Антитела против ангиопоэтина-2 человека

Антитела против ангиопоэтина-2 человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к антителам против ангиопоэтина-2 человека (анти-ANG-2 антителам), способам их получения, фармацевтическим композициям указанных антител и к их применению.

Предпосылки создания изобретения

Ангиогенез участвует в патогенезе различных расстройств, к которым относятся плотные опухоли, синдромы внутриглазной реваскуляризации, например, пролиферативные ретинопатии или возрастная дегенерация желтого пятна (ВДЖП), ревматоидный артрит и псориаз (Folkman J. и др., J. Biol. Chem. 267, 1992, сс.10931-10934; Klagsbrun М. и др., Annu. Rev. Physiol. 53, 1991, сс.217-239; Garner А. в кн.: «Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach», 1994, под ред. Garner А. и Klintworth G. K., 2-е изд., изд-во Marcel Dekker, Нью-Йорк, сс.1625-1710). В случае солидных опухолей реваскуляризация создает преимущество в росте и пролиферации для опухолевых клеток по сравнению с нормальными клетками. Поэтому наблюдают корреляцию между плотностью микрососудов на срезах опухолей и выживанием пациентов при раке груди, а также при некоторых других формах опухолей (Weidner N. и др., N. Engl. J. Med. 324, 1991, сс.1-8; Horak E.R. и др., Lancet 340, 1992, сс.1120-1124; Macchiarini Р. и др., Lancet 340, 1992, сс.145-146). ANG-2 и aHTH-ANG-2 антитела

Ангиопоэтин-2 человека (Human angiopoietin-2, обозначаемый аббревиатурами ANG-2, или ANGPT2, или ANG2) (SEQ ID No: 107) описан Maisonpierre Р.С.и др., Science 277, 1997, сс.55-60, Cheung А.Н. и др, Genomics 48, 1998, сс.389-391. Ангиопоэтин-1 и ангиопоэтин-2 (ANG-1(SEQ ID No: 108) и ANG-2 (SEQ ID No: 107)) описаны в качестве лигандов для представителей семейства тирозинкиназ Tie, которые селективно экспрессируются в эндотелии сосудов. Yancopoulos G.D., и др., Nature 407, 2000, сс.242-248. В настоящее время известно четыре представителя семейства ангиопоэтина. Ангиопоэтин-3 и ангиопоэтин-4 (Ang-З и Ang-4) могут представлять в значительной степени дивергированные варианты одного и того же генного локуса у мыши и человека. Kim I. и др., FEBS Let, 443, 1999, сс.353-356; Kim I. и др., J Biol Chem 274, 1999, сс.26523-26528. Первоначально ANG-1 и ANG-2 были идентифицированы в экспериментах с культурами тканей в качестве агониста и антагониста, соответственно (см. по ANG-1: Davies S. и др., Cell, 87, 1996, сс.1161-1169; и по ANG-2: Maisonpierre Р.С. и др., Science 277, 1997, сс.55-60). Все известные ангиопоэтины связываются в основном с Tie2, и оба, Ang-1 и -2, связываются с Tie2 со сродством 3 нМ (Kd). Maisonpierre Р.С., и др., Science 277, 1997, сс.55-60. Показано, что Ang-1 поддерживает выживание клеток эндотелия и индуцирует целостность эндотелия, Davis S. и др., Cell, 87, 1996, сс.1161-1169; Kwak H.J. и др., FEBS Lett 448, 1999, сс.249-253; Suri С.и др., Science 282, 1998, сс.468-471; Thurston G. и др., Science 286, 1999, сс.2511-2514; Thurston G. и др., Nat. Med. 6, 2000, сс.460-463, причем ANG-2 обладает противоположным эффектом и индуцирует дестабилизацию кровеносных сосудов и их регрессию в отсутствии факторов выживания VEGF или основного фактора роста фибробластов. Maisonpierre Р.С. и др., Science 277, 1997, сс.55-60. Однако, во многих исследованиях функции ANG-2 показано, что положение более сложное. ANG-2 может быть сложным регулятором ремоделирования сосудов, которое играет роль и в распространении сосудов, и в регрессии сосудов. Подтверждая такие роли для ANG-2, исследование экспрессии показало, что ANG-2 быстро индуцируется вместе с VEGF у взрослых при распространении сосудов при ангиогенезе, хотя ANG-2 индуцируется в отсутствии VEGF при регрессии сосудов. Holash J. и др., Science 284, 1999, сс.1994-1998; Holash J. и др., Oncogene 18, 1999, сс.5356-5362. Согласуясь с контекстно-зависимой ролью, ANG-2 предпочтительно связывает с тем же специфическим для эндотелия рецептором, Tie-2, который активируется Ang-1, но оказывает контекстно-зависимые воздействия на его активирование. Maisonpierre Р.С.и др., Science 277, 1997, сс.55-60.

Исследования ангиогенеза роговицы показали, что и ANG-1, и ANG-2 обладают сходными эффектами, взаимодействуя синергетически с VEGF для индукции роста новых кровеносных сосудов. Asahara Т. и др., Circ. Res., 83, 1998, сс.233-240. Вероятность наличия доза-зависимого ответа эндотелия повышается в связи с наблюдением, что in vitro в высокой концентрации ANG-2 также может быть проангиогенным. Kim I. и др., Oncogene 19, 2000, сс.4549-4552. В высокой концентрации ANG-2 действует в качестве апоптозного фактора выживания для клеток эндотелия во время сывороточного депривационного апоптоза через активирование Tie2 через PI-3 киназу и метаболический путь Akt. Kim I. и др., Oncogene 19, 2000, сс.4549-4552.

Кроме того, по результатам экспериментов in vitro был сделан вывод о том, что при продолжительном воздействии эффекты ANG-2 могут постепенно сдвигаться от эффекта антагониста к агонисту Tie2, и позднее может непосредственно участвовать в формировании сосудистых трубок и стабилизации новых сосудов. Teichert-Kuliszewska К. и др., Cardiovasc. Res. 49, 2001, сс.659-670. Кроме того, если клетки эндотелия культивируют на фибриновом геле, также наблюдают активирование Tie2 за счет ANG-2, что предположительно означает, что действие ANG-2 может зависеть от состояния дифференциации клеток эндотелия. Teichert-Kuliszewska К. и др., Cardiovasc. Res. 49, 2001, сс.659-670. В клетках эндотелия микрососудов, культивируемых в трехмерном геле, ANG-2 также может индуцировать активирование Tie2 и формирование структур типа капилляров. Mochizuki Y. и др., J. Cell. Sci. 115, 2002, сс.175-183. Применение трехмерного сферического совместного культивирования в качестве модели созревания сосудов in vitro, показывает, что прямой контакт между клетками эндотелия и клетками мезенхимы аннулирует способность к реагированию на VEGF, хотя наличие VEGF и ANG-2 индуцирует распространение сосудов. Korff Т. и др., Faseb J. 15, 2001, сс.447-457. Etoh Т.Н. и др. показали, что у клеток эндотелия, которые конститутивно экспрессируют Tie2, регуляция экспрессии ММР-1, -9 и u-РА сильно повышается за счет ANG-2 в присутствии VEGF. Etoh Т. и др., Cancer Res. 61, 2001, сс.2145-2153. На модели зрачковой мембраны in vivo Lobov I.В. и др. показали, что ANG-2 в присутствии эндогенного VEGF индуцирует быстрое повышение диаметра капилляров, ремоделируя базальную пластинку, пролиферацию и миграцию клеток эндотелия, и стимулирует распространение новых кровеносных сосудов. Lobov LB. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 2002, сс.11205-11210. Напротив, ANG-2 индуцирует гибель клеток эндотелия и регрессию сосудов без эндогенного VEGF. Lobov LB. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 2002, cc. 11205-11210. Сходным образом на модели опухоли in vivo Vajkoczy P. и др. показали, что многоклеточные агрегаты инициируют рост сосудов за счет ангиогенного прорастания с помощью одновременной экспрессии VEGFR-2 и ANG-2 организмом хозяина и эндотелием опухоли. Vajkoczy Р. и др., J. Clin. Invest. 109, 2002, сс.777-785. Эта модель показывает, что сформировавшаяся микрососудистая сеть растущих опухолей отличается постоянным ремоделированием, предположительно опосредованным экспрессией VEGF и ANG-2. Vajkoczy М.А. и др., J Clin. Invest. 09, 2002, сс.777-785.

Исследования Tie-2 и ангиопоэтина-1 на модели нокаутных мышей показывают сходные фенотипы и подтверждают, что фосфорилирование Tie-2 после стимуляции ангиопоэтином-1 опосредует ремоделирование и стабилизацию формируемых сосудов, стимулируя полное развитие кровеносных сосудов во время ангиогенеза и поддержание адгезии клеток, поддерживающих клетки эндотелия (Dumont J. и др., Genes & Development, 8, 1994, сс.1897-1909; Sato T.N., Nature, 376, 1995, сс.70-74; Thurston G. и др., Nature Medicine, 6, 2000, сс.460-463). Предположительно роль ангиопоэтина-1 сохраняется у взрослых, у которых он экспрессируется в разных местах и конститутивно (Hanahan D., Science, 277, 1997, сс.48-50; Zagzag D. и др., Exp Neurology, 159, 1999, сс.391-400). Напротив, экспрессия ангиопоэтина-2 в основном ограничивается сайтами сосудистого ремоделирования, в которых ангиопоэтин-2 предположительно блокирует конститутивную стабилизации или функцию созревания ангиопоэтина-1, позволяя сосудам ревертировать и сохраниться, пластическое состояние которых может быть в большей степени отвечающим на распространяющиеся сигналы (Hanahan D., 1997; Holash J. и др., Orzcogerze 18, 199, сс.5356-5362; Maisonpierre Р.С., 1997). При экспрессии ангиопоэтина-2 при патологическом ангиогенезе установлено, что многие типы опухолей экспрессируют ангиопоэтин-2 (Maisonpierre Р.С. и др., Science 277, 1997, сс.55-60). Функциональные исследования показали, что ангиопоэтин-2 вовлечен в опухолевый ангиогенез, и установили ассоциацию сверхэкспрессии ангиопоэтина-2 с повышенным ростом опухолей на модели ксенотрансплантата у мышей (Ahmad S.A. и др., Cancer Res., 61, 2001, сс.1255-1259). В других исследованиях связывают сверхэкспрессию ангиопоэтина-2 с гиперваскуляризацией опухоли (Etoh Т. и др., Cancer Res. 61, 2001, сс.2145-2153; Tanaka F. и др., Cancer Res. 62, 2002, сс.7124-7129).

В последнее время было предложено использовать ангиопоэтин-1, ангиопоэтин-2 и/или Tie-2 в качестве возможных мишеней в терапии опухолей. Например, в US 6166185, US 5650490 и US 5814464 описаны анти-Tie-2 лиганд и рецепторные антитела. Исследования с применением растворимого Tie-2 были описаны для снижения числа и размера опухолей у грызунов (Lin, 1997; Lin, 1998). Siemeister G. и др., Cancer Res. 59, 1999, сс.3185-3191, получили линии клеток меланомы человека, экспрессирующих внеклеточный домен от Tie-2, ввели их инъекцией голым мышам и описали растворимый Tie-2 для получения существенного подавления роста опухоли и опухолевого ангиогенеза. Оба рассматриваемых вместе агента, ангиопоэтин-1 и ангиопоэтин-2, связываются с Tie-2, и из этих исследований неясно, является ли ангиопоэтин-1, ангиопоэтин-2 или Tie-2 привлекательной мишенью для противоопухолевой терапии. Однако, эффективная терапия против ангипоэтина-2 предположительно полезна в лечении заболеваний, например, рака, при котором прогрессирование зависит от аберрантного ангиогенеза, при котором блокируемый процесс может привести к предупреждению прогрессирования заболевания (Follunan J., Nature Medicine. 1, 1995, сс.27-31).

Кроме того, некоторые группы исследователей сообщают о применении антител и пептидов, которые связываются с ангиопоэтином-2. См., например, US 6166185 и US 2003/10124129. WO 03/030833, WO 2006/068953, WO 03/057134 или US 2006/0122370.

Исследование воздействия очаговой экспрессии ангиопоэтина-2 показало, что противоборствующий ангиопоэтин 1/Tie-2 сигнал ослабляет плотную сосудистую структуру, тем самым, подвергая воздействию клетки эндотелия для активации сигналов от индукторов ангиогенеза, например, VEGF (Hanahan, 1997). Такой проангиогенный эффект, возникающий из подавления ангиопоэтина-1, показывает, что терапия против ангиопоэтина-1 может быть эффективным противораковым лечением.

ANG-2 экспрессируется в ходе развития в тех местах, где происходит ремоделирование кровеносных сосудов. Maisonpierre Р.С.и др., Science 277, 1997, сс.55-60. У взрослых индивидуумов экспрессия ANG-2 ограничена местами ремоделирования сосудов, а также опухолями с высокой степенью васкуляризации опухолей, включая глиому, Osada Н. и др., Int. J. Oncol. 18, 2001, сс.305-309; Koga К. и др., Cancer Res. 61, 2001, сс.6248-6254, гепатоклеточную карциному, Tanaka S. и др., J. Clin. Invest. 103, 1999, сс.341-345, рак желудка, Etoh Т. и др., Cancer Res. 61, 2001, сс.2145-2153; Lee J.H. и др, Int. J. Oncol. 18, 2001, сс.355-361, опухоль щитовидки, Bunone G. и др., Am J Pathol 155, 1999, сс.1967-1976, немелкоклеточный рак легких, Wong М.Р. и др., Lung Cancer 29, 2000, сс.11-22, рак толстой кишки, Ahmad S.A. и др., Cancer 92, 2001, сс.1138-43, и рак простаты Wurmbach J.H. и др., Anticancer Res. 20, 2000, сс.5217-5220. Установлено, что некоторые раковые клетки экспрессируют ANG-2. Например, Tanaka S. и др., J. Clin. Invest. 103, 1999, сс.341-345 обнаружили иРНК ANG-2 в 10 из 12 образцов гепатоклеточной карциномы человека (ГКЧ). Группа Ellis сообщает, что ANG-2 экспрессируется повсеместно в опухолевом эпителии. Ahmad S.A. и др., Cancer 92, 2001, сс.1138-1143. Другие исследователи сообщают о сходных результатах. Chen L. и др., J. Tongji Med. Univ. 21, 2001, сс.228-235. Путем выявления уровней иРНК ANG-2 в собранных образцах рака груди человека, Sfilogoi С.и др., Int. J. Cancer 103, 2003, сс.466-474 установили, что иРНК ANG-2 в значительной степени ассоциирована с инвазией вспомогательных лимфоузлов, кратким периодом отсутствия заболевания и в целом плохим выживанием. Tanaka F. и др., Cancer Res. 62, 2002, сс.7124-7129, проанализировали в общей сложности 236 пациентов с немелкоклеточным раком легких (НМКРЛ) на стадиях развития заболевания с I по IIIA, соответственно. С помощью иммуногистохимии они установили, что 16,9% пациентов с НМКРЛ являются ANG-2-положительными. Плотность микрососудов у ANG-2-положительной опухоли существенно выше, чем у ANG-2-отрицательной опухоли. Такой ангиогенный эффект ANG-2 наблюдают только если имеется высокая экспрессия VEGF. Кроме того, положительная экспрессия ANG-2 является существенным фактором для прогноза плохого послеоперационного выживания. Tanaka F. и др., Cancer Res. 62, 2002, сс.7124-7129. Однако ими было установлено, что нет существенной корреляции между экспрессией Ang-1 и плотностью микрососудов. Tanaka F. и др., Cancer Res. 62, 2002, сс.7124-7129. Эти результаты подтверждают, что ANG-2 является индикатором плохого прогноза у пациентов с некоторыми типами рака.

Ранее, используя модель нокаутных мышей ANG-2, группа исследователей под руководством Yancopoulos установила, что ANG-2 необходим для постнатального ангиогенеза. Gale N.W. и др., Dev. Cell 3, 2002, сс.411-423. Они показали, что запрограммированная в ходе развития регрессия сосудистой сети в стекловидном теле в глазу не происходит у нокаутных ANG-2 мышей и их кровеносные сосуды в сетчатке не могут распространяться от центральной артерии сетчатки. Gale N.W. и др., Dev. Cell 3, 2002, сс.411-423. Ими также было показано, что делеция ANG-2 приводит к выраженным дефектам в расположении и функционировании системы лимфатических сосудов. Gale N.W. и др., Dev. Cell 3, 2002, сс.411-423. Генетический риск с Ang-1 корректирует лимфатические, но не ангиогенные дефекты. Gale N.W. и др., Dev. Cell 3, 2002, сс.411-423.

Peters и соавторы сообщают, что растворимый Tie2, при доставке либо в качестве рекомбинантного белка, либо в вирусном векторе экспрессии, подавляет рост in vivo карциномы рака груди и меланомы грызунов у модельных мышей. Lin Р. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1998, сс.8829-8834; Lin P. и др., J. Clin. Invest. 100, 1997, cc. 2072-2078. Плотность сосудов в тканях опухолей, обработанных таким образом, существенно снижена. Кроме того, растворимый Tie2 блокирует ангиогенез в роговице крысы после стимуляции соответствующими средами для опухолевых клеток. Lin Р. и др., J. Clin. Invest. 100, 1997, 2072-2078. Кроме того, Isner с сотрудниками показали, что добавление ANG-2 к VEGF индуцирует существенно более длинную и более сферическую сеть вновь образовавшихся сосудов, чем только один VEGF. Asahara Т. и др., Circ. Res., 83, 1998, сс.233-240. Избыток растворимого рецептора Tie2 предотвращает модулирование под действием ANG-2 реваскуляризации, индуцированной VEGF. Asahara Т. и др., Circ. Res. 83, 1998, сс.233-240. Siemeister G. и др., Cancer Res. 59, 1999, сс.3185-3191, показали на голых мышах с ксенотрансплантатами, что сверхэкспрессия внеклеточных связывающих лиганды доменов, либо Fit-1, либо Tie2, у ксенотрансплантатов, приводящая к существенному подавлению метаболического пути, не может быть компенсирована сверхэкспрессией другого указанного домена, следовательно, метаболический путь рецептора VEGF и метаболический путь Tie2 не следует рассматривать в качестве двух независимых медиаторов, имеющих существенное значение для процесса ангиогенеза in vivo. Siemeister G. и др., Cancer Res. 59, 1999, сс.3185-3191. Это было доказано в предшествующей публикации White R.R. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 2003, сс.5028-5033. В этом исследовании показано, что устойчивый к нуклеазе аптамер РНК, который специфически связывается и подавляет ANG-2, существенно подавляет реваскуляризацию, индуцированную bFGF, на модели ангиогенеза в микрокармане роговицы крысы.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение представляет специфическое связывание с ангиопоэтином-2 человека (ANG-2) антитела, отличающегося включением в качестве области CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:41 или SEQ ID NO:49.

Предпочтительно антитело отличается тем, что

а) вариабельный домен тяжелой цепи включает область CDR3

последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:41 или SEQ ID NO:49, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:42 или SEQ ID NO:50, и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:43 или SEQ ID NO:51, и

б) вариабельный домен легкой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:44 или SEQ ID NO:52, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:45 или SEQ ID NO:53, и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:46 или SEQ ID NO:54.

Предпочтительно антитело отличается тем, что включает

а) вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:47 или SEQ ID NO:55; и

б) вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:48 или SEQ ID NO:56.

Предпочтительно антитело отличается тем, что не связывается специфически с ангиопоэтином-1 (ANG-1).

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, включающая антитело по настоящему изобретению.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является применение антитела по настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является применение антитела по настоящему изобретению для предупреждения матастазирования.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является применение антитела по настоящему изобретению для лечения рака.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является применение антитела по настоящему изобретению для лечения сосудистых заболеваний.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является применение антитела по настоящему изобретению для лечения ретинопатии.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи и/или вариабельный домен легкой цепи антитела по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает векторы экспрессии, содержащие нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, способные экспрессировать указанную нуклеиновую кислоту в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, содержащих такие векторы, для рекомбинантного получения такого антитела.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает прокариотические или эукариотические клетки-хозяева по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ выработки рекомбинантного антитела человека или гуманизированного антитела по настоящему изобретению, отличающийся экспрессией нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах и выделением указанного антитела из указанных клеток или супернатанта культуры клеток. Настоящее изобретение также включает антитело, получаемое таким рекомбинантным способом.

Антитела по настоящему изобретению особенно применимы для предупреждения вторичных опухолей/метастаз или для лечения сосудистых заболеваний, например, ретинопатии.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение представляет антитело, специфически связывающееся с ангиопоэтином-2 (ANG-2) человека, отличающееся тем, что включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:41 или SEQ ID NO:49.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело отличается тем, что

а) вариабельный домен тяжелой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:41 или SEQ ID NO:49, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:42 или SEQ ID NO:50, и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:43 или SEQ ID NO:51, и

б) вариабельный домен легкой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:44 или SEQ ID NO:52, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:45 или SEQ ID NO:53, и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:46 или SEQ ID NO:54.

Предпочтительно антитело отличается включением

а) последовательностей вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:47 или SEQ ID NO:55; и

б) последовательностей вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:48 или SEQ ID NO:56.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является антитело, специфически связывающееся с ANG-2 человека, которое отличается тем, что антитело не связывается специфически с ангиопоэтином-1 человека (ANG-1). Типичными антителами, специфически связывающимися с ANG-2 человека, но не с ANG-1 человека, являются, например, Ang2s_R3_LC03, Ang2s_LC09, Ang2i_LC06, Ang2i_LC07 или антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и Ang2s_R3_LC03, Ang2s_LC09, Ang2i_LC06, Ang2i_LC07, Ang2i_LC10, предпочтительно связывающиеся с тем же эпитопом, что и Ang2i_LC06. Поэтому в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело, специфически связывающееся с ангиопоэтином-2 человека (ANG-2), но не с ANG-1 человека, связывается с тем же этипотом, что и Ang2s_R3_LC03, Ang2s_LC09, Ang2i_LC06, Ang2i_LC07, Ang2i_LC10, предпочтительно с тем же этипотом, что и Ang2i_LC06. Такие антитела, специфически связывающиеся с ANG-2, но не с ANG-1, могут обладать улучшенными свойствами, например, улучшенной эффективностью, пониженной токсичностью, улучшенными фармакокинетическими свойствами, по сравнению с антителами, специфичными в отношении ANG-2 и ANG-1.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело, специфически связывающиеся с ангиопоэтином-2 (ANG-2) человека, но не с ANG-1 человека, отличается тем, что

а) вариабельный домен тяжелой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:33 или SEQ ID NO:49, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:34 или SEQ ID NO:50, и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:35 или SEQ ID NO:51, и

б) вариабельный домен легкой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:36 или SEQ ID NO:52, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:37 или SEQ ID NO:53, и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:38 или SEQ ID NO:54.

Предпочтительно такое антитело, специфически связывающееся с ангиопоэтином-2 человека (ANG-2), но не с ANG-1 человека, отличается тем, что включает

а) вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:39 или SEQ ID NO:55; и

б) вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:40 или SEQ ID NO:56.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанное антитело по настоящему изобретению отличается тем, что

а) вариабельный домен тяжелой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:9, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:10, и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:11, и

б) вариабельный домен легкой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:12, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5, или SEQ ID NO:13, и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:14.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанное антитело по настоящему изобретению отличается тем, что включает

а) вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:15; и

б) вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:16.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанное антитело по настоящему изобретению отличается тем, что

а) вариабельный домен тяжелой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3, и

б) вариабельный домен легкой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанное антитело по настоящему изобретению отличается тем, что включает

а) вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:7; и

б) вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO:8. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанное антитело по настоящему изобретению отличается тем, что

а) вариабельный домен тяжелой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:17, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:18, и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:19, и

б) вариабельный домен легкой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:20, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:21 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:22.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанное антитело по настоящему изобретению отличается тем, что включает

а) вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:23; и

б) вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO:24.

Предпочтительно антитело по настоящему изобретению отличается тем, что указанное антитело является антителом подкласса IgG1 человека или антителом подкласса IgG4 человека.

Понятие «антитело» охватывает различные формы структур антител, включая, но ими не ограничиваясь, целые антитела и фрагменты антител, антитело по настоящему изобретению предпочтительно является гуманизированным антителом, химерным антителом или дополнительно генетически сконструированным антителом, изменяемым до тех пор, пока оно сохраняет отличительные свойства по настоящему изобретению.

Понятие «фрагменты антител» включает часть антитела полной длины, предпочтительно его вариабельного домена, или по меньшей мере его сайт связывания антигена. Примерами фрагментов антитела являются димерные антитела, молекулы одноцепочечных антител (single-chain antibody molecules - scFv или scFab), и полиспецифичные антитела (например, биспецифичные), сформированные из фрагментов антител. Антителами scFv являются, например, антитела, описанные Houston J.S., Methods in Enzymol. 203, 1991, сс.46-88. Кроме того, фрагменты антител включают одноцепочечные полипептиды, обладающие свойствами домена V_H, а именно объединяться вместе с доменом V_L, или доменом V_L, связывающимся с ANG-2, а именно объединяться вместе с доменом V_H к функциональному сайту связывания антигена, и тем самым обеспечивать определенное свойство. Антителами scFv могут быть стабилизированы, используя, например, а) дисульфидную стабилизацию (см., например, WO 94/029350; Rajagopal V. и др., Prot. Engin. 1997, сс.1453-1459; Kobayashi Н. и др., Nuclear Medicine & Biology, 25, 1998, сс.387-393; или Schmidt М. и др., Oncogene 18, 1999, сс.1711-1721) или б) стабилизированные каркасные участки (например, за счет специфических мутаций см., например, WO 2007/109254, о специфических стабилизированных каркасных участках см., например, US 7258985, Furrer F. и др., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2009, сс.771-778, или Ottiger M. и др., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2009, сс.779-786).

Понятия «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела», используемые в настоящем изобретении, относятся к препарату молекул антител одной аминокислотной композиции.

Понятие «химерное антитело» относится к антителу, включающему вариабельную область, т.е. связывающую область, из одного источника или от одного вида и по меньшей мере часть константной области, производной от другого источника или вида, обычно полученному методами рекомбинации ДНК. Химерные антитела, включающие вариабельную область грызуна и константную область человека, являются предпочтительными. К другим предпочтительным формам «химерных антител», относящимся к настоящему изобретению, относятся те, у которых константная область была модифицирована или изменена по сравнению с исходным антителом для получения свойств по настоящему изобретению, особенно в связи со связыванием Clq и/или связыванием рецептора Fc (FcR). Такие химерные антитела также относят к «классу антител-переключателей». Химерные антитела являются продуктом экспрессии генов иммуноглобулина, включающих сегменты ДНК, кодирующие вариабельные области иммуноглобулина, и сегменты ДНК, кодирующие константные области иммуноглобулина. Способы получения химерных антител включают обычную рекомбинацию ДНК и методы генной трансфекции, известные в данной области. См., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, сс.6851-6855; US 5202238 и US 5204244.

Понятие «гуманизированное антитело» относится к антителам, у которых каркасный участок или «комплементарно детерминируемые области (complementarity determining regions - CDR)» модифицированы для включения CDR иммуноглобулина другой специфичности по сравнению с исходным иммуноглобулином. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения CDR грызуна пересажена в область каркасного участка антитела человека для получения «гуманизированного антитела». См., например, Riechmann L. и др., Nature 332, 1988, сс.323-327; Neuberger M.S. и др., Nature 314, 1985, сс.268-270. Особенно предпочтительные области CDR соответствуют областям, представляющим последовательности, которые распознают антигены, указанные выше, для химерных антител. К другим формам «гуманизированного антитела» в настоящем изобретении относятся те формы, у которых константная область дополнительно модифицирована или изменена по сравнению с исходным антителом для получения свойств по настоящему изобретению, особенно в связи со связыванием Clq и/или со связыванием с рецептором Fc (FcR).

Понятие «антитела человека» в контексте настоящего изобретения означает антитела с вариабельными и константными областями, полученными от последовательностей иммуноглобулинов зародышевых линий человека. Антитела человека известны в данной области (van Dijk М.А., van de Winkel J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 2001, cc. 368-374). Антитела человека также могут быть получены у трансгенных животных (например, мышей), которые могут при иммунизации вырабатывать полный спектр или выборочные антитела человека в отсутствие выработки эндогенного иммуноглобулина. Перенос генных последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека у таких мутантных мышей зародышевой линии может привести к выработке антител человека при наличии антигенного стимула (см., например, Jakobovits А. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, cc. 2551-2555; Jakobovits А. и др., Nature 362, 1993, cc. 255-258; Brueggemann M. и др., Year Immunol. 7, 1993, cc. 33-40). Антитела человека также могут быть получены с помощью библиотек фагового дисплея (Hoogenboom H.R. и Winter G., J. Mol. Biol. 227, 1992, cc. 381-388; Marks J.D. и др., J. Mol. Biol. 222, 1991, cc. 581-597). Методы Cole S.P.C. и др. и Boerner и др. также могут применяться для получения моноклональных антител человека (Cole S.P.C. и др., Monoclonal Antibodies и Cancer Therapy, Liss, A.R., 1985, cc. 77-96; и Boerner P. и др., J. Immunol. 147, 1991, cc. 86-95). Уже упоминалось для химерных и гуманизированных антител по настоящему изобретению, что понятие «антитело человека», используемое в настоящем изобретении, также включает антитела, которые модифицированы в константной области для выработки свойств по настоящему изобретению, особенно в связи со связыванием с Clq и/или со связыванием с FcR, например, путем «переключения класса», т.е. изменение или мутация частей Fc (например, с IgG1 на IgG4 и/или мутация IgG1/IgG4.)

Понятие «рекомбинантное антитело человека» в контексте настоящего изобретения означает все антитела человека, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены методами рекомбинации, например, антитела, выделенные из клеток-хозяев, например, клеток NSO или СНО, или из животных (например, мышей), которые трансгенны по генам иммуноглобулинов человека, или экспрессированные антитела, полученные с применением рекомбинантного вектора экспрессии, трансфецированного в клетку-хозяина. Такие рекомбинантные антитела человека содержат вариабельные и константные области во вновь собранной форме. Рекомбинантные антитела человека по настоящему изобретению подвергают in vivo соматической гипермутации. Таким образом, аминокислотными последовательностями областей V_H и V_L рекомбинантных антител являются последовательностями, которые происходят от последовательностей V_H и V_L зародышевой линии человека или связаны с ними, и могут в норме не существовать в природе в составе зародышевой линии антитела человека in vivo.

Понятие «вариабельный домен (вариабельный домен легкой цепи (V_L), вариабельный домен тяжелой цепи (V_H))» в контексте настоящего изобретения означает каждую пару доменов тяжелой и легкой цепи, которые участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены легкой и тяжелой цепей имеют одинаковую общую структуру, и каждый домен включает четыре каркасных участка (framework - FR), последовательности которых в высокой степени консервативны, соприкасающиеся тремя «гипервариабельными областями» (или комплементарно детерминируемыми областями (complementary determining region - CDR). Каркасные участки принимают конформацию β-слоя и области CDR могут формировать петли, связывающие структуру β-слоя. Области CDR в каждой цепи поддерживают свойственную им трехмерную структуру за счет каркасных участков и формируют вместе с областями CDR из другой цепи сайт связывания антигена. Области CDR3 тяжелой и легкой цепи антитела играют особенно важную роль в связывающей специфичности/сродстве антитела по настоящему изобретению и поэтому являются дополнительным объектом в настоящем изобретении.

Понятие «антигенсвязывающая часть антитела» в настоящем изобретении относится к аминокислотным остаткам антитела, ответственным за связывание антигена. Антигенсвязывающая часть антитела включает аминокислотные остатки из «комплементарно детерминируемых областей» или из «CDR». К понятию «каркасные участки (Framework - FR)» относятся те области вариабельного домена, которые отличаются от остатков гипервариабельной области, согласно описанному в настоящем изобретении. Таким образом, вариабельные домены легкой и тяжелой цепи антитела включают с N- к С-концу домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Особенно область CDR3 тяжелой цепи представляет ту область, которая вносит основной вклад в связывание антигена и определяет свойства антитела. Области CDR и FR определяют, исходя из стандартного определения Kabat Е.А. и др. в кн.: ((Sequences of Proteins of Immunological Interest)), 1991, 5-е изд., изд-во Public Health Service, Национальный институт здоровья, Bethesda, Мэриленд, и/или соответствующие остатки из «гипервариабельной петли».

Понятия «нуклеиновая кислота» или «молекула нуклеиновой кислоты» в контексте настоящего изобретения относятся к молекулам ДНК и молекулам РНК. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными, но предпочтительно двухцепочечной ДНК.

Понятие «аминокислота» в настоящем изобретении означает группу природных карбокси-альфа-аминокислот, включая аланин (трехбуквенный код: ala, однобуквенный код: А), аргинин (arg, R), аспарагин (asn, N), аспарагиновая кислота (asp, D), цистеин (cys, С), глутамин (gin, Q), глутаминовая кислота (glu, Е), глицин (gly, G), гистидин (his, Н), изолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, К), метионин (met, М), фенилаланин (phe, F), пролин (pro, Р), серии (ser, S), треонин (thr, Т), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).

Нуклеиновая кислота является «оперативно связанной», если она находится в функциональной связи с другой нуклеиновой кислотой. Например, ДНК предпоследовательности или секреторного лидера оперативно связана с ДНК полипептида, если она экспрессируется в качестве белка-предшественника, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер оперативно связаны с кодирующей последовательностью, если они влияют на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы оперативно связан с кодирующей последовательностью, если он расположен таким образом, что облегчает трансляцию. Обычно понятие «оперативно связанный» означает, что последовательности ДНК, будучи связанными, являются смежными, и, в случае секреторного лидера, соприкасаются и находятся в рамке считывания. Однако энхансеры необязательно должны быть смежными. Связывание сопровождается лигированием по соответствующим сайтам рестрикции. Если таких сайтов нет, синтетические олигонуклеотидные праймеры или линкеры используют в соответствии с обычной практикой. Обычно понятие «оперативно связанная» означает, что последовательности ДНК, будучи связанными, являются коллинеарными и, в случае секреторного лидера, смежными и в рамке считывания. Однако энхансеры не должны соприкасаться. Связывание дополняется лигированием в соответствующих сайтах рестрикции. Если таких сайтов нет, применяют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры, что соответствует обычной практике.

В контексте настоящего изобретения понятия «клетка», «линия клеток» и «культура клеток» применяют взаимозаменяемо, и все они включают последующие поколения клеток. Например, понятия «трансформанты» и «трансформированные клетки» включают первичные клетки субъекта и полученные из них культуры независимо от числа пересевов. Также следует учитывать, что все последующие генерации клеток могут быть полностью неидентичными по ДНК из-за тщательно спланированных или случайных мутаций. К этим понятиям также относятся варианты клеток следующей генерации, которые имеют то же биологическое действие или функцию, выявляемые при скрининге первоначально трансформированных клеток.

В контексте настоящего изобретения понятия «связывание» или «специфическое связывание»