Три- или тетраспецифические антитела

Три- или тетраспецифические антитела

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к новым три- или тетраспецифическим антителам, их получению и применению.

Предпосылки создания изобретения

В данной области известны сконструированные белки, такие как би- или мультиспецифические антитела, которые могут связываться с двумя или большим количеством антигенов. Такие мультиспецифические связывающие белки можно создавать с помощью методов клеточного слияния, химической конъюгации или рекомбинантной ДНК.

В последние годы создано широкое разнообразие форматов рекомбинантных мультиспецифических антител, таких, например, как четырехвалентные биспецифические антитела, полученные путем слияния, например, антитела IgG-формата и одноцепочечных доменов (см., например, Morrison S.L. и др.. Nature Biotech 15, 1997, ее. 159-163; WO 2001/077342; и Coloma M.J„ Nature Biotech 25, 2007, ее. 1233-1234).

Было разработано также несколько других новых форматов, в которых уже не сохранялась основная структура антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM), таких как димерные (диабоди), тримерные (триабоди) или тетрамерные (тетрабоди) антитела, миниантитела, несколько одноцепочечных форматов (scFv, бис-scFv), которые могут связываться с двумя или большим количеством антигенов (Holliger Р. и др.. Nature Biotech 23, 2005, ее. 1126 - 1136; Fischer N.. Leger О., Pathobiology 74, 2007, ее. 3-14; Shen J и др.. Journal of Immunological Methods 318, 2007, ее. 65-74; Wu С.и др.. Nature Biotech 25, 2007, ее. 1290-1297).

Во всех указанных форматах используют линкеры либо для слияния основной структуры антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) с дополнительным связывающим белком (например, scFv), либо для слияния, например, двух Fab-фрагментов или scFv (Fischer N., Leger О., Pathobiology 74, 2007, ее. 3-14). Хотя очевидно, что линкеры дают преимущества при создании биспецифических антител, с ними могут быть связаны также проблемы терапевтического плана. Фактически эти чужеродные пептиды могут вызывать иммунный ответ против самого линкера или области стыка между белком и линкером. Кроме того, гибкая природа этих пептидов делает их более чувствительными к протеолитическому расщеплению, что может приводить к плохой стабильности, агрегации и повышенной иммуногенности антитела. Кроме того, может существовать необходимость в поддержании эффекторных функций, таких, например, как комплементзависимая цитотоксичность (CDC) или антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC), которые опосредуются Fc-областью, путем сохранения высокой степени сходства с встречающимися в естественных условиях антителами.

Таким образом, в идеальном варианте необходимо создавать биспецифические антитела, структура которых очень близка к общей структуре встречающихся в естественных условиях антител (типа IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) и имеет минимальное отклонение от человеческих последовательностей.

В соответствии с одним из подходов биспецифические антитела с высокой степенью сходства со встречающимися в естественных условиях антителами создавали с помощью технологии квадром (квадрогибридом) (см. Milstein С.и А.С.Cuello, Nature, 305, 1983, ее. 537-540) на основе соматического слияния двух различных клеточных линий гибридом, которые экспрессируют мышиныемоноклональные антитела с требуемыми для биспецифического антитела специфичностями. В результате случайного спаривания тяжелых и легких цепей двух различных антител в образующейся линии клеток гибрида-гибридомы (или квадромы) получают вплоть до 10 различных видов антител, из которых только одно представляет собой требуемое функциональное биспецифическое антитело. Из-за присутствия полученных в результате ошибочного спаривания побочных продуктов и в значительной степени сниженного выхода продукта требуются более сложные процедуры очистки (см., например, Morrison S.L., Nature Biotech 25, 2007, ее. 1233-1234). В целом, эта же проблема, связанная с ошибочно спаренными побочными продуктами, сохраняется и при применении методов рекомбинантной экспрессии.

Подход, с помощью которого можно обойти проблему, связанную с полученными в результате ошибочных спариваний побочными продуктами, известный под названием «Knobs-info-holes»-технология (взаимодействие по типу «выступ-впадина»), направлен на усиление спаривания тяжелых цепей двух различных антител путем интродукции мутаций в СН3 -домены для модификации поверхности раздела в области контакта. На одной цепи, имеющие большие размеры аминокислоты заменяли на аминокислоты с короткими боковыми цепями для создания «впадины». И, наоборот, аминокислоты с более крупными боковыми цепями интродуцировали в другой СН3-домен, создавая «выступ». Путем совместной экспрессии этих двух тяжелых цепей (и двух идентичных легких цепей, которые должны соответствовать обеим тяжелым цепям), достигали высоких выходов гетеродимерной конструкции («выступ-впадина») по сравнению с выходом гомодимерной конструкции («впадина-впадина» или «выступ-выступ») (Ridgway J. В. и др.. Protein Eng. 9, 1996, ее. 617-621; и WO 1996/027011). Процентное содержание гетеродимера можно дополнительно повышать путем ремоделирования поверхностей раздела двух СН3-доменов с помощью технологии фагового дисплея и интродукции дисульфидного мостика с целью стабилизации гетеродимеров (Merchant A.M и др.. Nature Biotech 16, 1998, ее. 677-681; Atwell S„ Ridgway J.B., Wells J.A„ Carter P., J Mol Biol 270, 1997, ее. 26-35). Новые подходы к технологии «knobs-into-holes» описаны, например, в ЕР 1870459А1. Хотя указанный формат, вероятно, является очень привлекательным, в настоящее время отсутствуют данные о его усовершенствовании в направлении клинического применения. Одним из важных ограничений этой стратегии является то, что легкие цепи двух родительских антител должны быть идентичными для предупреждения ошибочного спаривания и формирования неактивных молекул. Таким образом, эта технология не пригодна в качестве основы для более легкого создания рекомбинантных три- или тетраспецифических антител к трем или четырем антигенам с использованием в качестве исходных двух антител к первому и второму антигену, поскольку сначала должны быть оптимизированы тяжелые цепи этих антител и/или идентичные легкие цепи, а затем необходимо добавлять дополнительные антигенсвязывающие пептиды, обладающие специфичностью в отношении третьего и четвертого антигена.

В WO 2006/093794 описаны композиции гетеродимерных связывающих белков. В WO 99/37791 описаны многоцелевые производные антител. В статье Morrison S.L. и др., J. Immunol. 160, 1998, ее. 2802-2808 описано влияние замены домена вариабельной области на функциональные свойства IgG.

Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к триспецифическому или тетраспецифическому антителу, содержащему:

а) легкую цепь и тяжелую цепь полноразмерного антитела, обладающего способностью специфически связываться с первым антигеном; и

б) модифицированную легкую цепь и модифицированную тяжелую цепь полноразмерного антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном, в которых вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга, и/или в которых константные домены CL и СН1 заменены друг на друга; и

в) в котором от одного до четырех антигенсвязывающих пептидов, обладающих способностью специфически связываться с одним или двумя другими антигенами, слиты посредством пептида-коннектора с С- или N-концом легких цепей или тяжелых цепей, указанных в подпунктах а) и/или б).

Другим вариантом осуществления изобретения является способ получения триспецифического или тетраспецифического антитела, предлагаемого в изобретении, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых

а) трансформируют клетку-хозяина

- векторами, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие

аа) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, обладающего способностью специфически связываться с первым антигеном; и

аб) модифицированную легкую цепь и модифицированную тяжелую цепь полноразмерного антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном, в которых вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга, и/или в которых константные домены CL и СН1 заменены друг на друга; и

ав) в которых от одного до четырех антигенсвязывающих пептидов, обладающих способностью специфически связываться с одним или двумя другими антигенами, слиты посредством пептида-коннектора с С- или N-концом легких цепей или тяжелых цепей, указанных в подпунктах аа) и/или аб);

б) культивируют клетку-хозяина в условиях, в которых может осуществляться синтез указанной молекулы антитела; и

в) выделяют молекулу антитела из культуры. Следующим вариантом осуществления изобретения является клетка-хозяин, содержащая

-векторы, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие

а) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, обладающего способностью специфически связываться с первым антигеном; и

б) модифицированную легкую цепь и модифицированную тяжелую цепь полноразмерного антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном, в которых вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга, и/или в которых константные домены CL и СН1 заменены друг на друга; и

в) в которых от одного до четырех антигенсвязывающих пептидов, обладающих способностью специфически связываться с одним или двумя другими антигенами, слиты посредством пептида-коннектора с С- или N-концом легких цепей или тяжелых цепей, указанных в подпунктах а) и/или б).

Следующим вариантом осуществления изобретения является композиция, предпочтительно фармацевтическая или диагностическая композиция, которая содержит антитело, предлагаемое в изобретении.

Следующим вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержит антитело, предлагаемое в изобретении, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.

Следующим вариантом осуществления изобретения является способ лечения пациента, который нуждается в терапии, отличающийся тем, что вводят пациенту в терапевтически эффективном количестве антитело, предлагаемое в изобретении.

Согласно изобретению соотношение между триспецифическим или тетраспецифическим антителом и нежелательными побочными продуктами можно повышать путем замены конкретных доменов только в той паре тяжелой цепи и легкой цепи (HC/LC) полноразмерного антитела, которая обладает способностью специфически связываться со вторым антигеном (второе антитело). Таким путем можно снижать количество нежелательных ошибочных спариваний легкой цепи с несоответствующей ей тяжелой цепью (т.е. легкой цепи первого антитела с тяжелой цепью второго антитела или легкой цепи второго антитела с тяжелой цепью первого антитела).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к триспецифическому или тетраспецифическому антителу, содержащему:

а) легкую цепь и тяжелую цепь полноразмерного антитела, обладающего способностью специфически связываться с первым антигеном; и

б) модифицированную легкую цепь и модифицированную тяжелую цепь полноразмерного антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном, в которых вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга, и/или в которых константные домены CL и СН 1 заменены друг на друга; и

в) в котором от одного до четырех антигенсвязывающих пептидов, обладающих способностью специфически связываться с одним или двумя другими антигенами, слиты посредством пептида-коннектора с С- или N-концом легких цепей или тяжелых цепей, указанных в подпунктах а) и/или б).

В одном из вариантов осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, содержит в качестве антигенсвязывающих пептидов, указанных в подпункте в), один или два антигенсвязывающих пептида, обладающих способностью специфически связываться с одним или двумя другими антигенами.

В одном из вариантов осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что антигенсвязывающие пептиды выбраны из группы, включающей scFv-фрагмент и scFab-фрагмент.

В одном из вариантов осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что антигенсвязывающие пептиды представляют собой scFv-фрагменты.

В одном из вариантов осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что антигенсвязывающие пептиды представляют собой scFab-фрагменты.

В одном из вариантов осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что антигенсвязывающие пептиды слиты с С-концом тяжелых цепей, указанных в подпунктах а) и/или б).

В одном из вариантов осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, содержит в качестве антигенсвязывающих пептидов, указанных в подпункте в), один или два антигенсвязывающих пептида, обладающих способностью специфически связываться с одним дополнительным антигеном.

В одном из вариантов осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, содержит в качестве антигенсвязывающих пептидов, указанных в подпункте в), два идентичных антигенсвязывающих пептида, обладающих способностью специфически связываться с третьим антигеном. Предпочтительно эти оба идентичных антигенсвязывающих пептида слиты посредством одного и того же пептида-коннектора с С-концом тяжелых цепей, указанных в подпунктах а) и б). Предпочтительно указанные два идентичных антигенсвязывающих пептида представляют собой либо scFv-фрагмент, либо scFab-фрагмент.

В одном из вариантов осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, содержит в качестве антигенсвязывающих пептидов, указанных в подпункте в), два антигенсвязывающих пептида, обладающих способностью специфически связываться с третьим и четвертым антигенами. В одном из вариантов осуществления изобретения указанные два антигенсвязывающих пептида слиты оба посредством одного и того же пептида-коннектора с С-концом тяжелых цепей, указанных в подпунктах а) и б). Предпочтительно указанные два идентичных антигенсвязывающих пептида представляют собой либо scFv-фрагмент, либо scFab-фрагмент.

Согласно изобретению, соотношение между требуемым триспецифическим или тетраспецифическим антителом и нежелательными побочными продуктами (образующимися вследствие ошибочного спаривания легкой цепи с «несоответствующей» тяжелой цепью антитела, обладающего способностью специфически связываться с другим антигеном) можно повышать путем замены конкретных доменов только в одной паре тяжелой цепи и легкой цепи (HC/LC). В то время как первая из двух пар полноразмерных HC/LC-цепей происходит из антитела, обладающего способностью специфически связываться с первым антигеном, и остается практически без изменения, вторая из двух пар полноразмерных HC/LC-цепей происходит из антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном, и ее модифицируют путем следующих замен:

- в легкой цепи:

замена вариабельного домена VL легкой цепи на вариабельный домен VH тяжелой цепи антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном, и/или константного домена CL легкой цепи на константный домен СН1 тяжелой цепи антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном, и

- в тяжелой цепи: замена вариабельного домена VH тяжелой цепи на вариабельный домен VL легкой цепи антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном, и/или константного домена СН1 тяжелой цепи на константный домен CL легкой цепи антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном.

Затем с таким обеспечивающим указанное выше улучшенное соотношение биспецифическим антителом сливают от одного до четырех антигенсвязывающих пептидов, обладающих способностью специфически связываться с одним или двумя другими антигенами, присоединяя их посредством пептида-коннектора к С- или N-концу легких цепей или тяжелых цепей указанных двух антител, обладающих способностью специфически связываться с первым и вторым антигеном, в результате чего получают триспецифическое и тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении.

Таким образом, полученные триспецифическое и тетраспецифическое антитела, предлагаемые в изобретении, представляют собой искусственные антитела, содержащие

а) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, обладающего способностью специфически связываться с первым антигеном; и

б) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном,

где легкая цепь (антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном) содержит вариабельный домен VH вместо VL

и/или константный домен СН1 вместо CL

где тяжелая цепь (антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном) содержит вариабельный домен VL вместо VH

и/или константный домен CL вместо СНl.

Согласно дополнительному объекту изобретения такое улучшенное соотношение между требуемым двухвалентным биспецифическим антителом и нежелательными побочными продуктами можно еще более улучшать путем осуществления модификаций СН3-доменов полноразмерных антител, которые обладают способностью специфически связываться с первым и вторым антигенами, присутствующих в три- или тетраспецифическом антителе.

Так, в одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения СН3-домены указанного три- или тетраспецифического антитела (содержащиеся в тяжелой цепи и в модифицированной тяжелой цепи), предлагаемого в изобретении, можно изменять с помощью технологии «knob-into-holes», которая описана подробно на нескольких примерах, например, в WO 96/027011, у Ridgway J.B. и др.. Protein Eng 9, 1996, ее. 617-621; и у Merchant A.M. и др., Nat Biotechnol 16, 1998, ее. 677-681. При использовании этого метода взаимодействующие поверхности двух СН3-доменов изменяют с целью повышения гетеродимеризации обеих тяжелых цепей, содержащих эти два СН3-домена. Каждый из. двух СH3-доменов (двух тяжелых цепей) может представлять собой «выступ», а другой представлять собой «впадину». Введение дисульфидного мостика дополнительно стабилизирует гетеродимеры (Merchant А.М, и др.. Nature Biotech 16, 1998, ее. 677-681; Atwell S. и др., J Mol Biol 270, 1997, ее. 26-35) и повышает выход продукта.

Таким образом, согласно одному из объектов изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело дополнительно отличается тем, что

СН3-домен тяжелой цепи полноразмерного антитела, указанного в подпункте а), и СН3-домен модифицированной тяжелой цепи полноразмерного антитела, указанного в подпункте б), каждый соприкасается друг с другом на поверхности раздела, которая представляет собой исходную поверхность раздела между СН3-доменами антитела;

при этом поверхность раздела изменена для стимулирования формирования триспецифического или тетраспецифического антитела, где изменение отличается тем, что:

I) СН3-домен одной тяжелой цепи изменен

таким образом, чтобы на исходной поверхности раздела СН3-домена одной тяжелой цепи, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела СН3-домена другой тяжелой цепи в три- или тетраспецифическом антителе,

аминокислотный остаток был заменен на аминокислотный остаток, который имеет большую по объему боковую цепь, создавая тем самым «выпуклость» на поверхности раздела СН3-домена одной тяжелой цепи, которая может помещаться в «полость» на поверхности раздела СН3-домена другой тяжелой цепи, и

II) СН3-домен другой тяжелой цепи изменен

таким образом, чтобы на исходной поверхности раздела второго СН3-домена, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела первого СН3-домена в три- или тетраспецифическом антителе,

аминокислотный остаток был заменен на аминокислотный остаток, который имеет меньшую по объему боковую цепь, создавая тем самым «полость» на поверхности раздела второго СН3-домена, в которую может помещаться «выпуклость» на поверхности раздела первого СН3-домена.

Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, который имеет большую по объему боковую цепь, выбирают из группы, включающей аргинин (R), фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W).

Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, который имеет меньшую по объему боковую цепь, выбирают из группы, включающей аланин (А), серин (S), треонин (Т), валин (V).

Согласно одному из объектов изобретения оба СН3-домена дополнительно изменяют путем интродукции цистеина (С) в качестве аминокислоты в соответствующие положения каждого СН3-домена таким образом, чтобы мог образоваться дисульфидный мостик между обоими СН3-доменами.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело содержит мутацию T366W в СН3-домене имеющей «выступ» цепи («knobs-цепь») и мутации T366S, L368A, Y407V в СН3-домене имеющей «впадину» цепи («hole-цепь»). Можно применять также дополнительный связывающий цепи дисульфидный мостик между СН3-доменами (Merchant A.M. и др.. Nature Biotech. 16, 1998, ее. 677-681), например, путем интродукции мутации Y349C в СН3-домен имеющей «выступ» цепи и мутации Е356С или мутации S354C в СН3-домен имеющей «впадину» цепи. Так, в другом предпочтительном варианте осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело имеет мутации Y349C, T366W в одном из двух СН3-доменов и мутации Е356С, T366S, L368A, Y407V во втором из двух СН3-доменов или указанное триспецифическое или тетраспецифическое антитело имеет мутации Y349C, T366W в одном из двух СН3-доменов и мутации S354C, T366S, L368A, Y407V во втором из двух СН3-доменов (дополнительная мутация Y349C в одном из СН3-доменов и дополнительная мутация Е356С или S354C во втором СН3-домене образуют расположенный между цепями дисульфидный мостик) (нумерация во всех случаях соответствует нумерации EU по Кэботу). В альтернативном варианте или дополнительно можно применять также и другие технологии «knobs-in-Ьо1ез»-типа, описанные в ЕР 1870459А1. Предпочтительным примером мутаций для рассматриваемого триспецифического или тетраспецифического антитела являются мутации R409D; К370Е в СН3-домене имеющей «выпуклость» цепи и мутации D399K; Е357К в СН3-домене имеющей «впадину» цепи (нумерация во всех случаях соответствует нумерации EU по Кэботу).

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело содержит мутацию T366W в СН3-домене имеющей «выпуклость» цепи и мутации T366S, L368A, Y407V в СН3-домене имеющей «впадину» цепи и дополнительные мутации R409D; К370Е в СН3-домене имеющей «выпуклость» цепи и мутации D399K; Е357К в СН3-домене имеющей «впадину» цепи.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело содержит мутации Y349C, T366W в одном из двух СН3-доменов и мутации S354C, T366S, L368A, Y407V во втором из двух СН3-доменов или указанное триспецифическое или тетраспецифическое антитело содержит мутации Y349C, T366W в одном из двух СН3-доменов и мутации S354C, T366S, L368A, Y407V во втором из двух СН3-доменов и дополнительно содержит мутации R409D; К370Е в СН3-домене имеющей «выпуклость» цепи и мутации D399K; Е357К в СН3-домене имеющей «впадину» цепи.

Понятие «полноразмерное антитело» обозначает антитело, состоящее из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела (см. фиг.1). Тяжелая цепь полноразмерного антитела представляет собой полипептид, состоящий из расположенных в направлении от N-конца к С-концу вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH), константного домена 1 тяжелой цепи антитела (СН1), шарнирной области антитела (HR), константного домена 2 тяжелой цепи антитела (СН2), и константного домена 3 тяжелой цепи антитела (СН3), сокращенно обозначенных как VH-CH1-HR-CH2-CH3; и необязательно константного домена 4 тяжелой цепи антитела (СН4) в случае антитела подкласса IgE. Предпочтительно тяжелая цепь полноразмерного антитела представляет собой полипептид, состоящий из расположенных в направлении от N-конца к С-концу VH, СН1, HR, СН2 и СН3. Легкая цепь полноразмерного антитела представляет собой полипептид, состоящий из расположенных в направлении от N-конца к С-концу вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и константного домена легкой цепи антитела (CL), сокращенно обозначенных как VL-CL. Константный домен легкой цепи (CL) может относиться к к- (каппа) или К- (лямбда)-типу. Цепи полноразмерного антитела сцеплены друг с другом посредством межполипептидных дисульфидных связей между доменом CL и СН1-доменом (т.е. между легкой и тяжелой цепью) и между шарнирными областями тяжелых цепей полноразмерного антитела. Примерами типичных полноразмерных антител являются встречающиеся в естественных условиях антитела типа IgG (например, IgG 1 и IgG2), IgM, IgA, IgD и IgE. Полноразмерные антитела, предлагаемые в изобретении, могут происходить из одного вида, например, представлять собой человеческие антитела, или они могут представлять собой химерные или гуманизированные антитела. Полноразмерные антитела, предлагаемые в изобретении, содержат два антигенсвязывающих центра, каждый из которых образован парой VH и VL, которые оба специфически связываются с одним и тем же антигеном. С-концом тяжелой или легкой цепи полноразмерного антитела обозначают последнюю аминокислоту на С-конце рассматриваемой тяжелой или легкой цепи. В контексте настоящего изобретения понятие «пептид-коннектор» обозначает пептид, аминокислотные последовательности которого предпочтительно являются синтетическими. Такие пептиды-коннекторы, предлагаемые в изобретении, применяют для слияния антигенсвязывающих пептидов с С- или N-концом цепей полноразмерного и/или модифицированного полноразмерного антитела с образованием триспецифического или тетраспецифического антитела, предлагаемого в изобретении. Предпочтительно пептиды-коннекторы, указанные в подпункте в), представляют собой пептиды, аминокислотная последовательность которых состоит по меньшей мере из 5 аминокислот, предпочтительно состоит из 5 - 100, более предпочтительно из 10-50 аминокислот.В одном из вариантов осуществления изобретения пептид-коннектор представляет собой конструкцию (GxS)n или (GxS)nGm, где G обозначает глицин, S обозначает серии и (х=3, n=3, 4, 5 или 6, и m=0, 1, 2 или 3) или (х=4, n=2, 3, 4 или 5 и m=0, 1, 2 или 3), предпочтительно х=4 и n=2 или 3, более предпочтительно х=4, n=2. В одном из вариантов осуществления изобретения пептид-коннектор представляет собой конструкцию (G4S)2.

Понятие «антигенсвязывающий пептид» используют для обозначения одновалентного антигенсвязывающего фрагмента или производного полноразмерного антитела, включающего вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH) и/или вариабельный домен легкой цепи антитела (VL), или пару VH/VL, которые выведены из полноразмерного антитела или фрагментов антитела, таких как домен VH и/или домен VL, одноцепочечный Fv- (scFv-) фрагмент, или одноцепочечный Fab- (scFab-) фрагмент.Предпочтительно антигенсвязывающий пептид содержит по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH) и вариабельный домен легкой цепи антитела (VL). В предпочтительном варианте осуществления изобретения такие антигенсвязывающие пептиды выбирают из группы, включающей домен VH, одноцепочечный Fv- (scFv-) фрагмент и одноцепочечный Fab- (scFab-) фрагмент, предпочтительно из группы, включающей одноцепочечный Fv- (scFv-) фрагмент и одноцепочечный Fab- (scFab-) фрагмент.

В контексте настоящего описания понятия «сайт связывания» или «антигенсвязывающий центр» обозначают область(и) молекулы антитела, с которой(ыми) фактически связывается лиганд (например, антиген или фрагмент антигена) и который выведен из антитела. Антигенсвязывающий центр включает вариабельные домены тяжелой цепи антитела (VH) и/или вариабельные домены легкой цепи антитела (VL), или пары VH/VL.

Антигенсвязывающие центры, обладающие способностью специфически связываться с требуемым антигеном, можно выводить из а) известных антител к антигену или б) новых антител или фрагментов антител, полученных de novo с помощью методов иммунизации с использованием, среди прочего, либо белка, либо нуклеиновой кислоты антигена или его фрагментов, или с помощью метода фагового дисплея.

Антигенсвязывающий центр антитела, предлагаемого в изобретении, может содержать шесть гипервариабельных участков (CDR), которые вносят различный вклад в аффинность сайта связывания с антигеном. Они представляют собой три вариабельных домена (CDR-участки) тяжелой цепи (CDRH1, CDRH2 и CDRH3) и три вариабельных домена (CDR-участки) легкой цепи (CDRL1, CDRL2 и CDRL3). Размер CDR и каркасных участков (FR) определяют путем сравнения с компилированной базой данных аминокислотных последовательностей, в которых такие участки были определены на основе вариабельности последовательностей. Под объем изобретения подпадают также функциональные антигенсвязывающие центры, содержащие меньшее количество CDR (т.е. такие, в которых специфичность связывания обеспечивается тремя, четырьмя или пятью CDR). Например, для связывания может оказаться достаточным неполный (т.е. включающий менее 6) набор CDR. В некоторых случаях может оказаться достаточным наличие VH- или VL-домена.

Специфичность антитела характеризует избирательное распознавание антителом конкретного эпитопа антигена. Например, встречающиеся в естественных условиях антитела являются моноспецифическими. Биспецифические антитела представляют собой антитела, которые обладают специфичностью связывания с двумя различными антигенами. Соответственно, триспецифические антитела представляют собой антитела, предлагаемые в изобретении, которые обладают специфичностью связывания с тремя различными антигенами. Тетраспецифические антитела, предлагаемые в изобретении, представляют собой антитела, предлагаемые в изобретении, которые обладают специфичностью связывания с четырьмя различными антигенами.

Когда антитела обладают более чем одной специфичностью, то распознаваемые эпитопы могут быть ассоциированы с одним антигеном или несколькими антигенами.

В контексте настоящего описания понятие «моноспецифическое» антитело обозначает антитело, которое имеет один или несколько сайтов связывания, каждый из которых связывается с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена.

В контексте настоящего описания понятие «валентность» означает наличие определенного количества сайтов связывания в молекуле антитела. Например, встречающееся в естественных условиях антитело или полноразмерное антитело, предлагаемое в изобретении, имеет два сайта связывания и является двухвалентным. Таким образом, понятие «трехвалентный» означает наличие трех сайтов связывания в молекуле антитела. В контексте настоящего описания понятие «трехвалентное, триспецифическое» антитело обозначает антитело, которое имеет три антигенсвязывающих центра, каждый из которых связывается с отличным от других антигеном (или отличным от других эпитопом антигена). Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют от трех до шести сайтов связывания, т.е. они являются трех-, четырех-, пяти- или шестивалентными (предпочтительно трех- или четырехвалентными) и являются три- или тетраспецифическими.

«scFv-фрагмент» или «одноцепочечный Fv-фрагмент» (см. фиг.26) представляет собой полипептид, состоящий из вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH), вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и одноцепочечного Fv-линкера, в котором указанные домены антитела и указанный одноцепочечный Fv-линкер расположены в направлении от N-концу к С-концу в одном из следующих порядков: а) VH-одноцепочечный Ру-линкер-УЬ, б) VL-одноцепочечный Ру-линкер-УН; предпочтительно а) VH-одноцепочечный Fv-mraKep-VL, и в котором указанный одноцепочечный Fv-линкер представляет собой полипептид, аминокислотная последовательность которого состоит по меньшей мере из 15 аминокислот, в одном из вариантов осуществления изобретения она состоит по меньшей мере из 20 аминокислот.Понятие «N-конец» обозначает последнюю аминокислоту на N-конце, понятие «С-конец» обозначает последнюю аминокислоту на С-конце.

Понятие «одноцепочечный Fv-линкер», используемое при описании одноцепочечного Fv-фрагмента, обозначает пептид, аминокислотные последовательности которого предпочтительно получены синтетическим путем. Такой одноцепочечный Fv-линкер представляет собой пептид, аминокислотная последовательность которого состоит по меньшей мере из 15 аминокислот, в одном из вариантов осуществления изобретения она состоит по меньшей мере из 20 аминокислот и предпочтительно она состоит из 15-30 аминокислот.В одном из вариантов осуществления изобретения одноцепочечный линкер представляет собой конструкцию (GxS)n, где G обозначает глицин, S обозначает серии, (х=3 и п=4, 5 или 6) или (х=4 и п=3, 4, 5 или 6), предпочтительно х=4, n=3, 4 или 5, более предпочтительно х=4, n=3 или 4. В одном из вариантов осуществления изобретения одноцепочечный Fv-линкер представляет собой конструкцию (648)3 или (048)4.

Кроме того, одноцепочечные Fv-фрагменты предпочтительно стабилизируют с помощью дисульфидных связей. Такую дополнительную дисульфидную стабилизацию одноцепочечных антител обеспечивают путем интродукции дисульфидной связи между вариабельными доменами одноцепочечных антител, она описана, например, в WO 94/029350, у Rajagopal V. и др., Prot. Engin. 10, 1997, ее. 1453-1459; Kobayashi H. и др.. Nuclear Medicine & Biology 25, 1998, ее. 387-393; и у Schmidt M. и др., Oncogene 18, 1999, ее. 1711 -1721.

В одном из вариантов стабилизированных с помощью дисульфидной связи одноцепочечных Fv-фрагментов дисульфидную связь между вариабельными доменами одноцепочечных Fv-фрагментов, которые содержатся в антителе, предлагаемом в изобретении, выбирают независимо для каждого одноцепочечного Fv-фрагмента из связей между:

I) положением 44 в вариабельном домене тяжелой цепи и положением 100 в вариабельном домене легкой цепи,

II) положением 105 в вариабельном домене тяжелой цепи и положением 43 в вариабельном домене легкой цепи, и

III) положением 101 в вариабельном домене тяжелой цепи и положением 100 в вариабельном домене легкой цепи.

В одном из вариантов осуществления изобретения дисульфидная связь между вариабельными доменами одноцепочечных Fv-фрагментов, содержащихся в антителе, предлагаемом в изобретении, находится между положением 44 в вариабельном домене тяжелой цепи и положением 100 в вариабельном домене легкой цепи.

«scFab-фрагмент» или «одноцепочечный Fab-фрагмент» (см. фиг.2а) представляет собой полипептид, состоящий из вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH), константного домена 1 антитела (СН1), вариабельного домена легкой цепи антитела (VL), константного домена легкой цепи антитела (CL) и линкера, где указанные домены антитела и указанный линкер расположены в направлении от N-конца к С-концу в одном из следующих порядков: a) VH-CHl-nHHKep-VL-CL, б) VL-CL-линкер-VН-СH, в) VH-CL-линкер-VL-CHl или г) VL-CH1-линкер-VH-CL; и где указанный линкер представляет собой полипептид, состоящий по меньшей мере из 30 аминокислот, предпочтительно из 32 - 50 аминокислот.Указанные одноцепочечные Fab-фрагменты, а именно, a) VH-CHl-nHHKep-VL-CL, б) VL-CL-линкер-VH-CHL, в) VН-СL-линкер-VL-СН1 и г) VL-CH1-линкер-VH-CL, стабилизируют с помощью встречающейся в естественных условиях дисульфидной связи, расположенной между CL-доменом и СН1-доменом. Понятие «N-конец» обозначает последнюю аминокислоту на N-конце, понятие «С-конец» обозначает последнюю аминокислоту на С-конце.

В контексте настоящего изобретения понятие «линкер» обозначает пептид, аминокислотная последовательность которого предпочтительно получена синтетическим путем. Такие пептиды применяют согласно изобретению для связывания a) VH-CH1 с VL-CL, б) VL-CL с VH-CH1, в) VH-CL с VL-CH1 или г) VL-CH1 с VH-CL с образованием следующих одноцепочечных Fab-фрагментов, предлагаемых в изобретении: а) VH-CH1-линкер-VL-CL, б) VL-CL-линкер-VH-СН1, в) VH-CL-линкер-VL-CHI или г) VL-CH1-линкер-VH-CL. Такой линкер, присутствующий в одноцепочечных Fab-фрагментах, представляет собой пептид, аминокислотная последовательность которого состоит по меньшей мере из 30 аминокислот, предпочтительно из 32-50 аминокислот.В одном из вариантов осуществления изобретения линкер представляет собой конструкцию (GxS)n, где G обозначает глицин, S обозначает серин, (х=3, n=8, 9 или 10 и m=О, 1, 2 или 3) или (х=4 и n=6, 7 или 8 и m=0, 1, 2 или 3), предпочтительно х=4, n=6 или 7 и m=0, 1, 2 или 3, более предпочтительно х=4, n=7 и m=2. В одном и