Способы идентификации сайтов для конъюгации igg

Способы идентификации сайтов для конъюгации igg

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение имеет отношение к усовершенствованным иммуноглобулинам и конъюгатам иммуноглобулинов.

Уровень техники

Моноклональные антитела имеют широкое лабораторное и терапевтическое применение. Разработаны и в течение многих лет применяются производные антител с искусственными свойствами сайт-специфической флуоресценции или связывания. Совсем недавно стали разрабатывать антитела в качестве терапевтических агентов, представляющих сейчас наиболее быстро растущий класс фармацевтических препаратов [1]. Антитела являются мультидоменными белками из двух легких и двух тяжелых цепей, соединенных дисульфидными связями. Вариабельные участки определяют связывание с определенным антигеном, а часть константных участков ответственна за эффекторные функции через связывание с Fc-рецепторами на поверхности иммунных клеток. Вследствие своего потенциала при лечении различных заболеваний, в настоящее время антитела составляют наиболее быстро растущий класс лекарственных препаратов для человека (Carter. Nature Reviews Immunology. 2006, 6(5), 343). С 2001 г. их рынок рос со средней скоростью 35% в год, что составляет самую высокую скорость среди всех категорий биотехнологических препаратов (S. Aggarwal. Nature. BioTech. 2007, 25(10), 1097).

Конструирование конъюгатов антител еще больше увеличило многосторонность применения антител. Во многих лабораторных методах ферменты или флуоресцентные зонды конъюгируют с антителами для выполнения измерительной функции, к примеру, количественного определения антигена. В случае прицельной терапии к антителам прикрепляют небольшие токсические молекулы, которые специфически связываются с биомаркерами на пораженных клетках [2-4]. Предпринимались различные подходы к конъюгации антител, прикрепление к поверхностным лизинам [5], к углеводам Fc [6] или к частично восстановленным межцепочечным дисульфидам [7].

Конъюгация антител по встроенным на поверхности цистеинам остается наиболее привлекательным вариантом, так как большинство антител не имеют других цистеинов, кроме тех, что задействованы во внутри- и межцепочечных дисульфидных связях. По специфическим сайтам замещения цистеинов могут прикрепляться небольшие молекулы через реакционноспособные тиолы типа малеимидов [8-14]. Предпочтительным было конструирование в доменах C_H1 и C_H3, чтобы избежать интерференции со связыванием антигена в вариабельных участках и эффекторной функцией C_H2. Рассматривались различные критерии для успешной конъюгации антител через встроенные цистеины. Следует учитывать такие параметры, как домен антитела, в который вводится мутация, доступность мутированного сайта, подлежащие замене аминокислоты. Был разработан подход с высокопроизводительным скринингом для идентификации сайтов, пригодных для встраивания цистенов и конъюгации [15]. Две наиболее общие проблемы, связанные с цистеновыми вариантами антител, это олигомеризация и слабое включение метки. Однако не существует универсального инструмента для предсказания того, будет ли цистеиновый вариант антитела стабильным и эффективно конъюгироваться. Более того, в настоящее время цистеиновые варианты существуют только для доменов C_L, C_H1 и C_H3 [8, 9, 11, 12, 15].

Таким образом, имеется потребность в дополнительных цистеиновых вариантах иммуноглобулинов, которые можно использовать для создания стабильных конъюгатов иммуноглобулинов.

Сущность изобретения

В настоящем изобретении описаны усовершенствованные иммуноглобулины и конъюгаты иммуноглобулинов с пониженным перекрестным сшиванием, которые удовлетворяют эту потребность.

Итак, один аспект охватывает конъюгаты иммуноглобулинов, содержащие по меньшей мере одну мутацию по остатку, выбранному из группы, состоящей из 7(V_H), 20(V_L), 22(V_L), 25(V_H), 125(C_H1), 248(C_H2), 254(C_H2), 286(C_H2), 298(C_H2) и 326(C_H2), причем по меньшей мере одна мутация представляет собой замену на остаток цистеина, и атом или молекулу, которые конъюгированы с остатком цистеина. В некоторых воплощениях по меньшей мере одна мутация приходится на остаток, выбранный из группы, состоящей из 7(V_H), 20(V_L), 22(V_L) и 125(C_H1). В некоторых воплощениях по меньшей мере одна мутация приходится на остаток, выбранный из группы, состоящей из 248(C_H2) и 326(C_H2). В некоторых воплощениях по меньшей мере одна мутация приходится на остаток, выбранный из группы, состоящей из 25(V_H) и 286(C_H2). В некоторых воплощениях по меньшей мере одна мутация приходится на остаток, выбранный из группы, состоящей из 254(C_H2) и 298(V_H). В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, иммуноглобулин выбирается из группы, содержащей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, иммуноглобулин включает IgG1. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, конъюгат иммуноглобулина включает домен C_H1 человека. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, конъюгат иммуноглобулина включает домен C_H2 человека. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, конъюгат иммуноглобулина включает домен C_H3 человека. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, конъюгат иммуноглобулина включает домен C_L человека. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, конъюгат иммуноглобулина включает домен V_H человека. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, конъюгат иммуноглобулина включает домен V_L человека. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, конъюгат иммуноглобулина дополнительно включает молекулу линкера, имеющую по меньшей мере два реакционноспособных сайта, причем первый реакционноспособный сайт связан с остатком цистеина иммуноглобулина, а второй реакционноспособный сайт связан с атомом или молекулой. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, содержащими молекулу линкера, молекула линкера выбирается из группы, состоящей из гидразона, дисульфида, пептида, хелатирующего агента и малеимида. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, атом или молекула выбираются из группы, состоящей из радионуклида, химиотерапевтического агента, микробного токсина, растительного токсина, полимера, углевода, цитокина, флуоресцентной метки, люминесцентной метки, фермент-субстратной метки, фермента, пептида, пептидомиметика, нуклеотида, siPHK, микроРНК, РНК-миметика и аптамера. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, атом или молекула выбираются из группы, состоящей из ⁹⁰Y, ¹³¹I, ⁶⁷Cu, ¹⁷⁷Lu, ²¹³Bi, ²¹¹At, калихеамицина, дуокармицина, майтансиноида, ауристатина, антрациклина, экзотоксина A Pseudomonas, дифтерийного токсина, рицина, полиэтиленгликоля, гидроксиэтил-крахмала и остатка маннозила. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, атом или молекула снижает иммуногенность немутированного иммуноглобулина. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, атом или молекула повышает иммуногенность немутированного иммуноглобулина. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, конъюгат иммуноглобулина дополнительно обладает антигенсвязывающей активностью, причем эта активность составляет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 110%, по меньшей мере 120% или по меньшей мере 130% от антигенсвязывающей активности немутированного иммуноглобулина.

Другой аспект охватывает модифицированные или выделенные иммуноглобулины, содержащие по меньшей мере одну мутацию по остатку, выбранному из группы, состоящей из 7(V_H), 20(V_L), 22(V_L), 25(V_H), 125(C_H1), 248(C_H2), 254(C_H2), 286(C_H2) и 326(C_H2), причем по меньшей мере одна мутация представляет собой замену на остаток цистеина. В некоторых воплощениях по меньшей мере одна мутация приходится на остаток, выбранный из группы, состоящей из 7(V_H), 20(V_L), 22(V_L) и 125(C_H1). В некоторых воплощениях по меньшей мере одна мутация приходится на остаток, выбранный из группы, состоящей из 248(C_H2) и 326(C_H2). В некоторых воплощениях по меньшей мере одна мутация приходится на остаток, выбранный из группы, состоящей из 25(V_H) и 286(C_H2). В некоторых воплощениях по меньшей мере одна мутация приходится на остаток 254(C_H2). В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, иммуноглобулин выбирается из группы, содержащей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, иммуноглобулин включает IgG1. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, модифицированный или выделенный иммуноглобулин включает домен C_H1 человека. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, модифицированный или выделенный иммуноглобулин включает домен C_H2 человека. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, модифицированный или выделенный иммуноглобулин включает домен C_H3 человека. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, модифицированный или выделенный иммуноглобулин включает домен C_L человека. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, модифицированный или выделенный иммуноглобулин включает домен V_H человека. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, модифицированный или выделенный иммуноглобулин включает домен V_L человека. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, конъюгат иммуноглобулина дополнительно обладает антигенсвязывающей активностью, причем эта активность составляет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 110%, по меньшей мере 120% или по меньшей мере 130% от антигенсвязывающей активности немутированного иммуноглобулина.

Следующий аспект охватывает выделенные или рекомбинантные полинуклеотиды, кодирующие иммуноглобулины из предыдущего аспекта по модифицированным иммуноглобулинам и всевозможных комбинаций предыдущих воплощений. В некоторых воплощениях полинуклеотид находится в векторе. В некоторых воплощениях вектор является экспрессионным вектором. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, с полинуклеотидом функционально связан индуцибельный промотор. Следующий аспект охватывает клетки хозяина с вектором из любого из предыдущих воплощений. В некоторых воплощениях клетки хозяина способны экспрессировать иммуноглобулин, кодируемый полинуклеотидом.

Следующий аспект охватывает способы получения иммуноглобулинов, включающие обеспечение культуральной среды, содержащей клетки хозяина из предыдущего аспекта, и помещение культуральной среды в условия, при которых экспрессируется иммуноглобулин. В некоторых воплощениях способы включают дополнительную стадию выделения экспрессированного иммуноглобулина.

Следующий аспект охватывает способы получения конъюгатов иммуноглобулинов, включающие обеспечение иммуноглобулина из предыдущего аспекта по модифицированным иммуноглобулинам и всевозможных комбинаций предыдущих воплощений, восстановление одного или нескольких замененных остатков цистеина с помощью восстановителя с образованием восстановленных остатков цистеина, и инкубирование иммуноглобулина с атомом или молекулой, причем атом или молекула реагирует с восстановленными остатками цистеина с образованием конъюгата иммуноглобулина.

Следующий аспект охватывает способы снижения перекрестного сшивания между выходящими на поверхность цистеинами иммуноглобулина в сильно концентрированной композиции конъюгатов иммуноглобулина, включающие обеспечение иммуноглобулина, замену остатка, выбранного из группы, состоящей из 7(V_H), 20(V_L), 22(V_L) и 125(C_H1), на остаток цистеина, восстановление одного или нескольких замененных остатков цистеина с помощью восстановителя с образованием восстановленных остатков цистеина, инкубирование иммуноглобулина с атомом или молекулой, причем атом или молекула реагирует с восстановленными остатками цистеина с образованием конъюгата иммуноглобулина, и формирование сильно концентрированной, жидкой композиции конъюгата иммуноглобулина, в которой концентрация конъюгата иммуноглобулина составляет по меньшей мере 20 мг/мл, по меньшей мере 30 мг/мл, по меньшей мере 40 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл, по меньшей мере 75 мг/мл, по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мере 125 мг/мл или по меньшей мере 150 мг/мл. В некоторых воплощениях иммуноглобулин выбирается из группы, содержащей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В некоторых воплощениях иммуноглобулин включает IgG1. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, иммуноглобулин включает домен C_H1 человека. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, иммуноглобулин включает домен C_H2 человека. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, иммуноглобулин включает домен C_H3 человека. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, иммуноглобулин включает домен C_L человека. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, иммуноглобулин включает домен V_H человека. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, иммуноглобулин включает домен V_L человека. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, конъюгат иммуноглобулина обладает антигенсвязывающей активностью, причем эта активность составляет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 110%, по меньшей мере 120% или по меньшей мере 130% от антигенсвязывающей активности немутированного иммуноглобулина.

Следующий аспект охватывает применение конъюгата иммуноглобулина из предыдущего аспекта и всевозможных комбинаций предыдущих воплощений при получении медикамента, включающего сильно концентрированную жидкую лекарственную форму, в которой концентрация конъюгата иммуноглобулина составляет по меньшей мере 30 мг/мл, по меньшей мере 40 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл, по меньшей мере 75 мг/мл, по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мере 125 мг/мл или по меньшей мере 150 мг/мл. В некоторых воплощениях медикамент предназначается для лечения аутоиммунных заболеваний, иммунологических заболеваний, инфекционных заболеваний, воспалительных заболеваний, неврологических заболеваний и онкологических и неопластических заболеваний, включая рак. В некоторых воплощениях медикамент предназначается для лечения застойной сердечной недостаточности (CHF), васкулита, красных угрей, угрей, экземы, миокардита и других заболеваний миокарда, системной красной волчанки, диабета, спондилопатии, потери синовиальных фибробластов и стромы костного мозга, потери костной массы, болезни Паже, остеокластомы; рака молочной железы; остеопении от бездействия; истощения, перидонтальных заболеваний, болезни Гоше, гистиоцитоза клеток Лангерганса, повреждения спинного мозга, острого септического артрита, размягчения костей, синдрома Кушинга, монооссальной фиброзной дисплазии, полиоссальной фиброзной дисплазии, периодонтальной реконструкция и перелома костей; саркоидоза, остеолитического рака костей, рака молочной железы, рака легких, рака почек и рака прямой кишки; костных метастазов, лечения боли в костях и гуморальной злокачественной гиперкальцемии, анкилозного спондилита и других спондилоартропатий; отторжения трансплантата, вирусных инфекций, гематологических неоплазий и неопластических заболеваний, лимфомы Ходжкина; неходжкинских лимфом (лимфомы Буркитта, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы/хронического лимфолейкоза, фунгоидной гранулемы, мантиеклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, диффузной крупно-В-клеточной лимфомы, лимфомы маргинальной зоны, волосковоклеточной лейкемии и лимфоплазмацитарной лейкемии), опухолей клеток-предшественников лимфоцитов, включая В-клеточную острую лимфобластическую лейкемию/лимфому и Т-клеточную острую лимфобластическую лейкемию/лимфому, тимомы, опухолей зрелых Т- и NK- (натуральных киллеров) клеток, включая лейкемию периферических Т-клеток, лейкемию/лимфому взрослых Т-клеток и лейкемию больших гранулярных лимфоцитов, гистиоцитоза клеток Ларгенганса, миелоидных неоплазий типа острой миелогенной лейкемии, включая AML с созреванием, AML без дифференцировки, острую промиелоцитную лейкемию, острую миеломоноцитарную лейкемию и острую моноцитарную лейкемию, миелодиспластических синдромов и хронических миелопролиферативных заболеваний, включая хроническую миелогенную лейкемию, опухолей центральной нервной системы, например, опухолей мозга (глиомы, нейробластомы, астроцитомы, медуллобластомы, эпендимомы и ретинобластомы), солидных опухолей (назофарингеального рака, базальноклеточной карциномы, рака поджелудочной железы, рака желчных протоков, саркомы Капоши, рака яичек, рака матки, влагалища или шейки матки, рака яичников, первичного рака печени или рака эндометрия и опухолей сосудистой системы (ангиосаркомы и гемангиоперицитомы), остеопороза, гепатита, ВИЧ, СПИД, спондилоартрита, ревматоидного артрита, воспалительных заболеваний кишечника (IBD), сепсиса и септического шока, болезни Крона, псориаза, склеродермы, реакции "трансплантат против хозяина" (GVHD), отторжения аллогенных трансплантатов островков, гематологических раковых заболеваний, как-то множестенной миеломы (ММ), миелодиспластическего синдрома (MDS) и острой миелогенной лейкемии (AML), воспаления, связанного с опухолями, повреждения периферических нервов или демиелинизирующих заболеваний. В некоторых воплощениях медикамент предназначается для лечения чешуйчатого псориаза, язвенного колита, неходжкиновской лимфомы, рака молочной железы, рака толстой и прямой кишки, ювенильного идиопатического артрита, дистрофии желтого пятна, респираторно-синцитиального вируса, болезни Крона, ревматоидного артрита, псориазного артрита, анкилозного спондилита, остеопороза, потери костной ткани в результате лечения, костных метастазов, множественной миеломы, болезни Альцгеймера, глаукомы и рассеянного склероза. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, медикамент дополнительно содержит фармацевтически приемлемый эксципиент. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, композиция содержит по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% конъюгата иммуноглобулина в виде неолигомеризованного мономера. В некоторых воплощениях содержание мономера измеряется методом SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях.

Следующий аспект охватывает применение конъюгатов иммуноглобулинов из предыдущего аспекта и всевозможных комбинаций предыдущих воплощений в качестве не подверженного олигомеризации фармацевтически активного ингредиента.

Следующий аспект охватывает применение конъюгатов иммуноглобулинов из предыдущего аспекта и всевозможных комбинаций предыдущих воплощений в качестве диагностического инструмента.

Следующий аспект охватывает применение конъюгатов иммуноглобулинов из предыдущего аспекта и всевозможных комбинаций предыдущих воплощений в качестве стандарта для высокомолекулярных белков. Другой аспект охватывает применение конъюгатов иммуноглобулинов в качестве стандарта для высокомолекулярных белков, при этом конъюгат иммуноглобулина содержит иммуноглобулин, содержащий по меньшей мере одну мутацию по остатку 440(C_H3), причем по меньшей мере одна мутация представляет собой замену на остаток цистеина, и атом или молекулу, причем атом или молекула конъюгирована с остатком цистеина.

Следующий аспект охватывает фармацевтические композиции, которые содержат конъюгат иммуноглобулина из предыдущего аспекта и всевозможных комбинаций предыдущих воплощений и фармацевтически приемлемый эксципиент. В некоторых воплощениях конъюгат иммуноглобулина содержится в концентрации по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 20 мг/мл, по меньшей мере 30 мг/мл, по меньшей мере 40 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл, по меньшей мере 75 мг/мл, по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мере 125 мг/мл или по меньшей мере 150 мг/мл. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, композиция содержит по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% конъюгата иммуноглобулина в виде неолигомеризованного мономера.

Следующий аспект охватывает способы отбора остатков иммуноглобулина для мутации на цистеин, включающие вычисление склонности к пространственной агрегации первого аминокислотного остатка на поверхности иммуноглобулина, вычисление склонности к пространственной агрегации нескольких (множества) остатков иммуноглобулина в непосредственной близости от первого остатка и выбор первого аминокислотного остатка для мутации на цистеин, если склонность к пространственной агрегации первого аминокислотного остатка равна или находится между значениями 0 и -0,11 и если множество остатков имеют значения склонности к пространственной агрегации меньше 0. В некоторых воплощениях множество остатков находится в пределах 15Å от первого остатка. В некоторых воплощениях множество остатков находится в пределах 10Å от первого остатка. В некоторых воплощениях множество остатков находится в пределах 7,5Å от первого остатка. В некоторых воплощениях множество остатков находится в пределах 5Å от первого остатка. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, вычисление склонности к пространственной агрегации остатка включает вычисление склонности к пространственной агрегации для сферического участка с радиусом из центра одного атома в этом остатке. В некоторых воплощениях радиус сферического участка составляет по меньшей мере 5Å.

Следующий аспект охватывает модифицированные или выделенные иммуноглобулины, содержащие по меньшей мере одну мутацию выходящего на поверхность остатка на цистеин, при этом склонность к пространственной агрегации первого аминокислотного остатка равна или находится между значениями 0 и -0,11, а множество остатков иммуноглобулина в непосредственной близости от первого остатка имеют значения склонности к пространственной агрегации меньше 0. В некоторых воплощениях множество остатков находится в пределах 15Å от первого остатка. В некоторых воплощениях множество остатков находится в пределах 10Å от первого остатка. В некоторых воплощениях множество остатков находится в пределах 7,5Å от первого остатка. В некоторых воплощениях множество остатков находится в пределах 5Å от первого остатка. В некоторых воплощениях, которые можно комбинировать с предыдущими воплощениями, склонность к пространственной агрегации рассчитывают для сферического участка с радиусом из центра одного атома в этом остатке. В некоторых воплощениях радиус составляет по меньшей мере 5Å.

Следующий аспект охватывает способы отбора остатков иммуноглобулина для мутации на цистеин, включающие выбор нескольких (множества) аминокислотных остатков иммуноглобулина, причем это множество остатков выходит на поверхность иммуноглобулина, мутирование одного остатка из множества остатков на остаток цистеина, конъюгирование остатка цистеина с атомом или молекулой с образованием конъюгата иммуноглобулина, тестирование конъюгата иммуноглобулина на склонность к перекрестному сшиванию и присвоение конъюгату иммуноглобулина значения склонности к перекрестному сшиванию и отбор остатка для мутации на цистеин, если значение склонности к перекрестному сшиванию составляет I или II. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает присвоение конъюгату иммуноглобулина значения склонности к перекрестному сшиванию II, если менее 5% конъюгатов иммуноглобулина образуют димеры и конъюгаты иммуноглобулина совсем не образуют тримеров, при этом образование димеров и тримеров измеряется сравненительным SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает присвоение конъюгату иммуноглобулина значения склонности к перекрестному сшиванию I, если менее 1% конъюгатов иммуноглобулина образуют димеры, при этом образование димеров измеряется сравненительным SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях.

Другие аспекты и воплощения изобретения встречаются по всему описанию.

Осуществление изобретения

Настоящее описание касается усовершенствованных иммуноглобулинов и конъюгатов иммуноглобулинов, проявляющих пониженное перекрестное сшивание. В некоторых воплощениях иммуноглобулины изобретения подвергаются модификации по определенным остаткам путем замены на цистеин. Изобретение обеспечивает модифицированные иммуноглобулины и конъюгаты иммуноглобулинов, способы получения таких иммуноглобулинов и конъюгатов иммуноглобулинов, мультивалентные или мультиспецифичные молекулы, содержащие такие иммуноглобулины, и фармацевтические композиции, содержащие иммуноглобулины, конъюгаты иммуноглобулинов или биспецифичные молекулы изобретения.

Определения

Термин "антитело" или "иммуноглобулин" в настоящем изобретении включают целые антитела и любые их антигенсвязывающие фрагменты (т.е. "антигенсвязывающие части") или отдельные цепи. "Антитело" естественного происхождения представляет собой гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелые (Н) и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно V_H) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, C_H1, C_H2 и C_H3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно V_L) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, C_L. Области V_H и V_L можно еще подразделить на участки гипервариабельности, именуемые участками, определяющими комплементарность (CDR), которые перемежаются с более консервативными участками, именуемыми каркасными участками (FR). Каждый V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных с N-конца до С-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента.

Термины "конъюгат антитела" или "конъюгат иммуноглобулина" в настоящем изобретении включают любые иммуноглобулины, их антигенсвязывающие фрагменты или отдельные цепи, химически или биологически соединенные с атомом или молекулой. Атомы или молекулы могут включать, к примеру, цитотоксины, радиоактивные агенты, противоопухолевые препараты или терапевтические агенты. Конъюгат антитела сохраняет иммунореактивность иммуноглобулина или антигенсвязывающего фрагмента, т.е. иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент конъюгата антител обладает по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 110%, по меньшей мере 120% или по меньшей мере 130% от антигенсвязывающей активности иммуноглобулина до его конъюгации с атомом или молекулой.

Термин "антигенсвязывающая часть" антитела (или просто "антигенная часть") в настоящем изобретении относится к полному антителу либо к одному или нескольким фрагментам антитела, сохраняющим способность к специфическому связыванию с антигеном, и по меньшей мере части константной области тяжелой или легкой цепи. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченных термином "антигенсвязывающая часть" антитела, включают Fab-фрагмент - одновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_L, V_H, C_L и C_H1; F(ab)₂-фрагмент - двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, соединенные дисульфидным мостиком в шарнирном участке; Fd-фрагмент, состоящий из доменов V_H и C_H1; и Fv-фрагмент, состоящий из доменов V_L и V_H одного плеча антитела.

Более того, хотя два домена Fv-фрагмента, V_L и V_H, кодируются отдельными генами, их можно соединить с применением рекомбинантных методов, с помощью синтетического линкера, что дает возможность получать их в виде единой белковой цепи, в которой области V_L и V_H сочетаются с образованием одновалентной молекулы (известной как одноцепочечный Fv (scFv); например, см. Bird et al., 1988 Science 242:423-426; и Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также охватываются термином "антигенсвязывающий участок" антитела. Эти фрагменты антител получают с применением стандартных методик, известных специалистам в данной области, и фрагменты подвергают скринингу на пригодность таким же образом, как и интактные антитела.

"Выделенное" антитело или иммуноглобулин в настоящем изобретении означает антитело или иммуноглобулин, которые практически свободны от других компонентов, в которых эти антитела или иммуноглобулины встречаются в природе. Более того, выделенные антитела или иммуноглобулины могут быть практически свободны от других клеточных материалов и/или химикатов.

Термины "моноклональное антитело" или "композиция моноклонального антитела" в настоящем изобретении относятся к препаратам молекул антител, состоящим из одного вида молекул. Композиция моноклонального антитела обычно проявляет единственную специфичность связывания и сродство к определенному эпитопу,

Термин "антитело человека" в настоящем изобретении охватывает антитела, содержащие вариабельные области, у которых и каркасные, и CDR-участки происходят из последовательностей человека. Кроме того, если антитело содержит константную область, то оно тоже происходит из таких последовательностей человека, напр., последовательностей зародышевой линии человека или мутированных версий последовательностей зародышевой линии человека либо антител, содержащих консенсусные каркасные последовательности, выведенные при анализе каркасных последовательностей человека, как описано в Knappik et al. (2000. J Mol Biol 296, 57-86).

Антитела человека по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями человека (например, мутации, введенные при случайном или сайт-специфическом мутагенезе in vitro или при соматической мутации in vivo). Однако термин "антитело человека" в настоящем изобретении не предусматривает включение антител, у которых в каркасные последовательности человека вставлены последовательности CDR, полученные из последовательностей зародышевой линии других видов млекопитающих типа мыши.

Термин «домен человека» в настоящем изобретении охватывает иммуноглобулиновые домены константной области, произошедшие от человека например, из зародышевой линии человека, иммуноглобулинов человека, например, последовательностей зародышевой линии человека или мутированных версий последовательностей зародышевой линии человека либо антител, содержащих консенсусные каркасные последовательности, выведенные при анализе каркасных последовательностей человека, как описано в Knappik et al. (2000. J Mol Biol 296, 57-86).

Термин "рекомбинантное антитело человека" в настоящем изобретении включает все антитела человека, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные рекомбинантными методами, как-то антитела, выделенные из животных (например, мыши), трансгенных или трансхромосомных по генам иммуноглобулинов человека, или из полученной из них гибридомы, антитела, выделенные из клеток хозяина, трансформированных для экспрессии антител человека, например, из трансфектомы, антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки антител человека, и антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любым другим способом, включающим сплайсинг всех или части последовательностей генов иммуноглобулинов человека на другие последовательности ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека содержат вариабельные области, в которых каркасные и CDR-участки происходят из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. Однако в некоторых воплощениях такие рекомбинантные антитела человека могут подвергаться мутагенезу in vitro (а при использовании животных, трансгенных по последовательностям Ig человека, - соматическому мутагенезу in vivo), при этом аминокислотные последовательности областей V_H и V_L рекомбинантных антител имеют последовательности, которые, хотя они и происходят из и относятся к последовательностям V_H и V_L зародышевой линии человека, в природе могут и не встречаться в репертуаре антител зародышевой линии человека in vivo.

"Химерное антитело" есть такая молекула антитела, в которой (а) константная область или ее часть изменена, заменена или замещена таким образом, что антиген-связывающий сайт (вариабельная область) соединяется с константной областью другого или измененного класса, эффекторной функции и/или вида либо с совершенно другой молекулой, придающей новые свойства химерному антителу, например, ферментом, токсином, гормоном, фактором роста, лекарством и т.д.; или (b) вариабельная область или ее часть изменена, заменена или замещена на вариабельную область, обладающую другой или измененной антигенной специфичностью, мышиное антитело может быть модифицировано путем замены его константной области на константную область из иммуноглобулина человека, содержащего модификацию, как изложено здесь. Вследствие замены на константную область человека химерное антитело может сохранять свою специфичность, но обладать пониженной иммуногенностью для человека и пониженной агрегацией вообще по сравнению с исходным антителом мыши или химерным антителом без приведенной здесь модификации.

"Гуманизированное" антитело есть такое антитело, которое сохраняет реактивность антитела не человека, но становится менее иммуногенным для человека. Это может достигаться, к примеру, сохранением участков CDR не человека и заменой остальных частей антитела на соответствующие части от человека (т.е. константной области, а также каркасных участков вариабельной области). Например, см. Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; и Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994. Другие примеры инженерной технологии на человеке включают, без ограничения, технологию Хота, раскрытую в US 5766886.

Термины "линкер", "звено линкера" или "соединение" в настоящем изобретении относятся к химической молекуле, содержащей ковалентную связь или цепь атомов, ковалентно присоединяющих антитело к лекарственной молекуле или иной молекуле. Линкеры включают двухвалентные радикалы типа алкилдиила, арилена, гетероарилена, такие группировки, как -(CR₂)_nO(CR₂)_n-, повторяющиеся звенья алкилокси (например, полиэтиленокси, ПЭГ, полиметиленокси) и алкиламино (например, полиэтиленамино, Jeffamine™); и двухкислотные эфиры и амиды, включая сукцинат, сукцинамид, дигликолат, малонат и капроамид.

Термин "метка" в настоящем изобретении относится к любым молекулам, которые могут ковале