они обладают высокой стабильностью в плазме и не вызывают значительных побочных эффектов. К таким антителам относится ряд коммерчески доступных фармацевтически приемлемых антител типа IgG и многие фармацевтически приемлемые антитела, которые в настоящее время находятся на стадии разработки (непатентные документы 1 и 2). IL-6 представляет собой цитокин, вызывающий различные аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания, злокачественные опухоли и т.п. (непатентный документ 3). Тоцилизумаб (TOCILIZUMAB), то есть гуманизированное антитело IgG1 против рецептора IL-6, специфически связывается с рецептором IL-6. Предполагается, что тоцилизумаб может быть использован в качестве терапевтического средства для лечения IL-6-ассоциированных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, поскольку это антитело нейтрализует биологическую активность IL-6 (патентные документы 1-3 и непатентный документ 4). В Японии, тоцилизумаб был разрешен к применению в качестве терапевтического средства для лечения болезни Кастлемана и ревматоидного артрита (непатентный документ 5).

Гуманизированные антитела, такие как тоцилизумаб, представляют собой фармацевтически приемлемые антитела первого поколения. Фармацевтически приемлемые антитела второго поколения в настоящее время находятся на стадии исследований, проводимых в целях улучшения эффективности, удобства применения и снижения стоимости фармацевтически приемлемых антител первого поколения. В настоящее время разрабатываются различные технологии, которые могут быть применены для получения фармацевтически приемлемых антител второго поколения. Имеются описания методов усиления эффекторной функции, повышения антигенсвязывающей способности, улучшения фармакокинетических свойств и повышения стабильности этих антител, а также методов снижения риска развития иммуногенности. Как сообщалось, такими методами повышения эффективности лекарственного средства или снижения дозы являются методы повышения антитело-зависимой клеточно-опосредуемой цитотоксической активности (ADCC-активности) или комплемент-зависимой цитотоксической активности (CDC-активности), проводимые посредством аминокислотной замены в Fc-области антитела IgG (непатентный документ 6). Также сообщалось, что методом повышения антигенсвязывающей способности или антиген-нейтрализующей способности является аффинное созревание (непатентный документ 7). Такая технология позволяет усиливать антигенсвязывающую активность путем введения аминокислотных мутаций в гипервариабельную область (комплементарность-определяющую область (CDR)) вариабельной области или т.п. Повышение антигенсвязывающей способности приводит к усилению биологической активности in vitro или позволяет снижать вводимую дозу, а также приводит к повышению эффективности in vivo (непатентный документ 8). В настоящее время проводятся клинические испытания для характеризации антитела мотавизумаба (Motavizumab)(полученного посредством созревания аффинности), которое, как предполагается, обладает гораздо большей эффективностью, чем паливизумаб (Palivizumab), то есть, фармацевтически приемлемое анти-RSV антитело первого поколения (непатентный документ 9). В литературе также описано антитело против рецептора IL-6 с аффинностью приблизительно 0,05 нМ (то есть, с аффинностью, превышающей аффинность тоцилизумаба)(патентный документ 4). Однако в литературе отсутствуют какие-либо данные о человеческих, гуманизированных или химерных антителах, аффинность которых превышает 0,05 нМ.

Проблемой, с которой в настоящее время сталкиваются специалисты при получении фармацевтически приемлемых антител, является высокая стоимость их производства, связанная с введением очень больших количеств белка. Так, например, доза тоцилизумаба, а именно, гуманизированного антитела IgG1 против рецептора IL-6, для внутривенной инъекции составляет приблизительно 8 мг/кг/месяц (непатентный документ 4). Для лечения хронических аутоиммунных заболеваний предпочтительной формой введения состава является подкожное введение. В общих чертах, необходимо, чтобы составы для подкожного введения имели высокую концентрацию антитела. С точки зрения стабильности или т.п., предельная доза для антитела типа IgG обычно составляет примерно 100 мкг/мл (непатентный документ 10). Недорогостоящие и удобные для применения фармацевтические составы на основе антител второго поколения, которые могут быть введены подкожно в течение более длительных промежутков времени, могут быть получены путем увеличения времени полужизни антитела в плазме в целях увеличения продолжительности его терапевтического действия и, тем самым, снижения количества вводимого белка, а также путем сообщения данному антителу высокой стабильности.

FcRn тесно связан с фармакокинетикой антител. Что касается различий во времени полужизни антител изотипов IgG1 и IgG2 в плазме, то известно, что IgG1 и IgG2 имеют значительно более продолжительное время полужизни в плазме, чем IgG3 и IgG4 (непатентный документ 11). Как сообщалось, методом еще большего увеличения времени полужизни антител IgG3 и IgG4 в плазме, которые уже имеют достаточно продолжительное время полужизни в плазме, является замена аминокислот в константной области, приводящая к повышению уровня связывания с FcRn (непатентные документы 12 и 13). С точки зрения иммуногенности, дальнейшее увеличение времени полужизни в плазме было достигнуто путем замены аминокислот, предпочтительно, в вариабельной, но не в константной области (патентный документ 5). Однако, в настоящее время, отсутствуют какие-либо данные об увеличении времени полужизни антител против рецептора IL-6 в плазме, достигаемом посредством модификации вариабельной области.

Другой важной проблемой, с которой сталкиваются специалисты в области разработки биофармацевтических препаратов, является иммуногенность. В общих чертах, иммуногенность мышиных антител может быть снижена путем «гуманизации» антител. При этом предполагается, что при гуманизации антитела риск развития иммуногенности может быть еще более снижен путем использования каркасной последовательности зародышевой линии в качестве матрицы (непатентный документ 14). Однако даже адалимумаб (Adalimumab), то есть полностью человеческое анти-TNF антитело, обнаруживал высокий уровень (13%-17%) развития иммуногенности, и было установлено, что у пациентов, у которых наблюдалась иммуногенность, терапевтический эффект был низким (непатентные документы 15 и 16). Т-клеточные эпитопы могут присутствовать даже в CDR человеческих антител, и такие Т-клеточные эпитопы в CDR могут вызывать иммуногенность. Методы in silico и in vitro для предсказания Т-клеточных эпитопов описаны в литературе (непатентные документы 17 и 18). Предполагается, что риск развития иммуногенности может быть снижен путем удаления Т-клеточных эпитопов, предсказанных такими методами (непатентный документ 19).

Тоцилизумаб, то есть гуманизированное антитело против рецептора IL-6, представляет собой антитело IgG1, полученное путем гуманизации мышиного антитела PM1. Присоединение CDR осуществляют с использованием человеческих последовательностей NEW и REI в качестве каркасной матрицы для цепей H и L, соответственно; однако пять аминокислот мышиной последовательности в каркасной области были сохранены в качестве незаменимых аминокислот для поддержания активности (непатентный документ 20). В настоящее время отсутствуют какие-либо данные о полной гуманизации остальной мышиной последовательности в каркасной области гуманизированного антитела тоцилизумаба без снижения его активности. Кроме того, последовательностью CDR тоцилизумаба является мышиная последовательность, и такая последовательность, подобно адалимумабу, может иметь Т-клеточные эпитопы в CDR, которые могут вызывать риск развития иммуногенности. В клинических испытаниях тоцилизумаба антитела против тоцилизумаба не детектировались при эффективной дозе 8 мг/кг, но они наблюдались при дозах 2 мг/кг и 4 мг/кг (патентный документ 6). Это позволяет предположить, что иммуногенность тоцилизумаба может быть еще больше снижена. Однако в литературе отсутствуют какие-либо данные о снижении риска развития иммуногенности тоцилизумаба при аминокислотной замене.

Изотипом тоцилизумаба является IgG1. Различия в изотипах определяются различиями в последовательностях константной области. Поскольку предполагается, что последовательность константной области оказывает значительное влияние на эффекторную функцию, фармакокинетику, физические свойства антител и т.п., то выбор последовательности константной области имеет очень важное значение для разработки фармацевтических составов на основе антител (непатентный документ 11). В последние годы безопасность фармацевтических составов на основе антител приобретает важное значение. Взаимодействие Fc-части антитела и Fcγ-рецептора (эффекторная функция) может приводить к серьезным побочным эффектам в клинических испытаниях TGN1412 фазы I (непатентный документ 21). Для получения фармацевтических препаратов на основе антител в целях нейтрализации биологической активности антигена, связывание с Fcγ-рецептором, которое играет важную роль в эффекторных функциях, таких ADCC, не является необходимым. Связывание с Fcγ-рецептором может даже оказаться нежелательным с точки зрения побочных эффектов. Способ снижения уровня связывания с Fcγ-рецептором применяется для изменения изотипа антитела IgG с IgG1 на IgG2 или IgG4 (непатентный документ 22). IgG2 является более предпочтительным, чем IgG4, с точки зрения фармакокинетики и связывания с Fcγ-рецептором I (непатентный документ 11). Тоцилизумаб представляет собой антитело, нейтрализующее рецептор IL-6, а его изотипом является IgG1. Таким образом, с точки зрения минимизации возможных побочных эффектов, IgG2 может оказаться предпочтительным изотипом, поскольку для его действия не требуется эффекторных функций, таких как ADCC.

Тем не менее, при разработке фармацевтических препаратов на основе антител, очень важное значение имеют физико-химические свойства белков, в частности, их гомогенность и стабильность. Сообщалось, что изотип IgG2 обладает значительной гетерогенностью, что обусловлено наличием дисульфидных связей в его шарнирной области (непатентный документ 23). Трудоемкость и высокая стоимость крупномасштабного промышленного производства фармацевтических препаратов на основе таких антител с сохранением нужных веществ/родственных веществ связано с их гетерогенностью, обусловленной различием дисульфидных связей в различных продуктах. Таким образом, если это возможно, то желательно использовать одно вещество. Кроме того, сообщалось, что гетерогенность С-концевых последовательностей H-цепи антитела обусловлена делецией С-концевого лизинового аминокислотного остатка и амидированием С-концевой карбоксильной группы в результате делеции двух С-концевых аминокислот, глицина и лизина (непатентный документ 24). При разработке антител изотипа IgG2, которые могут быть использованы в качестве фармацевтических препаратов, необходимо стремиться к снижению такой гетерогенности и к сохранению высокой стабильности. Для получения удобных в употреблении стабильных составов, имеющих высокую концентрацию и предназначенных для подкожного введения, предпочтительно, чтобы такие составы обладали не только высокой стабильностью, но также имели время полужизни в плазме, превышающее время полужизни IgG1, который является изотипом тоцилизумаба. Однако в настоящее время отсутствуют какие-либо данные о последовательностях константной области антител с константной областью изотипа IgG2, которые имеют пониженную гетерогенность, высокую стабильность и время полужизни в плазме, превышающее время полужизни антител с константной областью изотипа IgG1.

Список цитируемых патентных докуметнов

ПТД 1: WO 92/19759.

ПТД 2: WO 96/11020.

ПТД 3: WO 96/12503.

ПТД 4: WO 2007/143168.

ПТД 5: WO 2007/114319.

ПТД 6: WO 2004/096273.

Непатентные документы:

НПД 1: Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic, Nature Biotechnology 23, 1073-1078 (2005).

НПД 2: Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. 2005 Apr; 59(3):389-96.

НПД 3: Nishimoto N, Kishimoto T., Interleukin 6: from bench to bedside., Nat Clin Pract Rheumatol. 2006 Nov; 2(11):619-26.

НПД 4: Maini RN, Taylor PC, Szechinski J, Pavelka K, Broll J, Balint G, Emery P, Raemen F, Petersen J, Smolen J, Thomson D, Kishimoto T; CHARISMA Study Group., Double-blind randomized controlled clinical trial of the interleukin-6 receptor antagonist, Tocilizumab, in European patients with rheumatoid arthritis who had an incomplete response to methotrexate., Arthritis Rheum. 2006 Sep; 54(9):2817-29.

НПД 5: Nishimoto N, Kanakura Y, Aozasa K, Johkoh T, Nakamura M, Nakano S, Nakano N, Ikeda Y, Sasaki T, Nishioka K, Hara M, Taguchi H, Kimura Y, Kato Y, Asaoku H, Kumagai S, Kodama F, Nakahara H, Hagihara K, Yoshizaki K, Kishimoto T. Humanized anti-interleukin-6 receptor antibody treatment of multicentric Castleman disease. Blood. 2005 Oct 15; 106(8):2627-32.

НПД 6: Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31; 20(1):17-29. Review.

НПД 7: Rothe A, Hosse RJ, Power BE. Ribosome display for improved biotherapeutic molecules. Expert Opin Biol Ther. 2006 Feb; 6(2):177-87.

НПД 8: Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14; 102(24):8466-71. Epub 2005 Jun 6.

НПД 9: Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract. J Mol Biol. 2007, 368, 652-665.

НПД 10: Shire SJ, Shahrokh Z, Liu J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. J Pharm Sci. 2004 Jun; 93(6):1390-402.

НПД 11: Salfeld JG. Isotype selection in antibody engineering. Nat Biotechnol. 2007 Dec; 25(12):1369-72.

НПД 12: Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006 Jan 1; 176(1):346-56.

НПД 13: Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul; 15(7):637-40.

НПД 14: Hwang WY, Almagro JC, Buss TN, Tan P, Foote J. Use of human germline genes in a CDR homology-based approach to antibody humanization. Methods. 2005 May; 36(1):35-42.

НПД 15: Bartelds GM, Wijbrandts CA, Nurmohamed MT, Stapel S, Lems WF, Aarden L, Dijkmans BA, Tak P, Wolbink GJ. Clinical response to adalimumab: The relationship with anti-adalimumab antibodies and serum adalimumab concentrations in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2007 Mar 9; [публикация Европейской заявки находится в печати].

НПД 16: Bender NK, Heilig CE, Droll B, Wohlgemuth J, Armbruster FP, Heilig B. Immunogenicity, efficacy and adverse events of adalimumab in RA patients. Rheumatol Int. 2007 Jan; 27(3):269-74.

НПД 17: Van Walle I, Gansemans Y, Parren PW, Stas P, Lasters I. Immunogenicity screening in protein drug development. Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar; 7(3):405-18.

НПД 18: Jones TD, Phillips WJ, Smith BJ, Bamford CA, Nayee PD, Baglin TP, Gaston JS, Baker MP. Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J Thromb Haemost. 2005 May; 3(5):991-1000.

НПД 19: Chirino AJ, Ary ML, Marshall SA. Minimizing the immunogenicity of protein therapeutics. Drug Discov Today. 2004 Jan 15; 9(2):82-90.

НПД 20: Sato K, Tsuchiya M, Saldanha J, Koishihara Y, Ohsugi Y, Kishimoto T, Bendig MM. Reshaping a human antibody to inhibit the interleukin 6-dependent tumor cell growth. Cancer Res. 1993 Feb 15; 53(4):851-6.

НПД 21: Strand V, Kimberly R, Isaacs JD. Biologic therapies in rheumatology: lessons learned future directions. Nat Rev Drug Discov. 2007 Jan; 6(1):75-92.

НПД 22: Gessner JE, Heiken H, Tamm A, Schmidt RE. The IgG Fc receptor family. Ann Hematol. 1998 Jun; 76(6):231-48.

НПД 23: Dillon TM, Ricci MS, Vezina C, Flynn GC, Liu YD, Rehder DS, Plant M, Henkle B, Li Y, Deechongkit S, Varnum B, Wypych J, Balland A, Bondarenko PV. Structural and functional characterization of disulfide isoforms of the human IgG2 subclass. J Biol Chem. 2008 Jun 6; 283(23):16206-15.

НПД 24: Johnson KA, Paisley-Flango K, Tangarone BS, Porter TJ, Rouse JC. Cation exchange-HPLC and mass spectrometry reveal C-terminal amidation of an IgG1 heavy chain. Anal Biochem. 2007 Jan 1; 360(1):75-83.

Описание сущности изобретения

Задачей настоящего изобретения является получение фармацевтических составов (которые далее могут также называться «агентами» или «фармацевтическими композициями»), содержащих молекулы второго поколения, обладающие улучшенными свойствами по сравнению с гуманизированным антителом IgG1 против рецептора IL-6, а именно, тоцилизумабом, путем модификации аминокислотных последовательностей вариабельных и константных областей тоцилизумаба в целях повышения его антиген-нейтрализующей способности и улучшения фармакокинетических свойств, с последующим достижением пролонгированного терапевтического эффекта с меньшей частотой введения указанных составов, а также снижением иммуногенности, повышением безопасности и улучшением физико-химических свойств (повышением стабильности и гомогенности).

Кроме того, настоящее изобретение относится к составам, содержащим высокие концентрации полипептида и/или антитела, где в указанных составах димеризация и дезамидирование ингибируются в процессе длительного хранения или проведения множества циклов замораживания/оттаивания, и где такие составы являются стабильными и, предпочтительно, подходящими для подкожного введения.

Для решения вышеупомянутых проблем были проведены интенсивные исследования, в результате которых было обнаружено, что стабильный состав, содержащий высокие концентрации полипептида и/или антитела, может быть получен путем добавления к раствору аминокислоты аргинина или его соли в качестве стабилизатора.

Настоящее изобретение подробно описано ниже. Авторами настоящего изобретения были проведены специальные исследования в целях получения фармацевтического состава, который является стабильным благодаря присутствию молекул второго поколения, обладающих лучшими свойствами по сравнению с гуманизированным антителом IgG1 против рецептора IL-6, а именно тоцилизумабом первого поколения. А поэтому, при получении рассматриваемого антитела, авторами настоящего изобретения было введено множество мутаций CDR в вариабельные области тоцилизумаба, улучшающих его способность связываться (аффинность) с антигеном. Таким образом, авторам настоящего изобретения удалось значительно повысить аффинность этого антитела с использованием комбинации таких мутаций. Авторам настоящего изобретения также удалось улучшить фармакокинетические свойства путем введения модификаций, снижающих величину изоэлектрической точки последовательности вариабельной области. Авторам настоящего изобретения также удалось улучшить фармакокинетические свойства путем обеспечения рН-зависимого связывания с антигеном рецептора IL-6, в результате чего одна молекула антитела может многократно нейтрализовать антиген. Кроме того, авторам настоящего изобретения удалось снизить риск развития иммуногенности путем полной гуманизации мышиных последовательностей, присутствующих в каркасной области тоцилизумаба, и снижения числа пептидов Т-клеточного эпитопа в вариабельных областях, предсказанных in silico. Кроме того, авторам настоящего изобретения также удалось выявить новые последовательности константной области для константной области тоцилизумаба, которые снижают уровень связывания с Fcγ-рецептором, повышают безопасность, улучшают фармакокинетические свойства по сравнению с последовательностями IgG1 и снижают гетерогенность, ассоциированную с присутствием дисульфидных связей в шарнирной области IgG2, а также снижают гетерогенность, ассоциированную с С-концом Н-цепи без снижения стабильности. Авторам настоящего изобретения удалось получить молекулы второго поколения, обладающие улучшенными свойствами по сравнению с тоцилизумабом, путем соответствующего объединения указанных модификаций аминокислотной последовательности в CDR, в вариабельных областях и в константных областях.

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим составам, которые содержат гуманизированное антитело IgG против рецептора IL-6, обладающее повышенной способностью связываться с антигеном (рецептором IL-6), улучшенными фармакокинетическими свойствами, повышенной безопасностью и улучшенными физическими свойствами (повышенной стабильностью и гомогенностью), а также имеют пониженный риск развития иммуногенности, где указанные фармацевтические составы получают путем модификации аминокислотных последовательностей вариабельных и константных областей гуманизированного антитела IgG1 против рецептора IL-6, а именно, тоцилизумаба; а также к способам получения указанных фармацевтических композиций. Более конкретно, настоящее изобретение относится:

(1) к фармацевтическому составу, содержащему по меньшей мере один полипептид, выбранный из:

(a) полипептида, включающего CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH4-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH4-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH4-M73);

(b) полипептида, включающего CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VH3-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VH3-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VH3-M73);

(c) полипептида, включающего CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 7 (CDR1 VH5-M83), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 8 (CDR2 VH5-M83), и CDR3, содержащую SEQ ID NO: 9 (CDR3 VH5-M83);

(d) полипептида, включающего CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 10 (CDR1 VL1), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 11 (CDR2 VL1), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12 (CDR3 VL1);

(e) полипептида, включающего CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13 (CDR1 VL3), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 14 (CDR2 VL3), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 15 (CDR3 VL3); и

(f) полипептида, включающего CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 16 (CDR1 VL5), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 17 (CDR2 VL5), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18 (CDR3 VL5);

(2) к фармацевтическому составу, содержащему по меньшей мере одно антитело, выбранное из:

(a) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO:1 (CDR1 VH4-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH4-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH4-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 10 (CDR1 VL1), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 11 (CDR2 VL1), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12 (CDR3 VL1);

(b) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VH3-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VH3-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VH3-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13 (CDR1 VL3), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 14 (CDR2 VL3), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 15 (CDR3 VL3); и

(c) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 7 (CDR1 VH5-M83), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 8 (CDR2 VH5-M83), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 9 (CDR3 VH5-M83), и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 16 (CDR1 VL5), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 17 (CDR2 VL5), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18 (CDR3 VL5);

(d) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 19 (вариабельную область VH4-M73), и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 22 (вариабельную область VL1);

(e) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 20 (вариабельную область VH3-M73), и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 23 (вариабельную область VL3);

(f) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 21 (вариабельную область VH5-M83), и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 24 (вариабельную область VL5).

(g) антитела, которое содержит тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 25 (VH4-M73) и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 28 (VL1);

(h) антитела, которое содержит тяжелую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 26 (VH5-M73), и легкую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 29 (VL3);

(i) антитела, которое содержит тяжелую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 27 (VH4-M83), и легкую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 30 (VL5);

(3) к стабильному фармацевтическому составу (1) или (2), содержащему гистидиновый и/или цитратный буфер;

(4) к стабильному фармацевтическому составу по пунктам (1)-(3), содержащему по меньшей мере одну катионную аминокислоту;

(5) к стабильному фармацевтическому составу по любому из пунктов (1)-(4), содержащему 1-500 мМ гистидинового и/или цитратного буфера, 1-1500 мМ по меньшей мере одной катионной аминокислоты, 1-200 мг/мл антитела и 1-400 мМ углевода;

(6) к составу по пунктам (4) или (5), где катионной аминокислотой является аргинин;

(7) к составу по пунктам (5) или (6), где углеводом является сахароза или трегалоза;

(8) к составу по любому из пунктов (1)-(7), который также содержит поверхностно-активное вещество;

(9) к составу по любому из пунктов (1)-(8), содержащему полипептид и/или антитело в количестве по меньшей мере 10 мг/мл;

(10) к составу по любому из пунктов (1)-(9), содержащему полипептид и/или антитело в количестве по меньшей мере 50 мг/мл;

(11) к составу по любому из пунктов (1)-(10), содержащему полипептид и/или антитело в количестве по меньшей мере 80 мг/мл;

(12) к составу по любому из пунктов (1)-(11), содержащему полипептид и/или антитело в количестве, равном 240 мг/мл или менее;

(13) к составу по любому из пунктов (1)-(12), имеющему рН в пределах от 4,5 до 7,0;

(14) к составу по пункту (13), имеющему pH в пределах от 5,5 до 6,6;

(15) к составу по любому из пунктов (1)-(14), где указанным составом является жидкость;

(16) к составу по пункту (15), который, в процессе его приготовления, не был подвергнут лиофилизации;

(17) к составу по любому из пунктов (1)-(16), где степень димеризации молекул полипептида и/или антитела была снижена;

(18) к составу по любому из пунктов (1)-(17), где димеризация молекул полипептида и/или антитела была ингибирована;

(19) к составу по любому из пунктов (1)-(18), предназначенному для подкожного введения;

(20) к способу стабилизации раствора, содержащего антитело, где указанный способ включает добавление по меньшей мере одной катионной аминокислоты, где указанным антителом является по меньшей мере одно антитело, выбранное из:

(a) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH4-M73); CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH4-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH4-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 10 (CDR1 VL1); CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 11 (CDR2 VL1), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12 (CDR3 VL1);

(b) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VH3-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VH3-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VH3-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 13 (CDR1 VL3); CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 14 (CDR2 VL3), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 15 (CDR3 VL3);

(c) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 7 (CDR1 VH5-M83), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 8 (CDR2 VH5-M83), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 9 (CDR3 VH5-M83), и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 16 (CDR1 VL5), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 17 (CDR2 VL5), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18 (CDR3 VL5);

(d) антитела, которое включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 19 (вариабельную область VH4-M73), и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 22 (вариабельную область VL1);

(e) антитела, которое включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 20 (вариабельную область VH3-M73), и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 23 (вариабельную область VL3);

(f) антитела, которое включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 21 (вариабельную область VH5-M83), и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 24 (вариабельную область VL5);

(g) антитела, которое включает тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 25 (VH4-M73), и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 28 (VL1);

(h) антитела, которое включает тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 26 (VH3-M73), и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 29 (VL3); и

(i) антитела, которое включает тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 27 (VH5-M83), и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 30 (VL5);

(21) к способу стабилизации антитела в процессе проведения цикла замораживания/оттаивания раствора, содержащего антитело, где указанный способ включает добавление по меньшей мере одной катионной аминокислоты, и где указанным антителом является по меньшей мере одно антитело, выбранное из:

(a) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH4-M73), CDR2, содержащую SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH4-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH4-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 10 (CDR1 VL1), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 11 (CDR2 VL1), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12 (CDR3 VL1);

(b) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VH3-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VH3-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VH3-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13 (CDR1 VL3); CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 14 (CDR2 VL3), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 15 (CDR3 VL3);

(c) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 7 (CDR1 VH5-M83), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 8 (CDR2 VH5-M83), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 9 (CDR3 VH5-M83), и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 16 (CDR1 VL5), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 17 (CDR2 VL5), и CDR3, SEQ ID NO: 18 (CDR3 VL5);

(d) антитела, которое включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 19 (вариабельную область VH4-M73), и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 22 (вариабельную область VL1);

(e) антитела, которое включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 20 (вариабельную область VH3-M73), и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 23 (вариабельную область VL3);

(f) антитела, которое включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 21 (вариабельную область VH5-M83), и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 24 (вариабельную область VL5);

(g) антитела, которое включает тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 25 (VH4-M73), и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 28 (VL1);

(h) антитела, которое включает тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 26 (VH3-M73), и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 29 (VL3); и

(i) антитела, которое включает тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 27 (VH5-M83), и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 30 (VL5).

Вышеописанные гуманизированные антитела IgG против рецептора IL-6 обладают повышенной эффективностью и улучшенными фармакокинетическими свойствами, а поэтому они обладают пролонгированным терапевтическим действием при меньшей частоте введения.

Краткое описание графического материала

На фиг.1 представлен список сайтов мутаций, повышающих аффинность тоцилизумаба к рецептору IL-6. Последовательность HCDR2 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 81; последовательность HCDR2, полученная после введения мутации (верхняя строка), представлена в SEQ ID NO: 82; последовательность HCDR2, полученная после введения мутации (нижняя строка), представлена в SEQ ID NO: 83; последовательность HCDR3 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 84; последовательность HCDR3, полученная после введения мутации (верхняя строка), представлена в SEQ ID NO: 85; последовательность HCDR3, полученная после введения мутации (нижняя строка), представлена в SEQ ID NO: 86; последовательность LCDR1 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 87; последовательность LCDR1, полученная после введения мутации (верхняя строка), представлена в SEQ ID NO: 88; последовательность LCDR1, полученная после введения мутации (нижняя строка), представлена в SEQ ID NO: 89; последовательность LCDR3 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 90; последовательность LCDR3, полученная после введения мутации (верхняя строка), представлена в SEQ ID NO: 91; и последовательность LCDR3, полученная после введения мутации (нижняя строка), представлена в SEQ ID NO: 92.

На фиг.2 представлен график, иллюстрирующий нейтрализующую активность тоцилизумаба и RDC-23 в BaF/gp130.

На фиг.3 представлен список сайтов мутаций, которые могут снижать величину изоэлектрической точки вариабельной области без значительного снижения уровня связывания тоцилизумаба с рецептором IL-6. Звездочки у сайтов мутаций означают сайт, который не оказывает влияния на величину изоэлектрической точки, но который был мутирован для превращения этой последовательности в человеческую последовательность. Последовательность HFR1 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 93; последовательность HFR1, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 94; последовательность HCDR1 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 95; последовательность HCDR1, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 96; последовательность HFR2 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 97; последовательность HFR2, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 98; последовательность HCDR2 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 81; последовательность HCDR2, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 99; последовательность HFR4 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 100; последовательность HFR4, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 101; последовательность LFR1 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 102; последовательность LFR1, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 103; последовательность LCDR1 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 87; последовательность LCDR1, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 104; последовательность LFR2 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 105; последовательность LFR2, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 106; последовательность LCDR2 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 107; последовательности LCDR2, полученные после введения мутации, представлены в SEQ ID NO: 108 и 109; последовательность LFR3 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 110; последовательность LFR3, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 111; последовательность LFR4 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 112, а последовательность LFR4, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 113.

На фиг. 4 представлен график, иллюстрирующий нейтрализующую активность тоцилизумаба и H53/L28 в BaF/gp130.

На фиг. 5 представлен график, иллюстрирующий концентрацию тоцили