Моноклональное антитело против addl и его применения

Моноклональное антитело против addl и его применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

В соответствии с 35 USC § 119 U.S. по настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки № 61/364210, поданной 14 июля 2011.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, которые могут использоваться при лечении болезни Альцгеймера. Изобретение также относится к композициям, содержащим моноклональные антитела, и к способам применения композиций в качестве биомаркеров или для диагностики и лечения заболеваний, связанных с бета-амилоидом (Αβ) и диффундирующими лигандами, происходящими из Αβ (ADDL).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Болезнь Альцгеймера (AD) характеризуется прогрессирующей потерей когнитивной функции и накоплением бляшек бета-амилоида (Αβ) в областях, связанных с обучением и запоминанием. Несмотря на то, что одно время считали, что бляшки Αβ играют главную роль в патогенезе AD, растущее число доказательств, позволяет предположить, что диффундирующие лиганды, происходящие из Αβ (ADDL), могут быть ответственны за связанную с заболеванием нейрональную дисфункцию и снижение когнитивных способностей (Walsh and Selkoe, 2004, Protein Pept. Lett., 11:213-228). ADDL представляют собой небольшие, растворимые олигомеры Αβ, которые присутствуют в большом количестве при AD, но не в образцах нормального мозга (McLean et al., 1999, Ann. Neurol., 46: 860-866; Gong et al., 2003, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 100: 10417-10422). Исследования in vitro показали, что ADDL, выделенные из мозга при AD, или синтетические препараты связываются с субпопуляцией кортикальных и гиппокампальных нейронов (Gong et al., 2003; Klein et al., 2004, Neurobiol. Aging, 25: 569-580; Lacor et al., 2004, J. Neurosci., 24: 10191-10200; Shughrue et al., 2010, Neurobiol. Aging, 31:189-202), в то время как обнаруживали незначительное связывание или отсутствие связывания с препаратами фибриллярного, или мономерного Αβ (Lacor et al., 2004; Hepler et al., 2006, Biochemistry, 45: 15157-15167). Кроме того, связывание ADDL с нейронами можно уменьшить с помощью поликлональных (Gong et al., 2003) и моноклональных антител (Lee et al., 2006, J. Biol. Chem., 281:4292-4299; De Felice et al., 2007, Neurobiol. Aging 29: 1334-1347; Shughrue et al., 2010), вызванных против ADDL.

В моделях на грызунах центральное введение ADDL вызывает нарушения у грызуна долговременной потенциации (LTP) и формирования памяти (Walsh et al., 2002, Nature, 416: 535-539; Cleary et al., 2004, Nat. Neurosci., 8: 79-84; Klyubin et al., 2005, Nat. Med., 11: 556-561). Действие олигомеров на LTP ослаблялось, если ADDL вводили совместно с антителом против Αβ или вводили животным, которые были вакцинированы Aβ-пептидом (Rowan et al., 2004, Exp, Gerontol,, 39: 1661-1667). В трансгенной модели AD, такой как трансгенные мыши, которые продуцируют белок-предшественник амилоида (hAPP) человека, наблюдали возрастные когнитивные нарушения при наличии повышенных уровней ADDL (Westerman et al., 2002, J. Neurosci,, 22: 1858-1867; Ashe, 2005, Biochem, Soc. Trans., 33: 591-594; Lee et al., 2006; Lesne et al., 2006, Nature, 440: 352-357). При лечении мышей hAPP антителом против ADDL, наблюдали существенное улучшение когнитивной деятельности без сопутствующего уменьшения количества бляшек Αβ (Lee et al., 2006). Полученные результаты в совокупности позволяют предположить, что ADDL, но не бляшки Αβ, главным образом ответственны за когнитивное нарушение и что применение антител против ADDL может оказаться эффективным в лечении AD. См. также патенты США US 2006/0228349; US 7731962, международный патент WO 2007/050359; патент США US 2007/0218499, международный патент WO 2006/014478; патенты США US 7700099; US 2008/01758835, международный патент WO 2006/055178.

Таким образом, существует потребность в ADDL-селективных терапевтических антителах для профилактики и лечения AD. Настоящее изобретение отвечает указанным потребностям.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его фрагменту, способному к дифференциальному распознаванию многомерной конформации одного или более диффундирующих лигандов (ADDL), происходящих из β-амилоида, для лечения заболеваний, связанных с ADDL, таких как болезнь Альцгеймера (AD). Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим выделенное антитело по изобретению, либо самостоятельно, либо в сочетании с одним или более терапевтически активными средствами, носителями или разбавителями.

Настоящее изобретение также относится к способам применения выделенного антитела, таким как способы обнаружения ADDL в образце, ингибирования сборки ADDL, выявления терапевтических средств, которые предотвращают связывание ADDL с нейронами и ослабление симптомов заболевания, связанного с ADDL, и в качестве биомаркера, для применения в диагностике заболевания, связанного с ADDL или для обнаружения ADDL в образце.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 является графическим представлением анализа связывания ELISA панели гуманизированных (h3B3) и аффинно зрелых антител против ADDL (14.2, 7.2, 11.4, 9.2, 13.1, 17.1 и 19.3) и трех антител сравнения (Соед. 1, 2 и 3) с мономерным Αβ, ADDL и фибриллярным Αβ. Фоновый уровень в данном тесте определяли путем удаления захватывающего антитела из анализа ELISA (не mAb). Планки погрешностей представляют стандартную ошибку среднего.

Фигура 2 является графическим представлением анализа связывания ELISA антитела против ADDL 19.3 и антитела 3B3 с ADDL или с мономером Αβ (Αβ_1-40), оцениваемым с помощью 11-точечной титрационной кривой.

Фигура 3 является графическим представлением способности антитела против ADDL 19.3 и 3B3 блокировать связывание ADDL с гиппокампальными нейронами в первичной культуре после предварительной инкубации с возрастающей концентрацией антитела. Способность антитела против ADDL 19.3 блокировать связывание ADDL с нейронами уменьшалась после тепловой денатурации антитела. Планки погрешностей представляют стандартную ошибку среднего.

Фигуры 4A-4C представляют собой графические представления анализа связывания ELISA с ADDL антитела против ADDL 19.3 (обозначаемого как WT на фигуре 4A) и двух антител против ADDL, происходящих из 19.3 (фигуры 4B и 4C), после инкубации в течение одного месяца при различных температурах для оценки стабильности антитела. Антитела против ADDL, полученные из 19.3, содержали единичную аминокислотную замену Asn33 в CDR1 легкой цепи на Ser33 (19.3S33) или Thr33 (19.3T33) (SEQ ID NO:55 и 56, соответственно). Замена Asn33 на S33 (фигура 4B) или T33 (фигура 4C) приводила к увеличению стабильности антитела, по сравнению с исходным антителом 19.3.

Фигура 5 является графическим представлением связывания и диссоциации антител против ADDL с иммобилизованным FcRn человека, которые оценивали с помощью Biacore^TM (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Уточненная сенсограмма показывает начальное связывание при pH 6,0 и последующую диссоциацию антител при pH 7,3 от 180 секунд. Точку отчета (состояние равновесия) устанавливали на момент времени 5 секунд после окончания связывания при pH 6,0 и значение "% связывания" рассчитывали как

RU_{равновесие}/RU_{связывание}(%).

На фигуре 6A показано выравнивание вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела против ADDL 19.3 с зародышевой линии человека с определяющими комплементарность областями (CDR), указанными жирным шрифтом. Фигура 6B представляет собой трехмерную модель вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела 19.3, показывающую расположение CDR.

Фигура 7 является графическим представлением фармакокинетического профиля (PK) антител против ADDL 19.3 и 3B3, оцененным у гетерозиготных мышей 276 с FcRn человека (Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) после однократного внутривенного (IV) введения 10 мг/кг. Концентрацию антитела измеряли в различные интервалы времени, чтобы определить время полужизни (t_1/2) свободного антитела (19.3: 77±6 часов; 3B3 соответственно: 29±9 часов).

Фигура 8 является графическим представлением PK антитела против ADDL 19.3 (в сыворотке), которую оценивали у шести макак-резус после введения болюсной внутривенной (IV) или подкожной (SC) дозы 5 мг/кг. Время полужизни (t_1/2) 254±28 (274±9) часов было установлено после IV введения и 204±49 (219±52) часов после SC дозы.

Фигура 9 является графическим представлением PK антитела против ADDL 19.3, которую оценивали в цереброспинальной жидкости (CSF) приматов (три самца макак-резус) с применением модели подсоединения к мозжечково-мозговой цистерне макак-резус после введения болюсной IV дозы 5 мг/кг. Приблизительно через 48 часов после введения дозы антитело против ADDL 19.3 было представлено в CSF в 0,1% от концентрации в сыворотке.

Фигуры 10A-10D представляют собой изображения способности антитела против ADDL 19.3, в сопоставлении с двумя антителами сравнения (Соед. 1 и Соед. 2), проходить через гематоэнцефалический барьер в модели трансгенных мышей, которые сверхэкспрессируют белок-предшественник амилоида человека (hAPP). Мышам вводили внутривенно (IV) ¹²⁵I-меченное антитело против ADDL 19.3, или антитело сравнения, и собирали образцы крови, CSF и ткани мозга через два часа после введения дозы. Исходя из распределения радиоактивности, 0,02% антитела против ADDL 19.3 представлено в CSF (Фигура 10A), тогда как 0,19% наблюдали в ткани мозга (Фигура 10B). Аналогичные уровни получали в случае двух антител сравнения. Иммуноцитохимический анализ показал местонахождение антитела против ADDL 19.3 (фигура 10C, стрелки), и концентрирование антитела против ADDL 19.3 было видимым благодаря бляшкам (Фигура 10D). Антитело против ADDL l9.3 способно проникать в мозг и связывать ADDL.

На фигурах 11A-11C отображена способность антитела против ADDL 19.3 блокировать отложение ADDL в растущих бляшках в модели трансгенных мышей, которые сверхэкспрессируют hAPP. Биотинилированные ADDL (bADDL) вводили в гиппокамп 12-месячных мышей в течение четырех недель (одна инъекция в неделю) (фигура 11A) меченные существующие бляшки (только носитель: фигура 11B; антитело 19.3: фигура 11C, кружок). Иммуноцитохимический анализ применяли, чтобы оценить отложения нового вещества (ADDL) (фигуры 11B и 11C).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителам или антигенсвязывающему фрагменту, которые связывают диффундирующие лиганды, происходящие из β-амилоида (Aβ) (ADDL), т.е. к антителам против ADDL, и ослабляют связывание ADDL с нейронами. Результаты количественного клеточного анализа показали, что антитела против ADDL преимущественно связывали ADDL, уменьшали связывание ADDL с гиппокампальными нейронами, пересекали гематоэнцефалический барьер, и обладали улучшенным фармакокинетическим (PK) профилем.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которое связывает диффундирующие лиганды, происходящие из β-амилоида (ADDL), содержащему:

(a) вариабельную область легкой цепи, содержащую

(i) CDR1 с последовательностью Arg-Ser-Ser-Gln-Ser-Ile-Val-His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr-Leu-Glu (SEQ ID NO:1),

(ii) CDR2 с последовательностью Lys-Ala-Ser-Asn-Arg-Phe-Ser (SEQ ID NO:2), и

(iii) CDR3 с последовательностью Phe-Gln-Gly-Ser-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5 (SEQ ID NO:3), в которой Xaa1 представляет собой Arg, Lys или Tyr, Xaa2 представляет собой Val, Ala или Leu, Xaa3 представляет собой Pro, His или Gly, Xaa4 представляет собой Ala, Pro или Val, и Xaa5 представляет собой Ser, Gly или Phe; и

(b) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую

(i) CDR1 с последовательностью Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Phe-Gly-Met-His (SEQ ID NO:4),

(ii) CDR2 с последовательностью Tyr-Ile-Ser-Arg-Gly-Ser-Ser-Thr-Ile-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Thr-Val-Lys-Gly (SEQ ID NO:5), и

(iii) CDR3 с последовательностью Gly-Ile-Thr-Thr-Ala-Leu-Asp-Tyr (SEQ ID NO:6).

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу, или его антигенсвязывающему фрагменту, который связывает диффундирующие лиганды, происходящие из β-амилоида (ADDL), содержащему:

(a) вариабельную область легкой цепи, содержащую

(i) CDR1 с последовательностью Arg-Ser-Ser-Gln-Ser-Ile-Val-His-Ser-Xaa1-Gly-Xaa2-Thr-Tyr-Leu-Glu (SEQ ID NO:53), в которой Xaa1 представляет собой Asn, Ser, Thr, Ala, Asp или Glu, и Xaa2 представляет собой Asn, His, Gln, Ser, Thr, Ala или Asp;

(ii) CDR2 с последовательностью Lys-Ala-Ser-Xaa1-Arg-Phe-Ser (SEQ ID NO:54), в которой Xaa1 представляет собой Asn, Gln, Ser, Thr или Ala и

(iii) CDR3 с последовательностью Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Leu-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO:10); и

(b) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую

(i) CDR1 с последовательностью Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Phe-Gly-Met-His (SEQ ID NO:4),

(ii) CDR2 с последовательностью Tyr-Ile-Ser-Arg-Gly-Ser-Ser-Thr-Ile-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Thr-Val-Lys-Gly (SEQ ID NO:5), и

(iii) CDR3 с последовательностью Gly-Ile-Thr-Thr-Ala-Leu-Asp-Tyr (SEQ ID NO:6).

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу, которое связывает ADDL, а именно к антителу против ADDL, или его антигенсвязывающему фрагменту с вариабельной областью легкой цепи CDR3, которая выбрана из группы, состоящей из 17.1 с последовательностью Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Val-Pro-Ala-Ser (SEQ ID NO:7), 14.2 с последовательностью Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Val-Pro-Pro-Gly (SEQ ID NO:8), 13.1 с последовательностью Phe-Gln-Gly-Ser-Lys-Ala-His-Pro-Ser (SEQ ID NO:9), 19.3 с последовательностью Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Leu-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO:10), 7.2 с последовательностью Phe-Gln-Gly-Ser-Tyr-Ala-Pro-Pro-Gly (SEQ ID NO:11), 9.2 с последовательностью Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Ala-Pro-Pro-Phe (SEQ ID NO:12) и 11.4 с последовательностью Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Val-Pro-Val-Arg (SEQ ID NO:13). В подварианте осуществления изобретения вариабельная область легкой цепи CDR3 представляет собой SEQ ID NO:10.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения выделенное антитело против ADDL также содержит вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:15 и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:17.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения выделенное антитело против ADDL также содержит константную область тяжелой цепи SEQ ID NO:21.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выделенное антитело против ADDL представляет собой моноклональное антитело.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей выделенное антитело против ADDL, или его антигенсвязывающий фрагмент в смеси с фармацевтически приемлемым носителем.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу уменьшения связывания ADDL с нейроном, включающему приведение в контакт нейрона с выделенным антителом против ADDL, или его антигенсвязывающим фрагментом так, что связывание диффундирующих лигандов, происходящих из Αβ, с нейроном ослабляется.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу ингибирования сборки ADDL, включающему приведение в контакт образца, содержащего 1-42 пептида β-амилоида с выделенным антителом против ADDL, или его антигенсвязывающим фрагментом, ингибирующее таким образом сборку ADDL.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу ингибирования фосфорилирования тау-белка по Ser202/Thr205, включающему приведение в контакт образца, содержащего тау-белок с выделенным антителом против ADDL, или его антигенсвязывающим фрагментом, ингибируя таким образом фосфорилирование тау-белка по Ser202/Thr205.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу ослабления симптомов заболевания, связанного с ADDL, включающему введение пациенту, который в этом нуждается, эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей выделенное антитело против ADDL или его антигенсвязывающий фрагмент.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу идентификации предполагаемого терапевтического средства, которое уменьшает связывание диффундирующих лигандов, происходящих из β амилоида (ADDL), с нейронами, включающему:

(a) приведение в контакт композиции, содержащей нейрон, с ADDL в присутствии средства;

(b) приведение в контакт композиции с выделенным антителом против ADDL, или с его антигенсвязывающим фрагментом; и

(c) определение количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента, связанного в присутствии средства,

где уменьшение количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента, связанного в присутствии средства, по сравнению с количеством антитела, связанного в отсутствии средства, показывает, что средство является предполагаемым терапевтическим средством для уменьшения связывания ADDL с нейронами.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу обнаружения ADDL в образце, включающему приведение в контакт образца с выделенным антителом против ADDL, или с его антигенсвязывающим фрагментом, и определение наличия комплекса, содержащего ADDL и указанное антитело, или антигенсвязывающий фрагмент.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу диагностики заболевания, связанного с ADDL, включающему приведение в контакт образца с выделенным антителом против ADDL, или его антигенсвязывающим фрагментом, и определение наличия комплекса, содержащего ADDL и указанное выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, где наличие указанного комплекса является диагностическим для заболевания, связанного с ADDL.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к набору для обнаружения ADDL, включающему выделенное антитело против ADDL, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывает ADDL.

Моноклональные антитела, которые селективно распознают многомерные конформации диффундирующих лигандов, происходящих из Αβ (ADDL), известны в данной области (см. патент США №7780963, патент США № 7731962 и патент США № 7811563, которые включены в описание в качестве ссылки в полном объеме), и, как показано, уменьшают связывание ADDL с нейронами в клеточных анализах. Антитела против ADDL способны различать экстракты мозга людей с болезнью Альцгеймера (AD) и контрольные экстракты мозга человека, могут идентифицировать эндогенные олигомеры в срезах мозга AD и на гиппокампальных клетках, и могут нейтрализовать эндогенные и синтетические ADDL в растворе. Антитела против ADDL специфически связываются с одной или более многомерными конформациями ADDL, связывают определенные ADDL, получаемые в результате олигомеризации Αβ42, и в то же время обладают пониженной аффинностью в отношении других пептидов Αβ, включая Αβ1-40.

Настоящее изобретение относится к антителам против ADDL, в особенности к антителам 17.1, 14.2, 13.1, 19.3, 19.3T33, 19.3S33, 7.2, 9.2 и 11.4, которые, предпочтительно, связывают ADDL и которые были описаны по их специфичности и селективности в отношении ADDL. Важно, что специфичность и селективность указанных антител против ADDL по настоящему изобретению не являлись прогнозируемыми на основе линейного эпитопа Αβ, с которым они связывались, указанная активность не являлась прогнозируемой на основе их способности обнаруживать ADDL при вестерн-блоттинге, или на основе их способности обнаруживать иммуно-окрашенные ADDL, связанные с нейронами. Кроме того, избирательная способность антител против ADDL по настоящему изобретению нейтрализовывать ADDL и блокировать связывание с первичной культурой гиппокампальных нейронов поддерживает предположение, что антитела против ADDL действуют путем связывания с более подходящим, конформационным эпитопом, что предотвращает связывание ADDL с нейронами. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, антитело против ADDL 19.3, не только блокировало связывание ADDL с первичной культурой нейронов, но также уменьшало ADDL-индуцированные изменения морфологии шипиков гиппокампальных клеток, показатель того, что сопротивление против связывания ADDL с нейронами имеет значительные физиологические последствия, например, выживание нейронов, взаимосвязь нейронов и передача сигнала. Антитело против ADDL 19.3 также обладало улучшенным фармакокинетическим (PK) профилем, по сравнению с ранее известным антителом против ADDL, 3B3, когда его оценивали в моделях in vitro и in vivo. Кроме того, при введении трансгенным мышам, которые сверхэкспрессируют форму белка-предшественника амилоида (hAPP) человека, антитело против ADDL 19.3, как показано, проникает через гематоэнцефалический барьер и концентрируется в мозге. Поскольку ADDL локализуются в мозге и оказывают негативное влияние, поражая нейрональную функцию, специалисту в данной области понятно и известно, что проникновение и концентрирование антитела в мозге было бы полезным при иммунотерапии. В совокупности, указанные данные показывают, что селективные антитела против ADDL, такие как антитело 19.3, могут блокировать связывание ADDL с гиппокампальными нейронами, которые играют критическую роль в процессах обучения и памяти.

Полезность антител против ADDL в лечении AD основана на растущем числе данных, которые позволяют предположить, что ADDL, а не амилоидные бляшки как таковые, играют фундаментальную роль в снижении когнитивных способностей, связанных с данным заболеванием (Walsh and Selkoe, 2004, Protein Pept. Lett.,11: 213-228). ADDL возрастают в мозге при AD, и вызывают снижение показателей в поведенческих и электрофизиологических конечных критериях оценки при центральном введении у грызунов (Walsh, et al., 2002, Nature, 416: 535-539; Cleary, et al., 2004, Nat. Neurosci., 8: 79-84; Klyubin, et al., 2005, Nat. Med., 11: 556-561; Balducci, et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107: 2295-2300). Дефицит обучения и памяти также наблюдали в модели мышей, экспрессирующих hAPP, с наступлением ухудшения, связанного с возрастающими уровнями ADDL (Westerman, et al., 2002, J. Neurosci., 22: 1858-1867; Ashe, 2005, Biochem. Soc. Trans., 33: 591-594; Lee, et al., 2005, J. Biol. Chem., 281: 4292-4299; Lesne, et al., 2006, Nature, 440: 352-357). Несмотря на то, что клеточные и субклеточные явления, которые опосредуют указанные эффекты на когнитивную деятельность, не изучены полностью, очевидно, что ADDL связываются с синаптическими окончаниями, расположенными на дендритных отростках гиппокампальных нейронов (Lacore, et al., 2004, J. Neurosci., 24: 10191-1022) и изменяют морфологию и количество дендритных шипиков (Lacor et al., 2007, J. Neurosci., 27: 796-807; Shankar, et al., 2007, J. Neurosci., 27: 2866-2875; Shughrue, et al., 2010, Neurobiol. Aging. 31: 189-202). Полученные данные о том, что ADDL связываются с ГАМК-эргическими и глутаматергическими нейронами в гиппокампе (Shughrue, et al., 2010), нейронами критически вовлеченными в процессы обучения и памяти, что приводит к интернализации AMPA-рецепторов (Zhao, et al., 2010, J. Biol. Chem., 285: 7619-7632) также подтверждают предположение, что ADDL прямо или косвенно модулируют указанные нейротрансмиттерные системы (см., например, Venkitaramani, et al., 2007, J. Neurosci., 27: 11832-11837).

В настоящем изобретении панель антител против ADDL, полученных из антитела против ADDL, 3B3 (патент США №7780963 и патент США №7811563, которые включены в описание в качестве ссылки в полном объеме), оценивали по их способности блокировать связывание ADDL в культуре первичных гиппокампальных нейронов. Отобранные моноклональные антитела затем гуманизировали и подвергали аффинному созреванию для дальнейшего описания. Ведущие антитела, отобранные благодаря своей способности связываться с ADDL, затем оценивали в одной концентрации с использованием трехдорожкового теста ELISA для определения связывания антитела с мономерным Αβ, ADDL и фибриллярным Αβ. Как показано на фигуре 1, шесть из семи антител против ADDL со зрелой аффинностью, в особенности антитела 14.2, 7.2, 11.4, 13.1, 17.1 и 19.3 являлись ADDL-предпочтительными, по сравнению с мономерным Αβ и фибриллярным Αβ. Затем использовали одиннадцатиточечную титрационную кривую и ELISA для определения аффинности связывания антител против ADDL с ADDL и мономерным Αβ (Αβ1-40) в широком диапазоне концентраций. Как показано на фигуре 2, антитела против ADDL 3B3 и 19.3 являлись высоко ADDL-селективными. Кроме того, антитела сравнивали в клеточном анализе связывания для определения способности антител блокировать связывание ADDL с нейронами. Как показано на фигуре 3, ADDL, предварительно инкубированные с повышенными концентрациями антител против ADDL 3B3 и 19.3, добавляли в первичную культуру гиппокампальных нейронов, и использовали титрационную кривую для количественного представления способности антитела блокировать связывание ADDL с нейронами. В совокупности указанные результаты показывают, что антитела против ADDL серьезно ослабляют связывание с нейронами в клеточном формате.

Определение аминокислотной последовательности проводили для идентификации потенциальных сайтов деамидирования. Остатки аспарагина и аспарагиновой кислоты, представленные в CDR терапевтических антител, как известно, подвергаются деамидированию с образованием изоаспартата (Valsak and Ionescu, 2008, Curr.Pharm.Biotech., 9:468-481; Aswad et al., 2000, J. Pharm.Biomed.Anal., 21: 1129-1136), образование которого может изменять эффективность связывания антитела и, в свою очередь, уменьшать эффективность антитела при использовании в качестве лекарства. Таким образом, специалисту в данной области следует понимать и учитывать, что присутствие аспарагина и аспарагиновой кислоты в CDR для антитела 19.3 нежелательно. Таким образом, заявители изменяли остаток аспарагина в положении 33 CDR1 легкой цепи для оптимизации стабильности антитела против ADDL 19.3 (Таблица 4B). Создавали производные антитела 19.3 с заменой серином (SEQ ID NO:55), треонином (SEQ ID NO:56) или глутаминовой кислотой (SEQ ID NO:67) аспарагина в положении 33 (SEQ ID NO:1) в CDR1. Также производили замену аспарагиновой кислотой (SEQ ID NO:68) аспарагина в положении 33 в качестве контроля. Указанные изменения будут устранять возможность деамидирования аспарагина в положении 33 в CDR1. Производные 19.3 получали, как описано в Примере 3 и оценивали, как описано в Примере 4, как и производные с заменой серином (SEQ ID NO:55), треонином (SEQ ID NO:56), глутаминовой кислотой (SEQ ID NO:67), и аспарагиновой кислотой (SEQ ID NO:68), для определения стабильности новых конструкций. Как показано на фигурах 4B и 4C, соответственно, два характерных производных, 19.3S33 (SEQ ID NO:55) и 19.3T33 (SEQ ID NO:56), обладали повышенной стабильностью связывания по результатам месячной инкубации при различных температурах. Другие аминокислотные замены в CDR1 легкой цепи для аспарагина в положениях 33 и 35 (SEQ ID NO:53) и в CDR2 легкой цепи для аспарагина в положении 58 (SEQ ID NO:54) представлены в таблицах 4B и 4C для последующей оценки.

Для определения фармакокинетики аффинно зрелых антител против ADDL по настоящему изобретению проводили серии исследований in vitro и in vivo. Показано, что связывание антител с рецептором FcRn при pH 6,0 прогнозируется по периоду полувыведения антитела у человека (Zalevsky, et al., 2010, Nat. Biotech. 28(2): 157-159) и при pH 7,3 (USSN 61/307182). Связывание и диссоциацию антител против ADDL по настоящему изобретению с иммобилизованным FcRn человека оценивали с помощью анализа взаимодействия со свободной меткой, такого как анализ предлагаемый Biacore^TM Life Sciences, Biacore^TM T-100 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Скорректированную сенсограмму используют, чтобы показать начальное связывание при pH 6,0 и затем диссоциацию антител при pH 7,3 от 180 секунд. Точку отчета (состояние равновесия) устанавливали на момент времени 5 секунд после окончания связывания при pH 6,0 и "% связывания" рассчитывали как RU_{равновесие}/RU_{связывание} (%). Как показано на фигуре 5, скорость диссоциации в случае гуманизированного 3B3 была значительно ниже, чем у семи антител против ADDL по настоящему изобретению, которые включали антитело 19.3 и три антитела сравнения. Поскольку низкая скорость диссоциации считается индикатором слабой PK in vivo, проводили дополнительное исследование in vivo на FcRn-трансгенных мышах (гетерозиготные по FcRn 276 человека мыши, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). Когда FcRn-трансгенным мышам вводили 10 мг/кг внутривенно (IV) либо антитело против ADDL 3B3, либо 19.3, то обнаруживали существенное различие в фармакокинетике. Как показано на фигуре 7, время полужизни (t_1/2) антитела против ADDL 3B3 являлось относительно небольшим (29±9 часов), что соответствовало прогнозу на основе данных, полученных in vitro с помощью Biacore^TM, тогда как время полужизни антитела против ADDL 19.3 было значительно ниже (77±6 часов). В целом, низкая PK, как видно в случае антитела 3B3, будет препятствовать дальнейшему усовершенствованию антитела при использовании в качестве терапевтического средства, вследствие его низкой биодоступности.

Для подтверждения прогнозируемого времени полужизни антитела против ADDL 19.3 у приматов, проводили исследование фармакокинетики у приматов для определения антитела в группе макак-резус с подсоединением к мозжечково-мозговой цистерне. Животным вводили однократную внутривенную (IV) болюсную или подкожную (SC) инъекцию антитела против ADDL 19.3 (5 мг/кг) и собирали образцы крови после введения антитела. Одновременно собирали образцы CSF из порт-системы, соединенной с мозжечково-мозговой цистерной, в установленные интервалы времени и концентрацию антитела против ADDL 19.3 определяли в сыворотке и в CSF с помощью теста ELISA с применением античеловеческого IgG. При введении животным антитела против ADDL 19.3 путем однократной IV болюсной инъекции, наблюдали t_1/2 254±28 часов (фигура 8), в то время как при подкожном введении получали t_1/2 204±49 часов. Кроме того, заявители обнаружили, что антитело против ADDL 19.3 способно переходить в CSF приматов, где его концентрация возрастала в течение первых 48 часов и достигала максимума приблизительно 0,1% введенного антитела (фигура 9).

Для определения количества антитела, которое проникает через гематоэнцефалический барьер и поступает в CSF и мозг, антитело против ADDL 19.3 и два антитела сравнения (Соед. 1 и Соед. 2) метили ¹²⁵I и вводили старым (двенадцатимесячным) мышам, которые сверхэкспрессировали hAPP, моделируя AD на грызунах. Через два часа после IV введения, приблизительно 0,02% антитела 19.3 наблюдали в CSF (фигура 10A), в то время как приблизительно 0,19% антитела 19.3 обнаруживали в мозге (фигура 10B). Аналогичные уровни наблюдали в случае двух антител сравнения (фигура 10A и 10B). При проведении иммуноцитохимического анализа срезов мозга мышей, получавших препарат, и определении местонахождения антитела против ADDL 19.3 (стрелка на фигуре 10C), наблюдали накопление антитела, связанного с депонированием Αβ, в бляшках (фигура 10D). Данный факт продемонстрировал, что антитело против ADDL 19.3 проникало в CSF и накапливалось в мозге. Недавно показано, что экзогенные ADDL откладывались в бляшках при введении мышам, которые сверхэкспрессировали hAPP (Caspar, et al., 2010, Exp. Neurol., 223: 394-400). Таким образом, полученные данные подтверждали, что локализованное антитело против ADDL l9.3, связанное с циркулирующими ADDL, связано с бляшками.

Для дальнейшей оценки эффективности in vivo антител против ADDL, способность антитела 19.3 блокировать депонирование ADDL в растущих бляшках оценивали у hAPP-трансгенных мышей после четырех еженедельных инфузий биотинилированных ADDL (bADDL) в гиппокамп 12-месячных мышей для маркирования существующих бляшек (Фигура 11A). Затем животные получали четыре еженедельные внутривенные инфузии антитела 19.3 (Фигура 11A). Депонирование нового вещества (ADDL) в растущих бляшках оценивали с помощью иммуноцитохимического анализа. Как видно на фигурах 11B и 11C, антитело против ADDL 19.3 существенно снижало депонирование ADDL на периферии существующих бляшек (фигура 11C), по сравнению с мышами, получавшими только носитель (фигура 11B). В совокупности, указанные результаты показали, что антитело против ADDL, в особенности антитело 19.3, способно проходить через гематоэнцефалический барьер, связывать ADDL, и блокировать депонирование нового вещества в растущих бляшках.

Связывание ADDL также может оказывать долговременные эффекты на нейроны. Недавние исследования показали, что связывание ADDL с гиппокампальными нейронами может инициировать сигнальный каскад, который приводит к гиперфосфорилированию тау-белка (De Felice, et al., 2006, Neurobiol. Aging, 29: 394-400). Также показано, что один компонент указанного сигнального каскада, GSK-3β, модулируется связыванием ADDL in vivo и in vitro (Ma, et al., 2006, J. Neurosci. Res., 83: 374-384). Ma, et al., 2006, обнаружили, что пассивная иммунизация мышей hAPP антителом, которое уменьшало количество ADDL, также снижала уровни GSK-3β и фосфорилирование тау-белка в коре головного мозга. Указанный факт служит доказательством связи между Αβ и фосфорилированным тау-белком и позволяет предположить, что связывание ADDL может запускать события, которые приводят к внутриклеточной агрегации тау-белка. Кроме того, полученные данные позволяют предположить, что антитела, которые предотвращают связывание ADDL с нейронами и связанную потерю синаптических шипиков, такие как антитела по настоящему изобретению, могли бы уменьшать когнитивные и/или патологические последствия, связанные с болезнью Альцгеймера и родственные заболевания.

Моноклональные антитела, которые избирательно распознают многомерные конформации диффундирующих лигандов, происходящих из Αβ, т.е. ADDL, теперь созданы. Указанные антитела являлись гуманизированными и, в некоторых вариантах осуществления, аффино зрелыми. Антитела успешно распознают экстракты мозга человека с болезнью Альцгеймера и контрольные экстракты мозга человека, и обнаруживают эндогенные олигомеры в срезах мозга при болезни Альцгеймера и в культивируемых гиппокампальных клетках. Кроме того, антитела по настоящему изобретению нейтрализуют эндогенные и синтетические ADDL в растворе. Так называемые "синтетические" ADDL получают in vitro смешиванием очищенных Αβ1-42 в условиях, которые порождают ADDL. См. патент США № 6218506. Антитела, раскрытые в описании, проявляют высокую степень селективности в отношении ADDL, при минимальном обнаружении мономерного соединения Αβ. Кроме того, указанные антитела избирательно блокируют способность ADDL-содержащих препаратов связывать первичные культуры гиппокампальных нейронов крыс и иммортализованные клеточные линии нейробластомы, и также блокировать сборку ADDL. Данный факт показывает, что указанные антитела обладают различной способностью распознавать многомерную конформацию ADDL, несмотря на сходное распознавание линейных последовательностей и сходные аффинности. Поскольку ADDL, как известно, связываются с субпопуляцией нейронов и нарушают нормальную нейрональную функцию, антитела по настоящему изобретению находят применение в предотвращении связывания ADDL с нейронами и сборке ADDL и, в свою очередь, могут использоваться для лечения ADDL-связанных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу, которое избирательно распознает одну или более многомерных конформаций ADDL. "Выделенное" антитело по настоящему изобретению относится к антителу, которое по существу свободно от других антител. Однако молекула может включать некоторые дополнительные средства или функциональные группы, которые не оказывают отрицательного воздействия на основные характеристики антитела (например, специфичность связывания, нейтрализующая активность и т.п.).

Антитело, которое способно к специфическому связыванию с одной или более многомерными конформациями ADDL, связывается с определенным ADDL, получаемым в результате олигомеризации Αβ1-42, но не дает перекрестной реакции с другими Αβ пептидами, а именно Αβ1-12, Αβ1-28, Αβ1-40 и Αβ12-28, что определяли с помощью анализов вестерн-блот, как раскрыто в описании, и преимущественно связывает ADDL в растворе. Специфическое связывание между двумя частицами, как правило, относится к значениям аффинности по меньшей мере 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ или 10¹⁰ M^-1. Значения аффинности выше чем 10⁸ M^-1 желательны для достижения специфического связывания.

В конкретных вариантах осуществления, также получают антитело, которое способно к специфическому связыванию с многомерной конформацией одного или более ADDL, т.e. животное иммунизируют многомерными конформациями ADDL. В других вариантах осуществления, антитело, которое способно к специфическому связыванию с многомерной конформацией одного или более ADDL, получают против пептида, образующего полимер с низким значением n-mer, такого как Aβ1-42[Nle35-Dpro37].

Термин "эпитоп" обозначает участок антигена, на который отвечают B- и/или T-клетки или участок молекулы, против которого будет продуцироваться антитело и/или с которым антитело будет связываться. Например, эпитоп может распознаваться антителом, определяющим эпитоп.

Линейный эпитоп представляет собой эпитоп, в котором первичная аминокислотная последовательность содержит распознаваемый эпитоп. Линейный эпитоп обычно включает по меньшей мере 3, и еще чаще, по меньшей мере 5, например, приблизительно 6-10 аминокислот в уникальной последовательности.

Конформационный эпитоп, в отличие от линейного эпитопа, представляет собой эпитоп, в котором первичная последовательность аминокислот, содержащая эпитоп не является единственным определяющим компонентом распознаваемого эпитопа (например, эпитопа, в котором первичная последовательность аминокислот необязательно распознается антителом, определяющим эпитоп). Обычно конформационный эпитоп охватывает большее число аминокислот, чем линейный эпитоп. Что касается распознавания конформационных эпитопов, антитело распознает трехмерную структуру пептида или белка. Например, когда белковая молекула складывается с образованием трехмерной структуры, определенные аминокислоты и/или полипептидная основная цепь, формирующая конформационный эпитоп, сближаются, что дает возможность антителу распознать эпитоп. Способы определения конформации эпитопов включают, но без ограничения, например, рентгеноструктурный анализ, двумерную ядерную магнитно-резонансную спектроскопию