Способы выявления в белках областей, ответственных за связывание макромолекул, и областей, склонных к агрегации, и их применение

Способы выявления в белках областей, ответственных за связывание макромолекул, и областей, склонных к агрегации, и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Уровень техники

Понимание и контролирование стабильности белков было желанным устремлением биологов, химиков и инженеров. Первая связь между аминокислотной заменой и заболеванием (Ingram. Nature. 1957, 180(4581):326-8) открыла новые и имеющие принципиальное значение горизонты в области исследований стабильности белков в норме и патологии. Серьезное увеличение количества препаратов на основе белков в последнее время, особенно препаратов на основе иммуноглобулинов, привело к появлению новой проблемы. Терапевтические белки хранятся в жидкости в течение нескольких месяцев в очень высоких концентрациях. С течением времени увеличивается процент немономерных видов. Образование агрегатов не только уменьшает эффективность продукта, но также может привести к появлению побочных эффектов, таких как иммунный ответ на введение. Гарантия стабильности белкового фармацевтического препарата в течение срока годности продукта является первоочередным требованием. По причине высокого потенциала антител при лечении различных заболеваний, в настоящее время антитела являются наиболее быстро растущим классом терапевтических препаратов для человека (Carter. Nature Reviews Immunology. 2006, 6(5), 343). С 2001 г., рынок таких препаратов растет в среднем ежегодно со скоростью 35%, с наибольшей скоростью среди всего категорий биотехнологических лекарственных средств (S. Aggarwal, Nature. BioTech. 2007, 25 (10) 1097). Терапевтические антитела получают и хранят в водных растворах в высоких концентрациях, т.к. это требуется для лечения заболеваний. Однако в таких условиях эти иммуноглобулины являются термодинамически нестабильными и деградируют в результате агрегации. Агрегация, в свою очередь, приводит к уменьшению активности антител, делая лекарственное средство неэффективным, и даже может вызвать иммунный ответ. В силу этого, существует острая потребность в разработке понимания механизма того, как в большинстве случаев агрегируют эти антитела и вообще белки для того, чтобы открыть области белка, вовлеченные в агрегацию и разработать стратегии для воспрепятствования агрегации.

Эти эффекты являются особенно важными для терапевтических средств на основе антитела. Один подход стабилизации антител представляет собой прививку CDR-петель, которые придают специфичность антигенного связывания более стабильному каркасу (Ewert, Honegger, and Pluckthun, Biochemistry. 2003, 42(6):1517-28). Этот способ будет работать, только если аминокислотная последовательность в CDR-шпильках не является движущей силой агрегации, и если прививка CDR-шпилек на более стабильный каркас не изменит специфичности связывания антигена.

Технология, относящаяся к прогнозированию областей белка, склонных к агрегации, может быть разделена на две категории, 1) Феноменологических моделей и 2) методик молекулярного моделирования. Феноменологические модели, главным образом, основаны на прогнозировании 'горячих точек' агрегации на основании первичных последовательностей с использованием таких свойств, как гидрофобность, склонность к образованию структуры β-листа и т.д., тогда как методика молекулярного моделирования использует трехмерную структуру и динамические свойства белков для локализации областей, склонных к агрегации. Большинство методик направлено на понимание процесса образования амилоидных фибрилл и агрегации других небольших белков, где превалирует образование структуры β-листа. Феноменологические модели разрабатываются на основе физико-химических свойств, таких как гидрофобность, склонность к образованию структуры β-листа и т.д., для прогнозирования областей, склонных к агрегации на основе первичной последовательности белка (Caflisch, Current Opinion in Chemical Biology. 2006, 10, 437-444; Chiti and Dobson. Annu. Rev. Biochem. 2006, 75:333-366). Одна из первоначальных феноменологических моделей была основана на мутационных исследованиях кинетики агрегации небольшого глобулярного белка человеческой мышечной ацилфосфатазы (АсР) наряду с другими неструктурированными пептидами и нативно развернутыми белками (Chiti et al. Nature. 2003, 424 р.805-808; патент США №7379824). Это исследование обнаружило простые корреляции между агрегацией и физико-химическими свойствами, такими как склонность к образованию структуры β-листа, гидрофобность и заряд. Эти исследования проводили в условиях, при которых белки в основном не структурированы. Таким образом, разработана трехпараметрическая эмпирическая модель, которая связывает последовательность со склонностью к агрегации (Chiti et al. Nature. 2003, 424, 805-808). Эта модель также использовалась для предложения вариантов пептидного гормона кальцитонина, содержащего 32 остатка, для уменьшения его склонности к агрегации (Fowler et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2005, 102, 10105-10110). DuBay и сотрудники расширили это трехпараметрическое уравнение (Chiti et al. Nature. 2003, 424, 805-808) до семипараметрической формулы, которая включает собственные свойства полипептидной цепи и внешние факторы, относящиеся к окружающей среде, такие как концентрация пептида, значение рН и ионная сила раствора) (Dubay et al. J Mol Biol. 2004, 341, 1317-1326). Используя эту модель, они были способны воспроизводить in vitro степени агрегации широкого спектра неструктурированных пептидов и белков. Однако основное ограничение семипараметрической модели состоит в том, что все остатки в последовательности имели одинаковую относительную важность. Это не согласуется с экспериментальными наблюдениями и наблюдениями при моделировании, которые демонстрируют, что определенные участки являются более важными, чем другие, в зависимости от склонностей их вторичной структуры. Недавно, этот анализ был дополнительно расширен для включения коэффициентов защиты с целью описания агрегации структурированных полипептидных цепей (Tartaglia G.G., Pawar A.P., Campioni S., Dobson С.М., Chiti F. and Vendruscolo M. J Mol Biol (2008) в печати). Некоторые из прогнозированных сайтов согласовывались с известными сайтами склонности к агрегации для белков, таких как лизоцим, миоглобин и т.д. Была разработана также феноменологическая модель без свободных параметров (Tartaglia et al. Protein Sci 2004. 13, 1939-1941; Tartaglia et al. Protein Sci 2005, 14, 2723-2734) для прогнозирования изменений в степени элонгации агрегированных фибрилл при мутации и для идентификации сегментов, склонных к агрегации. Используемые физико-химические свойства представляют собой изменение в склонности к образованию структуры β-листа при мутации, изменение в количестве ароматических остатков, и изменение общего заряда. Кроме того, принимается во внимание соотношение доступной площади поверхности, если боковые цепи дикого типа и мутантные боковые цепи обе являются полярными или неполярными, тогда как дипольный момент полярной боковой цепи используется в случае мутации с неполярной на полярную (или с полярной на неполярную). Эта модель воспроизводит относительную склонность к агрегации набора из 26 гептапептидных последовательностей, которые, как было спрогнозировано, имеют предпочтение к образованию структуры в виде параллельно расположенных β-листов.

Модель DuBay и сотрудников (Dubay et al. J Mol Biol, 2004, 341, 1317-1326) была модифицирована с включением склонности к образованию структуры ос-спирали и гидрофобного структурирования, и сравнения балльной оценки склонности к агрегации данной аминокислотной последовательности со средней склонностью к агрегации, рассчитанной для набора последовательностей похожей длины (Pawar et al., J Mol Biol. 2005, 350, 379-392). Эта модель была подтверждена с помощью сегментов, склонных к агрегации, трех нативно не структурированных полипептидных цепей: Аβ42, α-синуклеина и tau-белка.

Был разработан другой алгоритм, называемый TANGO (Fernandez-Escamilla, et al., Nat Biotechnol. 2004, 22, 1302-1306), который уравновешивает те же физико-химические параметры, поддержанные предположением того, что аминокислота полностью скрыта в агрегированном состоянии. Это основано на склонности вторичной структуры к десольватации и оценке штрафа за десольватацию для прогнозирования участков β-агрегации последовательности белка, а также мутационных эффектов. В отличие от моделей, обсуждаемых выше, TANGO принимает во внимание стабильность нативного состояния путем использования силового поля FOLD-X. Хотя невозможно рассчитать абсолютные степени агрегации с помощью TANGO, эта модель обеспечивает качественное сравнение между пептидами или белками, значительно отличающимися по последовательности. Serrano и сотрудники (Linding et al., J Mol Biol. 2004, 342, 345-353) использовали TANGO для анализа склонности к β-агрегации набора неизбыточных глобулярных белков с верхним ограничением идентичности последовательности 40%.

Следующий алгоритм. Прогнозирование Агрегации Амилоидной Структуры (PASTA), был недавно представлен путем редактирования попарно функции энергии для остатков, расположенных друг напротив друга внутри β-листа (Trovato et al., Protein Engineering, Design & Selection. 2007, 20(10), 521-523; Trovato et al., PLoS Comput. Biol. 2006, 2, 1608-1618; Trovato et al., J. Phys.: Condens. Matter. 2007 19, 285221). Yoon and Welsh (Yoon and Welsh, Protein Sci 2004, 13:2149-2160) разработали способ на основе структуры для детектирования склонности к β-агрегации сегмента белка, обусловленной рядом третичных контактов. При помощи передвигаемого окна на семь остатков сегменты с сильной тенденцией к образованию структуры β-листа в близко расположенном окружении (т.е. с высоким количеством третичных контактов) были предложены в качестве локальных медиаторов образования фибрилл. В то время, как продемонстрировано, что феноменологические модели, описанные выше, эффективны для небольших пептидов и денатурированных белков, склонность к агрегации может отличаться для глобулярных белков, таких как антитела, где третичная структура и стабильность нативного состояния являются очень важными.

Методы молекулярного моделирования для предсказания областей склонных к агрегации, и для изучения механизма агрегации в основном используют сравнительно простые симуляционные модели (Ма and Nussinov. Curr. Opin. Chem. Biol. 2006, 10, 445-452; Cellmer et al., TRENDS in Biotechnology 2007, 25(6), 254). Наименее подробная из применяемых моделей имитационного моделирования представляет собой решеточную модель, каждый остаток представлен в виде шара, который занимает одиночный участок в трехмерной решетке. Более подробные последующие модели, такие как модель промежуточного разрешения, страдали от такой же неспособности точно представить вторичную и третичную структуру белка.

В отличие от более простых моделей атомистические модели включают все атомистические подробности, такие как образование водородной связи и, таким образом, являются более точными, чем решетчатая модель или модель с промежуточным разрешением. Такие атомистические модели использовались или с явно заданным растворителем или с неявно заданным растворителем, где растворитель рассматривается как сплошная среда. Явная модель является более точной, но также требует больше компьютерных вычислений. Позднее был разработан протокол молекулярно-динамического моделирования для получения структурной информации об упорядоченной β-агрегации амилоидогенных полипептидов (Cecchini et al., J Mol Biol. 2006, 357, 1306-1321). Однако так как такая процедура очень требует компьютерных вычислений, особенно для больших белков, таких как антитела, по-видимому, не существует известного в литературе полного атомистического моделирования. Тем не менее, существуют атомистические модели небольших частей антитела, по большей части Fab-фрагмента (Noon et al., PNAS. 2002, 99, 6466; Sinha and Smith-Gill, Cell Biochemistry and Biophysics. 2005, 43, 253).

Во множестве существующих подходов для предотвращения агрегации иммуноглобулинов прибегают к применению добавок в белковых составах. Такой подход отличается от описанного в данном документе прямого подхода, в котором иммуноглобулин сам по себе изменяют в склонных к агрегации областях, предсказанных с помощью молекулярного моделирования. Добавки, обычно используемые для стабилизации антител, являются солями азотсодержащих оснований, таких как аргинин, гуанидин или имидазол (ЕР0025275). Другими подходящими добавками для стабилизации являются полиэфиры (ЕР А 0018609), глицерин, альбумин и декстрансульфат (патент США №4808705), детергенты и ПАВ, такие как ПАВ на основе полисорбата (публикация DE 2652636 и публикация GB 2175906 (заявка на патент Великобритании № GB8514349)), шапероны, такие как GroEL (Mendoza. Biotechnol. Tech. 1991, (10) 535-540), цитратный буфер (WO 9322335) или хелатирующие агенты (WO 9115509). Хотя эти добавки позволяют в некоторой степени стабилизировать белки в растворе, они страдают от определенных недостатков, таких как необходимость дополнительных стадий обработки для удаления добавок. Таким образом, требуются новые способы для понимания механизмов, вовлеченных в агрегации белков, и для идентификации областей белков, которые опосредуют это явление. Такие способы были бы применимы в разнообразных диагностических и терапевтических областях, и позволили бы непосредственно без использования добавок стабилизировать композиции белков, таких как терапевтические антитела.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает способы и вычислительные средства, основанные, по меньшей мере, частично на компьютерных симуляциях, которые идентифицируют области белка, склонные к агрегации. В этих областях, склонных к агрегации, затем могут быть сделаны замены для создания белков с повышенной стабильностью и/или уменьшенной склонностью к агрегации.

Кроме того, в настоящем изобретении предлагаются способы и вычислительный аппарат на основе, по меньшей мере, частично, компьютерного моделирования, которые идентифицируют области белка, ответственные за связывание с макромолекулами. В этих областях, ответственных за связывание с макромолекулой, затем могут быть сделаны замены и делеции для создания белков с измененным сродством связывания с макромолекулой.

В одном аспекте изобретение обеспечивает способ вычисления пространственной склонности к агрегации (ПСА) для конкретного атома в белке, содержащий (а) идентификацию одного или более атомов в структурной модели, представляющей белок, где один или более атомов находятся внутри определенной области пространства с центром в конкретном атоме или около него; (b) расчет для одного или более атомов в определенной области пространства соотношения площади поверхности атомов, доступной растворителю (ПДР), к ПДР атомов в идентичном, полностью экспонированном, остатке; (с) умножение каждого соотношения на гидрофобность атома одного или более атомов; и (d) суммирование произведений стадии (с); в результате чего сумма представляет собой ПСА для конкретного атома.

В родственном воплощении способ расчета пространственной склонности к агрегации (ПСА) для конкретного атома в белке содержит (а) идентификацию одного или более аминокислотных остатков в структурной модели, представляющей белок, где один или более аминокислотных остатков содержат, по меньшей мере, один атом внутри определенной области пространства с центром в конкретном атоме или около него; (b) расчет для атомов в определенной области пространства отношения площади поверхности (ПДР) атомов, доступной растворителю, к ПДР атомов в идентичном, полностью экспонированном, остатке, (с) умножение каждого отношения на гидрофобность одного или более аминокислотных остатков, определенную по шкале гидрофобности аминокислот; и (d) суммирование произведений стадии (с); в результате чего сумма представляет собой ПСА для конкретного атома.

Понятно, что в конкретных воплощениях определенная область пространства представляет собой любой 3-мерный объем или область. В конкретных воплощениях определенную область пространства выбирают из группы, содержащей сферу, куб, цилиндр, пирамиду и эллиптический сфероид. В некоторых воплощениях определенная область пространства представляет собой область, имеющую объем, эквивалентный сфере радиусом между 1-30 Å или более. В некоторых воплощениях радиус может составлять 50 Å или более. В некоторых предпочтительных воплощениях радиус определенной области пространства составляет 5 Å или 10 Å.

В предпочтительном воплощении определенная область пространства представляет собой сферу, имеющую радиус в диапазоне 1-30 Å. В некоторых воплощениях центр сферы находится в конкретном атоме, тогда как в других воплощениях центр определенной области пространства или сферы находится на химической связи или в точке пространства около атома, для которого рассчитывается ПСА.

В некоторых воплощениях центр определенной области пространства находится в точке пространства на расстоянии 30 Å от конкретного атома, или в некоторых предпочтительных воплощениях центр определенной области пространства находится в точке пространства на расстоянии 20 Å, 10 Å, 5 Å, 2 Å, 1 Å от конкретного атома.

В некоторых воплощениях один или более атомов внутри определенной области пространства представляют собой атомы в боковой цепи одной или более аминокислот.

В дополнительных воплощениях один или более атомов внутри выбранного радиуса в структурной модели могут быть или требуется, чтобы они были, в боковой цепи одной или более аминокислот. В ином случае, один или более атомов внутри выбранного радиуса в структурной модели могут быть или требуется, чтобы они были, атомами основной цепи одной или более аминокислот.

Площадь поверхности, доступная растворителю (ПДР), которая является частью расчетов ПСА, может, в некоторых воплощениях рассчитываться только для атомов в боковых цепях аминокислот или, в некоторых воплощениях только для атомов основной цепи. Атомы основной цепи могут включать, а могут не включать присоединенные атомы водорода.

В некоторых особенно предпочтительных воплощениях структурная модель белка обрабатывается перед расчетом ПСА, например, путем осуществления молекулярно-динамического моделирования, которое необязательно включает растворитель. Растворитель может представлять собой воду, другой растворитель, известный в данной области, или же растворитель может отсутствовать. В некоторых особенно предпочтительных воплощениях структурная модель белка обрабатывается перед расчетом ПСА, например, путем осуществления моделирования Монте-Карло.

В другом аспекте расчет ПСА может содержать дополнительное осуществление молекулярно-динамических моделирований и вычисление среднего значений ПСА, рассчитанных в течение множества временных интервалов в молекулярно-динамическом моделировании. Например, ПСА для конкретного атома может рассчитываться путем проведения молекулярно-динамического моделирования перед стадией (а) выше и путем повторения стадий (a)-(d), каждый раз проводя дополнительное молекулярно-динамическое моделирование во множестве временных интервалов, получая таким образом кратные суммы, как в стадии (d), и рассчитывая среднее значение сумм; в результате чего рассчитанное среднее значение представляет собой ПСА для конкретного атома. В других примерах, моделирование Монте-Карло может использоваться вместо или в комбинации с молекулярно-динамическим моделированием.

В следующих воплощениях балльные оценки ПСА могут суммироваться для множества аминокислот, например, суммируя около 1-50 аминокислот в области, склонной к агрегации, или на участке поверхности в структурной модели белка. В особенно предпочтительном воплощении ПСА суммируется для 1-20 аминокислот, 1-15 аминокислот, 1-10 аминокислот, 1-5 аминокислот, 1-3 аминокислоты, или ПСА может суммироваться для 2 соседних аминокислот. В некоторых воплощениях сумма может подсчитываться для соседних аминокислот, которые располагаются в непосредственной близости друг от друга в последовательности белка или располагаются в непосредственной близости в пространственной структуре белка.

Там, где способы предусматривают молекулярно-динамическое моделирование, моделирование может проводиться с использованием пакета программ моделирования, выбранных из группы, содержащей или состоящей из ABINIT, AMBER, Ascalaph, CASTEP, CPMD, CHARMM, DL_POLY, FIREBALL, GROMACS, GROMOS, LAMMPS, MDynaMix, MOLDY, MOSCITO, NAMD, Newton-X, ProtoMol, PWscf, SIESTA, VASP, TINKER, YASARA, ORAC и XMD. В особенно предпочтительных воплощениях пакетом программ моделирования является CHARMM. В других предпочтительных воплощениях пакетом программ моделирования является NAMD.

Там, где способы предусматривают осуществление расчетов для одного или более атомов внутри боковой цепи, остатка или белка (например, расчет ПДР для одного или более атомов), специалисту в данной области будет понятно, что расчеты могут осуществляться для атомов, пар атомов, комбинаций или групп атомов, частей атомов или для каждого из или для всех атомов в области пространства, в боковой цепи, остатке, белке и т.д. При осуществлении расчетов, описанных в методиках по изобретению, специалисту в данной области будет также понятно, что расчеты (например, расчеты ПДР) также могут быть произведены для аминокислотных остатков, боковых цепей и так далее, содержащих атомы, группы атомов и т.д.

В дополнительных предпочтительных воплощениях структурная модель представляет собой модель рентгеновской кристаллической структуры белка или его части; или структурная модель может представлять собой теоретическую модель структуры белка или его части. В связанных воплощениях теоретическая структурная модель является гомологичной моделью белка или его части. В других воплощениях теоретическая структурная модель представляет собой ab initio модель структуры белка или его части. В другом аспекте в настоящем изобретении предлагаются способы идентификации областей белка, склонных к агрегации. В одном воплощении способ идентификации области на белке, склонной к агрегации, содержит (а) картирование на структурной модели белка ПСА, рассчитанного согласно любому способу, описанному в настоящем документе для атомов в белке; и (b) идентификацию внутри белка участка, содержащего множество атомов, имеющих ПСА>0; где область, склонная к агрегации содержит аминокислоты, содержащие указанное множество атомов. В некоторых воплощениях способ может содержать идентификацию одной или более аминокислот, содержащих один или более атомов, имеющих ПСА более чем выбранное пороговое значение; где ПСА рассчитывают согласно любому способу, описанному в настоящем документе, и где область, склонная к агрегации, содержит идентифицированные аминокислоты. В другом воплощении способ идентификации на белке области, склонной к агрегации, содержит создание графика из значений ПСА, рассчитанных согласно любому способу, описанному в настоящем документе, с дополнительным расчетом для пиков графика площади под кривой (AUC) и идентификацией одного или более областей белка с положительным значением AUC, где область, склонная к агрегации, содержит идентифицированные участки белка.

В другом аспекте в изобретении предлагаются способы получения вариантов белка, которые проявляют уменьшенную склонность к агрегации. В одном предпочтительном воплощении способ получения варианта белка, который проявляет уменьшенную склонность к агрегации, содержит замену или делецию, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка в белке внутри области, склонной к агрегации, где область, склонная к агрегации, идентифицируют с использованием балльных оценок ПСА, рассчитанных согласно любому способу, описанному в настоящем документе; и где, в случае замены аминокислотного остатка, то его заменяют на аминокислотный остаток, который является более гидрофильным, так чтобы уменьшалась склонность к агрегации варианта белка. В некоторых конкретных воплощениях заменяют, по меньшей мере, один остаток и удаляют, по меньшей мере, один остаток.

В другом воплощении способ получения варианта белка, который проявляет уменьшенную склонность к агрегации, содержит (а) получение множества вариантов белка путем замены в каждом варианте, по меньшей мере, одного остатка внутри области, склонной к агрегации, где область, склонная к агрегации, идентифицируют с использованием балльных оценок ПСА, рассчитанных согласно любому способу, описанному в настоящем документе, где в каждом варианте заменяют один или более различных остатков или различных комбинаций остатков; где, по меньшей мере, один остаток заменяют на остаток, который является более гидрофильным; и (b) выбор варианта белка, полученного как описано в стадии (а), который проявляет уменьшенную склонность к агрегации.

В некоторых воплощениях аминокислота, которую выбирают для замены, является наиболее гидрофильной аминокислотой (как определено с помощью известной из уровня техники шкалы гидрофобности) в области, склонной к агрегации. В конкретных воплощениях аминокислота, выбранная для замены, представляет собой Phe, Leu, Ile, Tyr, Trp, Val, Met, Pro, Cys, Ala или Gly. В таких конкретных воплощениях более гидрофильная аминокислота, на которую заменяют аминокислоту в белке, может быть выбрана из группы, состоящей из Thr, Ser, Lys, Gln, Asn, His, Glu, Asp и Arg. Часто, предпочтительная шкала гидрофобности для определения тех остатков, которые более или менее гидрофильны или гидрофобны, чем другие, представляет собой шкалу гидрофобности Блэка и Моулд.

В некоторых воплощениях заменены, по меньшей мере, два аминокислотных остатка внутри области, склонной к агрегации. В связанных воплощениях заменены, по меньшей мере, три аминокислотных остатка внутри области, склонной к агрегации. Также в похожих воплощениях заменен, по меньшей мере, один остаток внутри более чем одной области, склонной к агрегации, внутри белка. В предпочтительных воплощениях способ, описанный в настоящем документе, применяется к белку, который выбирают из группы, состоящей из антитела, Fab-фрагмента, Fab'-фрагмента, Fd-фрагмента, Fv-фрагмента, F(ab')2-фрагмента и Fc-фрагмента.

В других предпочтительных воплощениях способы, описанные в настоящем документе, применяются к белку, который выбран из группы, состоящей из цитокина, хемокина, липокина, миокина, нейромедиатора, нейротрофина, интерлейкина или интерферон. В некоторых конкретных воплощениях белок может представлять собой гормон или фактор роста, рецептор или домен рецептора, нейромедиатор или нейротрофин. В некоторых воплощениях белок представляет собой пептидомиметик, белок, содержащий искусственные аминокислоты, или белок, содержащий особенные аминокислоты. В другом аспекте в изобретении также предлагаются способы расчета эффективной ПДР для аминокислотного остатка в белке. Предпочтительный способ расчета эффективной ПДР для аминокислотного остатка в белке содержит (а) расчет для аминокислоты отношения площади поверхности атомов в аминокислоте, доступной растворителю (ПДР), к ПДР атомов в идентичном остатке, который полностью экспонирован; (b) умножение отношения на гидрофобность аминокислоты, определенную по шкале гидрофобности аминокислот; в результате чего продукт представляет собой эффективную ПДР для аминокислоты. Кроме того, эффективная ПДР для аминокислотного остатка в белке может быть рассчитана с помощью способа, который дополнительно включает суммирование эффективной ПДР для 3 аминокислот или, в некоторых воплощениях для 2, 4, 5 или 6 аминокислот, которые являются соседними в последовательности белка.

В другом аспекте изобретение включает также способы идентификации в белке области связывания с макромолекулами, включающие (а) картирование на структурной модели белка ПСА, рассчитанной согласно любому из предыдущих аспектов для атомов в белке; и (b) идентификацию участка внутри белка, содержащего множество атомов, имеющих ПСА>0; где участок связывания макромолекул содержит аминокислоты, содержащие указанное множество атомов.

В другом аспекте изобретение включает способы идентификации на белке области связывания макромолекул, содержащие идентификацию одной или более аминокислот, содержащих один или более атомов, имеющих ПСА более чем выбранное пороговое значение; где ПСА рассчитывают согласно способу любого из предыдущих аспектов, и где участок связывания макромолекул содержит идентифицированные аминокислоты.

В другом аспекте изобретение включает способы идентификации на белке области связывания макромолекул, содержащие построение графика ПСА-величин, рассчитанных в любом из предыдущих аспектов, и вычисление для пиков на графике площади под кривой (AUC), и идентификацию одного или более участков с положительной AUC, где участок связывания макромолекул содержит идентифицированные участки белка.

В другом аспекте изобретение включает способы получения варианта белка, который проявляет уменьшенное сродство связывания с макромолекулой, содержащий замену или делецию, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка в белке внутри области связывания с макромолекулой, где область связывания с макромолекулой идентифицируют с использованием балльных оценок ПСА, рассчитанных согласно любому из предыдущих аспектов; и где если заменяют аминокислотный остаток, то его заменяют на аминокислотный остаток, который является более гидрофильным, так чтобы уменьшалось сродство связывания варианта белка с макромолекулой. В определенных воплощениях заменяют, по меньшей мере, один остаток и, по меньшей мере, один остаток удаляют. В другом аспекте изобретение также включает способы получения варианта белка, который проявляет уменьшенное сродство связывания с макромолекулой, причем способ включает (а) получение множества вариантов белка путем замены в каждом варианте, по меньшей мере, одного остатка внутри области связывания с макромолекулой, где область связывания с макромолекулой идентифицируют с использованием балльных оценок ПСА, рассчитанных согласно любому из предыдущих аспектов, где один или более различные остатки или различные комбинации остатков заменяют в каждом варианте; и (b) выбор варианта белка, полученного как в стадии (а), который проявляет измененное сродство связывания с макромолекулой. В определенных воплощениях, по меньшей мере, один аминокислотный остаток внутри области связывания с макромолекулой является наиболее гидрофобным остатком в области связывания с макромолекулой. В некоторых воплощениях, по меньшей мере, один аминокислотный остаток внутри области, склонной к агрегации, представляет собой Phe, Leu, Ile, Tyr, Trp, Val, Met, Pro, Cys, Ala или Gly. В некоторых воплощениях аминокислотный остаток, который является более гидрофильным, выбирают из группы, состоящей из Thr, Ser, Lys, Gln, Asn, His, Glu, Asp и Arg. В некоторых воплощениях аминокислотный остаток, который является более гидрофильным, представляет собой особенную, искусственную или модифицированную аминокислоту. В некоторых воплощениях аминокислотный остаток, который является более гидрофильным, определяют согласно шкале гидрофобности Блэка и Моулд. В некоторых воплощениях заменены, по меньшей мере, два аминокислотных остатка внутри области связывания с макромолекулой. В некоторых воплощениях заменены, по меньшей мере, три аминокислотных остатка внутри области связывания с макромолекулой. В некоторых воплощениях внутри белка заменен, по меньшей мере, один остаток внутри более чем одной области, склонной к агрегации. В некоторых воплощениях область, склонная к агрегации идентифицируют согласно способу любого из предыдущих аспектов для идентификации на белке области, склонной к агрегации. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, макромолекула представляет собой другой белок, полинуклеотид или полисахарид, В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, белок выбирают из группы, состоящей из антитела, Fab-фрагмента, Fab'-фрагмента, Fd-фрагмента, Fv-фрагмента, F(ab')2-фрагмента и Fc- фрагмента. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, белок представляет собой цитокин, хемокин, липокин, миокин, нейромедиатор, нейротрофин, интерлейкин или интерферон. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, белок представляет собой гормон или фактор роста. В некоторых воплощениях макромолекула представляет собой рецептор гормона или рецептор фактора роста. В некоторых воплощениях белок представляет собой рецептор или домен рецептора. В некоторых воплощениях макромолекула представляет собой рецепторный агонист или рецепторный антагонист рецептора или домена рецептора. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, белок представляет собой нейромедиатор или нейротрофин. В некоторых воплощениях макромолекула представляет собой рецептор нейромедиатора или рецептор нейротрофина.

В другом аспекте изобретение также включает способ получения фармацевтической композиции, содержащей вариант белка, который проявляет измененную склонность к взаимодействию с партнером по связыванию, причем способ содержит составление смеси, включающей вариант белка, полученный согласно способу по любому из предыдущих аспектов, вместе с фармацевтически приемлемым носителем, адъювантом и/или вспомогательным веществом.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение относится к неудовлетворенной потребности в глубоком понимании механизма агрегации белка и для идентификации областей белка, вовлеченных в агрегацию. В изобретении предлагается, по меньшей мере, частично, технология моделирования, которая может использоваться одновременно с экспериментальными способами, описанными в настоящем документе, для улучшения стабильности потенциально терапевтических белков на фоне агрегации. Эта технология демонстрирует огромный научный и коммерческий потенциал, с учетом того, что терапии на основе антител растут огромными темпами по сравнению со всеми другими классами терапевтических средств для человека. Агрегация является распространенной проблемой, встречающейся в большинстве стадий разработки лекарственного средства на основе антител, что препятствует быстрой коммерциализации потенциальных кандидатов лекарственных средств на основе антител. Таким образом, предотвращение агрегации с использованием способов, описанных в настоящем документе, может оказать значительный эффект на разработку белковых лекарственных средств.

Кроме того настоящее изобретение относится к неудовлетворенной потребности в точной идентификации областей белков, вовлеченных в связывание с другими молекулами, которое часто опосредовано, по меньшей мере, частично, посредством больших гидрофобных участков, которые могут быть легко идентифицированы с использованием способов, описанных в настоящем документе. В изобретении предлагается, по меньшей мере, частично, технология моделирования, которая может использоваться одновременно с экспериментальными способами, описанными в настоящем документе, для изменения сродства связывания потенциально всех белок-молекулярных взаимодействий, которые опосредованы, по меньшей мере, частично, посредством больших гидрофобных участков. Эта технология демонстрирует огромный научный и коммерческий потенциал, с учетом того, что терапии на основе антител растут огромными темпами по сравнению со всеми другими классами терапевтических средств для человека.

Способность изменять сродство связывания терапевтического белка с одной или более макромолекулами может использоваться для улучшения эффективности и уменьшения или исключения активностей, опосредованных через нежелательные вторичные участки связывания с макромолекулой.

В настоящем изобретении предлагаются среди прочего способы уменьшения или предотвращения агрегации белка или изменения сродства связывания с макромолекулой. В частности, предлагаются способы для идентификации гидрофобных участков на структуре белка, которые могут участвовать в белковых взаимодействиях, в белок-макромолекулярных взаимодействиях или в агрегации белка. Предлагаемые способы основаны на новом методе, раскрытом в настоящем документе, как «пространственная склонность к агрегации» или «ПСА». С помощью инструмента ПСА также точно идентифицируются области антитела, склонные к связыванию с другими белками. Кроме антитела, этот инструмент мог бы широко применяться ко всем белкам для идентификации областей, склонных к агрегации, или областей, которые связываются с другими белками или лигандами. Способы по настоящему изобретению могут применяться к любому белку, для которого доступна трехмерная структура, или для которого может быть создана трехмерная структура с использованием гомологичного моделирования, молекулярного моделирования или ab initio определения струк