Нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы, защищающие детей против желудочно-кишечных инфекций

Нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы, защищающие детей против желудочно-кишечных инфекций

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к нереплицирующимся пробиотическим микроорганизмам и оказываемой ими пользе для здоровья. В частности, настоящее изобретение предоставляет средство, помогающее родителям защищать их детей от желудочно-кишечных инфекций, в частности от диареи. Одно воплощение настоящего изобретения относится к композиции, содержащей нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы, предназначенные для применения в профилактике или терапии желудочно-кишечных инфекций у детей.

Организмы, производящие в качестве главного метаболического компонента молочную кислоту, известны на протяжении длительного времени. Эти бактерии могут быть найдены в молоке или соответственно на молочных заводах, на живых или разлагающихся растениях, а также в кишечнике человека и животных. Эти микроорганизмы, совокупно именуемые термином «молочнокислые бактерии», представляют довольно неоднородную группу и содержат, например, роды Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Pediococcus и т.д.

Молочнокислые бактерии применяются в качестве сбраживающих средств для сохранения пищевых продуктов, получающих выгоды от низкого pH и действия продуктов ферментации, вырабатываемых в ходе ферментативной активности, с тем, чтобы замедлить рост бактерий, вызывающих порчу. Кроме того, молочнокислые бактерии также используются для приготовления из молока множества различных пищевых продуктов, таких как сыры, йогурты и другие ферментированные молочные продукты. Совсем недавно молочнокислые бактерии стали привлекать повышенное внимание в связи с обнаружение того, что некоторые штаммы демонстрируют ценные качества при приеме внутрь человеком или животным. В частности, нашли, что определенные штаммы Lactobacillus или Bifidobacterium способны колонизировать слизистую оболочку кишечника и содействовать обеспечению хорошего самочувствия человека или животного.

В этом отношении EP 0768375 раскрывает специфические штаммы рода Bifidobacterium, которые способны внедряться в кишечную флору и могут удерживаться на кишечных клетках. Сообщается, что эти Bifidobacteria, обладая способностью конкурентно исключать адгезию к кишечным клеткам патогенных бактерий, тем самым помогают в иммуномодуляции и поддержании здоровья человека.

Также исследования сосредоточилось на потенциале применения молочнокислых бактерий в качестве пробиотических агентов. Пробиотиками считаются жизнеспособные микробные препараты, которые способствуют поддержанию здоровья индивидуума посредством сохранения естественной микрофлоры кишечника. Полагают, что пробиотики прикрепляются к слизистой оболочке кишечника, колонизируют кишечный тракт и таким образом препятствуют закреплению на ней вредных микроорганизмов. Критически важное условие для осуществления их активности состоит в том, что они должны достичь слизистой оболочки кишечника в надлежащей и жизнеспособной форме и не разрушались бы в верхней части желудочно-кишечного тракта, в частности под действием преобладающего в желудке низкого pH.

При этом часть исследовательских усилий направлена на обеспечение новых штаммов пробиотических бактерий, способных показывать новые полезные свойства для людей и/или животных, таких как домашние животные.

В этом отношении патент США 6998119 B1 относится к применению непатогенного Bifidobacterium CNCM 1-2168 для приготовления носителя, предназначенного для терапии или профилактики диареи, вызванной ротавирусами.

В патенте США 2005260170 A1 указывается, что Bifidobacterium longum CNCM I-2169 и Bifidobacterium longum CNCM I-2170 продемонстрировали способность препятствовать колонизации кишечных клеток вызывающими диарею бактериями, такими как патогенная Е.coli, например, энтеропатогенная Е.coli (ЕРРС) или сальмонелла, например, Salmonella typhimuriurm.

Желудочно-кишечные инфекции, такие как, например, диарея, являются очень дискомфортными могут даже сопровождаться лихорадкой, болью в желудке и рвотой. Они могут длиться в течение около одной-двух недель и в несложных случаях обычно прекращаются без лечения.

Доступны противодиарейные средства, но в общем случае их следует избегать, особенно детьми, помимо случаев рекомендования доктором.

Следовательно, было бы желательно наличие композиции, которая помогала бы родителям защищать их детей против диареи. Такая композиция должна быть несложной в приготовлении, а ее активность должна сохраняться высокой даже в условиях возможного хранения продукта в течение длительного времени. Такая композиция должна позволять безопасное осуществление терапии или профилактики желудочно-кишечных инфекций без побочных эффектов. Должна быть снижена продолжительность протекания диареи и/или уменьшено время, требующееся для выздоровления от диареи. Также должен быть снижен риск приобретения диареи.

То есть цель настоящего изобретения состоит в обеспечении в данной области композиции, которая обращалась бы к одной или нескольким представленным выше потребностям.

Авторы настоящего изобретения с удивлением обнаружили, что они могут достигнуть этого с помощью объектов независимых пунктов формулы изобретения. Основную идею настоящего изобретения развивают дополнительные пункты формулы изобретения.

Соответственно, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы, предназначенные для применения в профилактике или терапии желудочно-кишечных инфекций у детей.

Настоящее изобретения также относится к применению нереплицирующихся пробиотических микроорганизмов для приготовления композиции, предназначенной для профилактики или терапии желудочно-кишечных инфекций у детей.

Дети могут быть человеческими детьми или детенышами животных. Детеныши животных включают, в частности, домашних животных, например собак и кошек.

Человека или животное считают ребенком до тех пор, пока не достигается взрослое состояние.

У людей дети имеют возраст вплоть до 18 лет. Дети младше 12 месяцев являются младенцами.

«Нереплицирующиеся» пробиотические микроорганизмы включают пробиотические бактерии, подвергнутые тепловой обработке. Они включают микроорганизмы, которые являются инактивированными, мертвыми, нежизнеспособными и/или присутствующими в виде фрагментов, таких как ДНК, метаболиты, цитоплазматические соединения или материалы клеточной оболочки.

«Нереплицирующиеся» означает, что никаких жизнеспособных клеток и/или колониеобразующих единиц классическими методами культивирования обнаружено быть не может. Такие классические методы культивирования сведены воедино в книге по микробиологии James Monroe Jay, Martin J. Loessner, David A. Golden. 2005. Modern food microbiology («Современная микробиология пищевых продуктов»). 7 издание, Springer Science, Нью-Йорк, N.Y. 790 стр. Как правило, отсутствие жизнеспособных клеток может быть показано следующим образом: отсутствие каких-либо видимых колоний на чашках с агаровой средой или отсутствие возрастающего помутнения в жидкой среде для выращивания после засева бактериальными препаратами в различных концентрациях («нереплицирующиеся» образцы) и выдерживания в подходящих условиях (аэробная и/или анаэробная атмосфера на протяжении по меньшей мере 24 час).

Пробиотики для целей настоящего изобретения определяются как «препараты микробиологических клеток или компоненты микробиологических клеток, обладающие благотворным воздействием на состояние здоровья или самочувствие организма». (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. и др. "Probiotics: how should they be defined" («Пробиотики: как их следует определять») Trends Food Sci. Technol. 1999: 10 107-10).

Возможность применения нереплицирующихся пробиотических микроорганизмов предлагает несколько преимуществ. У младенцев или маленьких детей с серьезными иммунными нарушениями применение живых пробиотиков может быть ограничено исключительными случаями, обусловленными наличием потенциального риска развития бактериемии. Нереплицирующиеся пробиотики могут применяться безо всяких проблем.

Помимо этого, снабжение нереплицирующимися пробиотическими микроорганизмами делает возможным восстановление в горячей воде при сохранении полезных для здоровья качеств.

Композиция настоящего изобретения может быть любым видом композиции, подходящей для введения людям или домашним животным. Соответственно, данная композиция может быть пищевым продуктом, кормовым продуктом для домашнего животного, нутрицевтиком, пищевой добавкой, порошкообразной питательной композицией, добавкой к пищевому продукту или напитком.

Желудочно-кишечная инфекция может быть диареей. Диарея может быть, например, острым вирусным гастроэнтеритом или острой воспалительной диареей.

Так как желудочно-кишечные инфекции обычно ассоциируются с дискомфортом и иногда со смущением, имеется необходимость в защите детей против желудочно-кишечных инфекций.

Авторы данного изобретения с удивлением обнаружили, что, например, в отношении укрепления иммунной системы и/или с точки зрения противовоспалительного действия нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы могут быть даже более эффективными, чем реплицирующиеся пробиотические микроорганизмы.

Помимо этого, нереплицирующиеся, подвергнутые тепловой обработке La1 (NCC533, депозитарный номер CNCM I-1225) вызвали выраженную экспрессию дефензина. Дефензины представляют один из наиболее важных классов антимикробных пептидов у людей. Дефензины вырабатываются эпителиальными клетками легких, кожи, полости рта, мочеполового, дыхательного и желудочно-кишечного тракта. Среди них имеется семейство β-дефензинов, включающее дефензин 1 (hBD1) и 2 (hBD2). Например, было найдено, что подвергнутый тепловой обработке L. johnsonii (La1, NCC 533, депозитарный номер CNCM I-1225) активирует hBD1 более сильно, чем его живая копия. HBD1 демонстрирует антибактериальную активность против широкого спектра бактерий, включая Е.coli и Pseudomonas aeruginosa, Н.pylori (Nuding, S., и др., 2009, Microbes. Infect. 11: 384-393) и также против дрожжевых грибков, таких как Candida albicans (O'Neil, D.A. 2003, Mol. Immunol 40:445-450) и вирусов (вирус иммунодефицита человека) (Kota, S. и др., 2008, J. Biol. Chem 283: 22417-22429). Таким образом, эти антимикробные пептиды укрепляют мукозальный барьер и тем самым ограничивают бактериальную адгезию и инвазию.

Соответственно, композиция настоящего изобретения может быть предназначена для применения в целях защиты детей от желудочно-кишечных инфекций.

В частности, композиция настоящего изобретения предоставляет родителям возможность защитить их детей от желудочно-кишечных инфекций.

Композиция настоящего изобретения может также применяться для укрепления способности ребенка бороться с желудочно-кишечными инфекциями. Это особенно важно, так как активный образ жизни детей исключительно важен для их развития, но при этом также подразумевает контакт со многими возможными источниками инфекций. Сильные защитные механизмы против нежелательных инфекций будут содействовать их хорошему самочувствию.

Следовательно, композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть также предназначена для применения в целях содействия в менее частом приобретении детьми желудочно-кишечных инфекций. Вероятность приобретения желудочно-кишечных инфекций может быть снижена по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30% или предпочтительно по меньшей мере на 50%.

Улучшенные противовоспалительные свойства, улучшенная способность к укреплению иммунитета композиций настоящего изобретения и/или повышенная экспрессии дефензина композицией настоящего изобретения усиливают защитные механизмы, приводя к меньшему количеству желудочно-кишечных инфекций.

Композиция настоящего изобретения также может быть предназначена для применения в целях сокращения времени протекания желудочно-кишечных инфекций. Например, продолжительность желудочно-кишечных инфекций, таких как диарея, может быть снижена по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30% или предпочтительно по меньшей мере на 50%.

Лечение детей антидиарейными препаратами обычно не рекомендуются, за исключения случаев полученных от медицинского персонала указаний. Нереплицирующиеся пробиотики настоящего изобретения предлагают безопасную и естественную альтернативу таким антидиарейными препаратам.

Композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть также предназначена для применения в целях содействия более быстрому выздоровлению детей после желудочно-кишечных инфекций. После преодоления желудочно-кишечной инфекции организм в типичном случае все еще остается несколько ослабленным и должен быть адаптирован к нормальному питанию с осторожностью. Композиция настоящего изобретения может использоваться для значительного ускорения этой фазы адаптации. Например, время, требующееся ребенку для восстановления после желудочно-кишечных инфекций, может быть снижено по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30% или предпочтительно по меньшей мере на 50%.

Композиция настоящего изобретения может также содержать пребиотики. Пребиотики могут поддерживать рост пробиотиков до того, как те переводятся в нереплицирующееся состояние. Под «пребиотиком» подразумеваются неусваиваемые пищевые материалы, которые поддерживают рост полезных для здоровья микроорганизмов и/или пробиотиков в кишечнике. Они не подвергаются расщеплению в желудке и/или верхних отделах кишечника и не всасываются желудочно-кишечным трактом принимающего их человека, но они ферментируются желудочно-кишечной микробиотой и/или пробиотиками. Пребиотики, например, определяются публикацией Glenn R. Gibson and Marcel В. Roberfroid Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota: Introducing the Concept of Prebiotics (Диетическое модифицирование толстокишечной микробиоты человека: представление концепции пребиотиков), J. Nutr. 1995 125: 1401-1412.

Пребиотики, которые могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, специальным образом не ограничиваются и включают все пищевые материалы, которые способствуют росту пробиотиков или полезных для здоровья микроорганизмов в кишечнике. Предпочтительно они могут выбираться из группы, состоящей из олигосахаридов, необязательно содержащих фруктозу, галактозу, маннозу; пищевых волокон, в частности, растворимых волокон, волокон сои; инулина или их смесей. Предпочтительные пребиотики являются фруктоолигосахаридами (FOS), галактоолигосахаридами (IOS), изомальтоолигосахаридами (IMO), ксилоолигосахаридами (XOS), арабино-ксилоолигосахаридами (AXOS), маннанолигосахаридами (MOS), олигосахаридами сои, гликозилсахарозой (GS), лактосахарозой (LS), лактулозой (LA), палатинозоолигосахаридами (РАО), мальтоолигосахаридами, камедями и/или их гидролизатами, пектинами и/или их гидролизатами. Например, данные композиции могут содержать олигофруктозу, инулин или их комбинацию.

Композиция согласно настоящему изобретению может содержать нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы в любом эффективном количестве, например, в количестве, соответствующем по сухой массе до около 10⁶-10¹² КОЕ/г.

Композиции настоящего изобретения содержат нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы в количестве, достаточном для по меньшей мере частичного обеспечения благотворного воздействия на здоровье. Подходящее для обеспечения такого действия количество определяется как «терапевтически эффективная доза». Эффективные для этих целей количества зависят от многих известных специалистам в данной области факторов, таких как масса тела и общее состояние здоровья ребенка, а также от эффекта, оказываемого матрицей пищевого продукта.

При профилактических применениях композиции согласно изобретению назначаются восприимчивым или иным образом подверженным риску развития определенного заболевания индивидуумам в количестве, которое является достаточным для по меньшей мере частичного снижения риска развития такого заболевания. Такое количество определяется как представляющее собой «профилактически эффективную дозу». Аналогично, точные количества зависят от ряда таких факторов, как состояние здоровья и масса ребенка, а также от эффекта, оказываемого матрицей пищевого продукта.

Специалисты в данной области смогут отрегулировать терапевтически эффективную дозу и/или соответственно профилактически эффективную дозу.

В целом композиция настоящего изобретения содержит нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы в терапевтически эффективной дозе и/или в профилактически эффективной дозе.

Как правило, терапевтически эффективная доза и/или профилактически эффективная доза находится в диапазоне около 0,005 мг - 1000 мг нереплицирующихся пробиотических микроорганизмов в сутки.

В численном выражении подвергнутые «кратковременной высокотемпературной» обработке нереплицирующиеся микроорганизмы могут присутствовать в композиции в количествах, эквивалентно соответствующих между 10⁴ и 10¹² КОЕ/г сухой композиции. Очевидно, что нереплицирующиеся микроорганизмы не образуют колоний, поэтому этот термин следует понимать как количество нереплицирующихся микроорганизмов, которое получается из от 10⁴ до 10¹² КОЕ/г реплицирующихся бактерий. Они включает микроорганизмы, которые являются инактивированными, мертвыми, нежизнеспособными и/или присутствуют в виде фрагментов, таких как ДНК или цитоплазматические соединения. Другими словами, количество микроорганизмов, которое содержит данная композиция, вне зависимости от того, являются ли они на самом деле живыми, инактивированными, мертвыми или фрагментированными, или же представляют собой смесь любых из этих состояний, выражается в терминах способности данного количества микроорганизмов образовывать колонии (КОЕ), как если бы все эти микроорганизмы являлись бы живыми.

Предпочтительно нереплицирующиеся микроорганизмы присутствуют в количестве, эквивалентном величине между 10⁴ и 10⁹ КОЕ/г сухой композиции, еще более предпочтительно в количестве, эквивалентном величине между 10⁵ и 10⁹ КОЕ/г сухой композиции.

Пробиотики могут быть приведены в нереплицирующееся состояние любым известным в данной области способом.

Имеющиеся в настоящее время технологии, пригодные для приведения пробиотика в нереплицирующееся состояние, обычно представлены тепловой обработкой, γ-облучением, ультрафиолетовым светом или применением химических реагентов (формалин, параформальдегид).

Предпочтительной для приведения пробиотика в нереплицирующееся состояние была бы технология, которая являлась бы относительно простой в применении в производственных условиях пищевой промышленности.

Большинство представленных в настоящее время на рынке продуктов содержат пробиотики, подвергнутые в процессе их изготовления тепловой обработке. Поэтому было бы удобным иметь возможность обрабатывать пробиотики нагреванием либо вместе с вырабатываемым продуктом, либо по меньшей мере подобным способом, при том, чтобы пробиотики сохраняли или улучшали свои полезные качества, или даже приобретали бы новые полезные для потребителя свойства.

Однако инактивация пробиотических микроорганизмов тепловой обработкой по литературным данным, как правило, связана с по меньшей мере частичной потерей активности пробиотика.

Авторы настоящего изобретения в данное время с удивлением обнаружили, что приведение пробиотических микроорганизмов в нереплицирующееся состояние, например, тепловой обработкой не приводит к потере полезных для здоровья качеств пробиотика, но, наоборот, может усиливать имеющийся благотворный эффект и даже приводить к созданию новых благоприятствующих здоровью свойств.

В этой связи одним воплощением настоящего изобретения является композиция, в которой нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы приводятся в нереплицирующееся состояние тепловой обработкой.

Такая тепловая обработка может выполняться при по меньшей мере 71,5°C в течение по меньшей мере 1 секунды.

Может применяться как длительная тепловая обработка, так и кратковременная тепловая обработка.

В промышленных масштабах в настоящее время предпочтительными обычно являются способы краткосрочной тепловой обработки, такие как подобные UHT (ультравысокотемпературная) тепловой обработке. Этот вид тепловой обработки снижает бактериальную нагрузку и сокращает продолжительность обработки, тем самым снижая ухудшение качества питательных веществ.

Авторы данного изобретения впервые продемонстрировали, что пробиотические микроорганизмы, подвергнутые тепловой обработке при высоких температурах в течение непродолжительного времени, демонстрируют противовоспалительные иммунные профили независимо от своих исходных свойств. В частности, либо вырабатывается новой противовоспалительный профиль, либо существующий противовоспалительный профиль в результате такой тепловой обработки усиливается.

Поэтому теперь оказывается возможным вырабатывать нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы с противовоспалительными иммунными профилями, применяя специальные параметры тепловой обработки, которые соответствуют типичным применяемым при тепловой обработке в промышленности, даже если их живые аналоги не являются штаммами, обладающими противовоспалительной активностью.

Поэтому тепловая обработка может представлять собой, например, высокотемпературную обработку при около 71,5-150°C в течение около 1-120 секунд. Высокотемпературная обработка может являться высокотемпературной/кратковременной (HTST) обработкой или ультравысокотемпературной (UHT) обработкой.

Пробиотические микроорганизмы могут быть подвергнуты высокотемпературной обработке при около 71,5-150°C в течение короткого времени около 1-120 секунд.

Более предпочтительно микроорганизмы могут быть подвергнуты высокотемпературной обработке при около 90-140°C, например, при 90-120°C в течение короткого времени около 1-30 секунд.

Эта высокотемпературная обработка переводит микроорганизмы, по меньшей мере частично, в нереплицирующееся состояние.

Высокотемпературная обработка может проводиться при нормальном атмосферном давлении, но также может быть выполнена под повышенным давлением. Типичные диапазоны давлений составляют от 1 до 50 бар, предпочтительно от 1 до 10 бар, еще более предпочтительно от 2 до 5 бар. Очевидно, что предпочтительным будет, если пробиотики подвергаются тепловой обработке в питательной среде, которая при приложении теплоты является жидкостью или твердым веществом. Поэтому идеальная величина прикладываемого давления будет зависеть от природы композиции, которая обеспечивается микроорганизмами, и от используемой температуры.

Высокотемпературная обработка может выполняться в интервале температур около 71,5-150°C, предпочтительно около 90-120°C, еще более предпочтительно около 120-140°C.

Высокотемпературная обработка может проводиться в течение короткого времени около 1-120 секунд, предпочтительно около 1-30 секунд, еще более предпочтительно около 5-15 секунд.

Данный временной интервал относится ко времени, в течение которого пробиотические микроорганизмы подвергаются воздействию данной температуры. Следует заметить, что в зависимости от природы и количества обеспечиваемой микроорганизмами композиции, а также в зависимости от конструкции применяемого нагревательного устройства продолжительность применяемого нагревания может изменяться.

Однако, как правило, композиция настоящего изобретения и/или микроорганизмы подвергаются высокотемпературной кратковременной (HTST) обработке, мгновенной пастеризации или ультравысокотемпературной (UHT) обработке.

UHT-обработка является ультравысокотемпературной обработкой или ультратепловой обработкой (обе сокращаются аббревиатурой UHT), включающей по меньшей мере частичную стерилизацию композиции при нагревании ее в течение короткого времени, приблизительно 1-10 секунд, при температуре, превышающей 135°C (275°F), которая является температурой, необходимой для уничтожения в молоке спор бактерий. Например, такая обработка молока с помощью температур, превышающих 135°C, делает возможным снижение величины бактериальной нагрузки при таком обязательным времени пребывания (до 2-5 с), которое позволяет использовать режим непрерывного потока.

Есть два основных типа UHT-систем: прямые и непрямые системы. В прямой системе продукты обрабатываются впрыскиванием пара или нагнетанием пара, тогда как в непрямой системе продукты подвергаются тепловой обработке с помощью пластинчатого теплообменника, трубчатого теплообменника или скребкового теплообменника. В процессе обработки продукта комбинации UHT-систем могут применяться на любом этапе или на ряде этапов.

Обработка HTST определяется следующим образом (высокая температура / короткое время): способ пастеризации, предназначенный для пятикратного по логарифмической шкале снижения количества жизнеспособных микроорганизмов в молоке с уничтожением 99,9999% их общего содержания. Это считается подходящим для истребления почти всех дрожжей, плесневых грибков и обычных вызывающих порчу бактерий, а также для обеспечения надлежащего уничтожения обычных патогенных теплоустойчивых организмов. При способе HTST молоко на 15-20 секунд нагревается до 71,7°C (161°F).

Мгновенная пастеризация является способом тепловой пастеризации скоропортящихся напитков, таких как фруктовые и овощные соки, пиво и молочные продукты. Она выполняется перед расфасовкой в контейнеры для уничтожения вызывающих порчу микроорганизмов, придания продуктам большей безопасности и увеличения продолжительности их хранения. Жидкость двигается в контролируемом непрерывном потоке и при этом в течение около 15-30 секунд подвергается воздействию температур от 71,5°C (160°F) до 74°C (165°F).

Для целей настоящего изобретения термин «кратковременная высокотемпературная обработка» включает, например, кратковременную обработку при высокой температуре (HTST), UHT-обработку и мгновенную пастеризацию.

Так как такая тепловая обработка придает нереплицирующимся пробиотикам улучшенный противовоспалительный профиль, композиция настоящего изобретения может быть применена в профилактике или терапии воспалительных нарушений.

Если для приведения пробиотических микроорганизмов в нереплицирующееся состояние применяется длительная тепловая обработка, такая тепловая обработка может осуществляться в интервале температур около 70-150°C в течение около 3 минут - 2 часов, предпочтительно в диапазоне 80-140°C от 5 минут до 40 минут.

В то время как существующий уровень техники в основном указывает, что бактерии, приведенные в нереплицирующееся состояние с помощью длительной тепловой обработки, обычно менее эффективны, чем живые клетки, в отношении проявления их пробиотических качеств, авторы настоящего изобретения смогли продемонстрировать, что подвергнутые тепловой обработке пробиотики превосходят свои живые аналоги в способности стимулировать иммунную систему.

Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей пробиотические микроорганизмы, приведенные в нереплицирующееся состояние тепловой обработкой в течение по меньшей мере около 3 минут при по меньшей мере около 70°C.

Усиливающее иммунную систему действие нереплицирующихся пробиотиков было подтверждено in vitro иммунным профилем. В применяемой in vitro модели используется цитокиновый профиль человеческих мононуклеаров периферической крови (РВМС) и хорошо принимается в данной области в качестве стандартной модели для исследования иммуномодулирующих соединений (Schultz и др., 2003, Journal of Dairy Research 70, 165-173; Taylor и др., 2006, Clinical and Experimental Allergy, 36, 1227-1235; Kekkonen и др., 2008, World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203).

Испытания РВМС in vitro применялись несколькими авторами / исследовательскими группами, например, для классифицирования пробиотиков согласно их иммунным профилям, то есть по их анти- или провоспалительным показателям (Kekkonen и др., 2008, World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203). Было показано, например, что такие испытания позволяют прогнозировать противовоспалительное действие исследуемых пробиотиков в отношении кишечного колита в моделях на мышах (Foligne В. и др., 2007, World J. Gastroenterol. 13: 236-243). Более того, это испытание регулярно применяется в качестве показательного в клинических исследованиях и была продемонстрирована его способность представлять результаты, согласующиеся с клиническими данными (Schultz и др., 2003, Journal of Dairy Research 70, 165-173; Taylor и др., 2006, Clinical and Experimental Allergy, 36, 1227-1235).

За последние десятилетия непрерывно увеличивается распространенность аллергических заболеваний и в настоящее время они рассматриваются ВОЗ в качестве эпидемических. В общих чертах аллергия, как полагают, является следствием дисбаланса между иммунными ответами Th1 и Th2, приводящего к сильному сдвигу в сторону продуцирования медиаторов Th2. Поэтому аллергия может быть смягчена, подавлена или предотвращена посредством восстановления надлежащего соответствия между Th1 и Th2 компонентами иммунной системы. Это подразумевает необходимость в снижении Th2-ответов или усилении, по меньшей мере временном, ответа Th1. Последнее было бы показателем укрепления иммунной системы, часто сопровождаемого, например, высокими уровнями IFNγ, TNF-α и IL-12 (World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203; Viljanen M. и др., 2005, Allergy, 60, 494-500).

Композиция настоящего изобретения позволяет поэтому излечивать или предупреждать нарушения, связанные с повреждениями иммунной защиты.

Описанная в настоящем изобретении композиция позволяет также усиливать реакцию на вакцины, в частности на пероральные вакцины.

Эффективными могут быть любые количества нереплицирующихся микроорганизмов. Однако предпочтительно, чтобы в целом по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%, идеально по меньшей мере 99,9%, наиболее идеально все пробиотики являлись бы нереплицирующимися.

В одном воплощении настоящего изобретения все микроорганизмы являются нереплицирующимися.

Соответственно, в композиции настоящего изобретения по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%, идеально по меньшей мере 99,9%, наиболее идеально все пробиотики являются нереплицирующимися.

Для целей настоящего изобретения могут применяться любые пробиотические микроорганизмы.

Например, пробиотические микроорганизмы могут выбираться из группы, состоящей из бифидобактерий, молочнокислых бактерий, пропионовокислых бактерий или их комбинаций, например, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactococcus diacetylactis, Lactococcus cremoris, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Escherichia coli и/или их смесей.

Композиция в соответствии с настоящим изобретением может, например, содержать пробиотические нереплицирующиеся микроорганизмы, выбранные из группы, состоящей из Bifidobacterium longum NCC 3001, Bifidobacterium longum NCC 2705, Bifidobacterium breve NCC 2950, Bifidobacterium lactis NCC 2818, Lactobacillus johnsonii La1, Lactobacillus paracasei NCC 2461, Lactobacillus rhamnosus NCC 4007, Lactobacillus reuteri DSM17983, Lactobacillus reuteri ATCC55730, Streptococcus thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC 2059, Lactobacillus casei NCC 4006, Lactobacillus acidophilus NCC 3009, Lactobacillus casei ACA-DC 6002 (NCC 1825), Escherichia coli Nissle, Lactobacillus bulgaricus NCC 15, Lactococcus lactis NCC 2287 или их комбинаций.

Все эти штаммы были или депонированы согласно Будапештскому договору, и/или являются предлагаемыми в продаже.

Депонированными согласно Будапештскому договору являются следующие штаммы:

Bifidobacterium longum NCC 3001	АТСС ВАА-999
Bifidobacterium longum NCC 2705	CNCM I-2618
Bifidobacterium breve NCC 2950	CNCM I-3865
Bifidobacterium lactis NCC 2818	CNCM I-3446
Lactobacillus paracasei NCC 2461	CNCM I-2116
Lactobacillus rhamnosus NCC 4007	CGMCC 1.3724
Streptococcus themophilus NCC 2019	CNCM I-1422
Streptococcus themophilus NCC 2059	CNCM I-4153
Lactococcus lactis NCC 2287	CNCM I-4154
Lactobacillus casei NCC 4006	CNCM I-1518
Lactobacillus casei NCC 1825	ACA-DC 6002
Lactobacillus acidophilus NCC 3009	ATCC 700396
Lactobacillus bulgaricus NCC 15	CNCM I-1198
Lactobacillus johnsonii La1	CNCM I-1225
Lactobacillus reuteri DSM17983	DSM17983
Lactobacillus reuteri ATCC55730	ATCC55730
Escherichia coli Nissle 1917	DSM 6601

Штаммы, именуемые ATCC, были депонированы в Американской коллекции типовых культур (ATCC Patent Depository), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, США.

Штаммы, именуемые CNCM, были депонированы в COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, Франция.

Штаммы, именуемые CGMCC, были депонированы в Китайском главном коллекционном центре микробиологических культур, Институт микробиологии Академии наук Китая, Zhongguancun, Р.О.Вох2714, Пекин 100080, Китай.

Штаммы, именуемые АСА-DC, были депонированы в Греческом координационном центре коллекций микроорганизмов, Лаборатория молочных продуктов, Отдел теоретических основ и технологии пищевых продуктов, Сельскохозяйственный университет Афин, 75, Iera odos, Botanikos, Афины, 118 55, Греции.

Штаммы, именуемые DSM, были депонированы в DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr., 7B, 38124 Braunschweig, Германия.

Специалистам в данной области очевидно, что они могут свободно объединять все описанные здесь признаки настоящего изобретения без отступления от его раскрываемого здесь объема.

Дальнейшие признаки и преимущества настоящего изобретения будут явствовать из следующих далее фигур и примеров.

Фигуры 1A и B показывают усиление противовоспалительных иммунных профилей пробиотиков, подвергнутых «кратковременной высокотемпературной обработке».

Фигура 2 показывает штаммы пробиотиков, не обладающие противовоспалительными качествами, которые становились противовоспалительными, то есть демонстрирующими выраженный противовоспалительный профиль in vitro после «кратковременной высокотемпературной» обработки.

Фигуры 3A и B показывают штаммы пробиотиков, применяемые в коммерчески доступных продуктах, которые демонстрируют усиленные или новоприобретенные противовоспалительные иммунные профили in vitro после «кратковременной высокотемпературной» обработки.

Фигуры 4A и B показывают штаммы молочной закваски (то есть заквасочные штаммы Lc1), которые демонстрируют усиленные или новоприобретенные противовоспалительные иммунные профили in vitro после кратковременной обработки при высоких температурах.

Фигура 5 показывает штамм пробиотика, не обладающий противовоспалительными качествами, который демонстрирует противовоспалительный иммунный профиль in vitro после HTST-обработки.

Фигура 6. Метод главных компонент на данных РВМС (IL-12p40, IFN-γ, TNF-α, IL-10), демонстрируемых пробиотическими и молочными заквасочными штаммами в их живом и подвергнутом тепловой обработке (140°C в течение 15 секунд) состоянии. Каждая точка представляет один штамм, живой либо подвергнутый тепловой обработке и идентифицируемый его NCC-номером или названием.

Фигура 7 показывает отношения IL-12p40/IL-10 живых и подвергнутых тепловой обработке (85°C, 20 мин) штаммов. В целом тепловая обработка в течение 20 минут при 85°C приводит к возрастанию величин отношения IL-12p40/IL-10 по сравнению с кратковременной высокотемпературной обработкой настоящего изобретения (Фигуры 1, 2, 3, 4 и 5).

Фигура 8 показывает повышение in vitro секреции цитокина из человеческих РВМС, стимулируемой подвергнутыми тепловой обработке бактериями.

Фигура 9 показывает процентную интенсивность диареи, наблюдаемой у OVA-сенсибилизированных мышей, подвергнутых провокации солевым раствором (отрицательный контроль), OVA-сенсибилизированных мышей, подвергнутых провокации OVA (положительный контроль) и OVA-сенсибилизированных мышей, подвергнутых провокации OVA и терапии подвергнутыми тепловой обработке или живыми Bifidobacterium breve NCC2950. Результаты отображены в виде процента от интенсивности диареи (среднее ± SEM, рассчитанное по 4 независимым экспериментам) со 100% интенсивностью диареи, соответствующей симптомам, развившимся в группе с положительным контролем (сенсибилизация и провокация аллергеном).

Фигура 10 показывает, что La1 (NCC533, депозитарный номер CNCM I-1225), подвергнутый тепловой обработке в течение 15 с при 120°C, очень сильно по сравнению с другими подвергнутыми тепловыми обработке штаммами индуцирует экспрессию мРНК hBD1 в кишечных э