Варианты натрийуретического пептида с-типа

Варианты натрийуретического пептида с-типа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка заявляет приоритет на основании предварительной заявки на выдачу патента США № 61/254563, поданной 23 октября 2009 г., и предварительной заявки на выдачу патента США № 61/180112, поданной 20 мая 2009 г., содержание каждой предварительной заявки включено в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.

Область техники, к которой относится изобретение

Область изобретения, в общем, относится к вариантам натрийуретического пептида C-типа (CNP), композициям, содержащим варианты CNP, способам получения вариантов CNP и способам применения вариантов CNP для лечения расстройств, отвечающих на CNP, включая без ограничения связанные с костями расстройства, такие как скелетные дисплазии (например, ахондроплазия), и расстройства гладкой мускулатуры сосудов.

Уровень техники

Семейство натрийуретических пептидов состоит из трех структурно родственных пептидов: атриального натрийуретического пептида (ANP) (Genbank, номер доступа NP_006163 для белка-предшественника ANP, NPPA), мозгового натрийуретического пептида (BNP) (GenBank, номер доступа NP_002512 для белка-предшественника BNP, NPPB) и натрийуретического пептида C-типа (CNP) (Biochem. Biophys. Res. Commun., 168: 863-870 (1990) (GenBank, номер доступа NP_077720 для белка-предшественника CNP, NPPC) (J. Hypertens., 10: 907-912 (1992)). Такие небольшие одноцепочечные пептиды (ANP, BNP, CNP) имеют структуру петли из 17 аминокислот (Levin et al., N. Engl. J. Med., 339: 863-870 (1998)) и играют важные роли во многих биологических процессах. ANP и BNP связываются и активируют рецептор A натрийуретического пептида (NPR-A), также называемый гуанилилциклазой A (GC-A), приводя к более высоким уровням внутриклеточного циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ). Подобным образом, CNP взаимодействует с NPR-B (GC-B), стимулируя образование цГМФ (J. Hypertens., 10: 1111-1114 (1992)). Третий тип рецептора, NPR-C, связывает каждый из натрийуретических пептидов с высокой аффинностью и функционирует, главным образом, улавливая пептиды из внеклеточного компартмента и откладывая пептиды в лизосомах, где они разрушаются (Science, 238: 675-678 (1987)). ANP и BNP, в основном, продуцируются в мышечных клетках сердца и, как полагают, играют важные роли в гомеостазе сердца и сосудов (Science, 252: 120-123 (1991)). CNP экспрессируется более широко, включая экспрессию в центральной нервной системе, половых путях, костях и эндотелии кровеносных сосудов (Hypertension, 49: 419-426 (2007)).

У человека CNP вначале продуцируется геном предшественника натрийуретического пептида C (NPPC) в виде одноцепочечного, состоящего из 126 аминокислот препрополипептида (Biochem. Biophys. Res. Commun., 168: 863-870 (1990)). Удаление сигнального пептида дает про-CNP, и затем расщепление эндопротеазой фурином приводит к образованию активного 53-аминокислотного пептида (CNP-53), который секретируется и снова расщепляется неизвестным ферментом с образованием зрелого 22-аминокислотного пептида (CNP-22) (Wu, J. Biol. Chem. 278: 25847-852 (2003)). CNP-53 и CNP-22 отличаются по своему распределению, при этом CNP-53 преобладает в тканях, тогда как CNP-22, главным образом, встречается в плазме и спинномозговой жидкости (J. Alfonzo, Recept. Signal. Transduct. Res., 26: 269-297 (2006)). Преобладающая форма CNP в хряще неизвестна. Оба пептида CNP-53 и CNP-22 сходным образом связываются с NPR-B. Кроме того, они оба индуцируют продуцирование цГМФ зависимым от дозы и сходным образом (VT Yeung, Peptides, 17: 101-106 (1996)).

Природный ген и полипептид CNP были описаны ранее. В патенте США № 5352770 описан выделенный и очищенный CNP-22 из головного мозга свиньи, идентичный по последовательности CNP человека, и его применение для лечения сердечно-сосудистых расстройств. В патенте США № 6034231 описан ген и полипептид про-CNP человека (126 аминокислот) и ген и полипептид CNP-53 человека.

Клиренс CNP из внеклеточного пространства происходит благодаря действию связанной с мембраной нейтральной эндопептидазы (NEP), которая быстро разрушает CNP (Biochem. J., 291 (Pt 1): 83-88 (1993)), и благодаря NPR-C, который связывается с CNP и способствует его отложению в лизосомах, где CNP разрушается. Показано, что CNP у здорового человека имеет время полужизни in vivo 2,6 минуты (J. Clin. Endocrinol. Metab., 78: 1428-35 (1994)). Низкая концентрация CNP в плазме (J. Bone Moner. Res., 19 (Suppl.1)S20 (2004)) и его коэкспрессия с NPR-B в ряде тканей свидетельствуют, что CNP, главным образом, функционирует посредством аутокринного/паракринного механизма.

Как указано выше, CNP связывается и активирует рецептор натрийуретического пептида B (NPR-B), также называемый гуанилилциклазой B (GC-B), приводя к более высоким внутриклеточным уровням циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ). Осуществляемая ниже передача сигналов, опосредованная образованием цГМФ, влияет на множество разнообразных биологических процессов, которые включают эндохондральное окостенение. Соответственно, повышенные или пониженные уровни любого из компонентов такого пути могут приводить к аномальному росту костей. Например, результатом нокаута либо CNP, либо NPR-B в мышиных моделях является появление у животных карликового фенотипа с более короткими костями и позвонками. Идентифицированы мутации в NPR-B человека, которые блокируют правильную передачу сигнала CNP и приводят к карликовости (Olney, et al, J. Clin. Endocrinol. Metab. 91(4): 1229-1232 (2006); Bartels, et al., Am. J. Hum. Genet. 75: 27-34 (2004)). Напротив, у мышей, сконструированных так, чтобы они продуцировали повышенные уровни CNP, обнаружены удлиненные кости и позвонки.

Ахондроплазия является результатом аутосомно-доминантной мутации в гене рецептора фактора роста фибробластов 3 (FGFR-3), которая вызывает аномалии образования хряща. FGFR-3 в норме оказывает негативное регуляторное влияние на рост хондроцитов и, следовательно, рост костей. При ахондроплазии мутантная форма FGFR-3 является конститутивно активной, что приводит к сильно укороченным костям. И пролиферация, и дифференцировка хондроцитов, по-видимому, нарушаются, что приводит к заметно к укороченному хрящу ростовой пластинки (P. Krejci et al., J. Cell Sci. 118: 5089-5100 (2005)). Эндохондральное окостенение представляет собой процесс, который управляет продольным ростом длинных костей. Существует четыре зоны ростовой пластинки - резервная зона, зона пролиферации, зона гипертрофии и зона кальцификации. В ростовой пластинке NPR-B экспрессируется пролиферативными клетками, тогда как NPR-C экспрессируется гипертрофическими клетками (Yamashite et al., J. Biochem. 127: 177-179 (2000)). При нормальном росте эндохондральной кости хондроциты организуются в колонки и пролиферируют в зоне пролиферации ростовой пластинки. Такие колонки у пациентов с ахондроплазией дезорганизованы. Кроме того, зоной гипертрофии является зона, в которой клетки становятся крупными и в конечном итоге подвергаются апоптозу (лизируются), приводя к инвазии остеоцитов и минерализации. Гипертрофические хондроциты и общий размер зоны у пациентов с ахондроплазией намного меньше, чем у здоровых людей. CNP является агонистом NPR-B, позитивного регулятора хондроцитов и роста костей. Происходящая ниже передача сигналов CNP/NPR-B ингибирует путь FGFR-3 на уровне активируемой митогенами протеинкиназы (MAP K). Ингибирование на уровне MAP K стимулирует пролиферацию и дифференцировку хондроцитов в зонах пролиферации и гипертрофии ростовой пластинки, приводя к росту костей.

У человека активирующие мутации FGFR-3 являются основной причиной наследственной карликовости. Мыши, имеющие активированный FGFR-3, служат в качестве модели ахондроплазии, наиболее распространенной формой скелетных дисплазий, и сверхэкспрессия CNP спасает таких животных от карликовости. Соответственно, CNP и функциональные варианты CNP являются потенциальными терапевтическими средствами для лечения различных скелетных дисплазий.

Терапевтическое применение CNP в настоящее время ограничено его коротким временем полужизни в плазме, которое, как было показано, составляет 2,6 минуты in vivo у человека (J Clin. Endocrinol. Metab., 78: 1428-35 (1994)). Для того чтобы увеличить концентрацию CNP до уровней выше естественных (примерно 5 пМ), обычно встречающихся в плазме человека, во всех исследованиях на человеке и животных была необходима непрерывная инфузия с использованием системно вводимого CNP. Вариант CNP, имеющий более длительное время полужизни в сыворотке in vivo и проявляющий сходную или повышенную активность по сравнению с CNP дикого типа, важен для разработки методики долговременной терапии. Два механизма, благодаря которым время полужизни CNP снижается в плазме человека, обусловлены разрушением нейтральной эндопептидазой (NEP) и клиренсом за счет рецептора натрийуретического пептида C (NPR-C) (Growth Horm. and IGF Res., 16: S6-S14 (2006)). По имеющимся сведениям модификации пептидов могут повышать резистентность к расщеплению эндопептидазами и экзопептидазами (Amino Acids, 30: 351-367 (2006); Curr. Opin. Biotech., 17: 638-642 (2006)).

Была проведена оценка биологических активностей различных аналогов и производных CNP. Сообщается, что благодаря использованию замены остатком S-метил-Cys остатков Cys₆ и Cys₂₂ показано, что циклизация пептида посредством дисульфидной связи Cys6-Cys22 является важной для активности CNP в стимуляции образования цГМФ (Biochem. Biophys. Res. Comm., 183: 964-969 (1992), также благодаря использованию сканирования аланином идентифицированы аминокислоты, важные для функциональности CNP). Значимое дополнительное усиление активности, как сообщается, достигают в результате совместного присутствия аминокислот Leu₉, Lys₁₀ и Leu₁₁. В патенте США № 5434133 описаны аналоги CNP, включая CNP-22 с заменами в положениях аминокислот 6, 7, 9, 11 или 22, при этом аминокислота выбрана из Cys или Pmp (пентацикломеркаптопропионовой кислоты) в положении 6, Phe, 4-хлор-Phe, 4-фтор-Phe, 4-нитро-Phe или Cha (3-циклогексил-Ala) в положении 7, Gly, Val, Aib или tLeu в положении 9, Leu или Ile в положении 11, и Cys или Pmp в положении 22.

В публикации патента США № 2004/0138134 (в настоящее время патент США 7276481) описаны варианты CNP, содержащие аминокислоты Cys₆-Cys₂₂ CNP-22 («CNP-17»), которые включают по меньшей мере одну замену другой природной аминокислоты в положении 9, 10, 11, 16, 17, 19 или 20, варианты CNP с инсерциями и делециями, такими как добавление остатка His в описанный основной сайт расщепления NEP, между Cys₆ и Phe₇, и способы применения таких вариантов для увеличения размера ростовой пластинки кости в аномальной кости и элонгации аномальной кости. Однако в случае таких варрантов не было получено значимого увеличения активности, которую измеряли по продукции цГМФ, и активность была снижена почти у всех вариантов при исследовании основанным на клетках способом in vitro (пример 7). Кроме того, не было представлено вспомогательных данных, таких как, например, данные о стабильности in vitro или определении in vivo улучшенных фармакокинетических (ФК) свойств, подтверждающих заявленную резистентность к NEP и резистентность к NPR-C аналогов CNP. В патенте США № 6743425 описаны вещества для лечения ахондроплазии, которые активируют NPR-B/GC-B и представляют собой пептиды или низкомолекулярные соединения, включая натрийуретические пептиды C-типа CNP-22 и CNP-53. В публикации PCT № WO 94/20534 описана химера CNP-22 и состоящего из 5 аминокислот C-конца ANP, называемого пептидом васонатрином (VNP), небольшое количество аминокислотных замен и циклические химерные пептиды, которые являются результатом образования дисульфидной или двойной связи.

Способы увеличения времени полужизни других представителей семейства натрийуретических пептидов включают уменьшение аффинности ANP по отношению к NPR-C (патент США № 5846932), использование пентапептидных антагонистов NPR-C (WO 00/61631) и совместное введение ингибиторов NEP, таких как тиорфан и кандоксатрил (Clin. Exp. Pharma. Physiol., 25: 986-991 (1997), Hyperten., 30: 184-190 (1997)). В WO 2004/047871 описаны конъюгаты BNP и вариантов BNP с остатками полиалкиленгликоля, остатками сахаров, остатками полисорбатов, поликатионными остатками и другими гидрофильными полимерными остатками, которые, как сообщается, имеют повышенное время полужизни в кровообращении и применимы для лечения острой застойной сердечной недостаточности.

Однако нет опубликованных сообщений об успешной методике, делающей CNP резистентным к NEP при сохранении его функциональности.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к вариантам натрийуретического пептида C-типа (CNP), которые применимы для лечения связанных с костями расстройств (например, ахондроплазии) и расстройств гладкой мускулатуры сосудов. Изобретение охватывает варианты CNP, имеющие увеличенное время полужизни в сыворотке, например, в результате пониженной способности связываться с нейтральной эндопептидазой (NEP), более высокой резистентности к протеолизу ферментом NEP и/или пониженной аффинности к рецептору натрийуретического пептида C (NPR-C), способствующего клиренсу, при сохранении функциональности CNP.

Последовательность CNP-22 дикого типа человека (называемого в настоящем описании «hCNP22», «wtCNP22» или «CNP22») указана ниже:

(N-конец) Gly₁-Leu₂-Ser₃-Lys₄-Gly₅-Cys₆-Phe₇-Gly₈-Leu₉-Lys₁₀-Leu₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-Ile₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-Met₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-Leu₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂ (SEQ ID NO: 1).

Положения 6-22 CNP22 образуют циклический домен посредством дисульфидной связи между Cys6 и Cys22. Показано, что 17-аминокислотная циклическая структура важна для связывания CNP с NPR-B (Schiller, Biochem. Biophys. Res. Commun., 138: 880-886 (1986)). Аминокислотную последовательность положений 6-22 CNP22 в настоящем описании называют «CNP17» (SEQ ID NO: 2).

CNP чувствителен к расщеплению NEP в нескольких участках: Cys6-Phe7, Gly8-Leu9, Lys10-Leu11, Arg13-Ile14, Ser16-Met17 и Gly19-Leu20. В одном варианте изобретение охватывает вариант CNP, который (1) модифицирован для увеличения его общего размера или молекулярной массы, например, до диапазона примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 4 кДа, 4,2 кДа, 4,4 кДа, 4,6 кДа, 4,8 кДа, 5 кДа, 5,2 кДа, 5,4 кДа, 5,6 кДа, 5,8 кДа, 6 кДа, 6,2 кДа, 6,4 кДа или до примерно 7 кДа, 7,2 кДа или примерно 8,2 кДа, и/или (2) модифицирован в некоторых положениях аминокислот, чтобы уменьшить его чувствительность к расщеплению NEP в 1, 2, 3, 4, 5 или всех 6 участках, перечисленных выше. Размер или молекулярная масса варианта CNP могут быть увеличены разными способами, например, посредством конъюгации дополнительных аминокислот и/или других видов химических (например, природных или синтетических полимерных) групп с пептидной последовательностью, например, на N-конце, C-конце и/или боковой цепи (цепях), и/или с использованием природных аминокислот, неприродных аминокислот и/или пептидомиметиков с более объемными боковыми цепями. Вариант CNP необязательно дополнительно конъюгирован с другими функциональными или структурными компонентами. Необязательно в сочетании с любым из описанных в настоящей публикации вариантов может быть введена мутация (мутации) (например, замена(ны), добавление(ия) и/или делеция(ии)) в определенном положении (положениях) CNP22, чтобы уменьшить аффинность вариантов CNP к NPR-C. Могут быть осуществлены дополнительные модификации, не влияющие на резистентность к NEP или активность CNP, например, консервативные замены или другие модификации, известные в данной области.

В одном варианте осуществления изобретения вариант CNP представлен общей формулой: (X)-Gly₁-Leu₂-Ser₃-Lys₄-Gly₅-Cys₆-Phe₇-Gly₈-Leu₉-Lys₁₀-Leu₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-Ile₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-Met₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-Leu₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(Z) (SEQ ID NO: 5), при этом:

вариант CNP содержит одну или несколько модифицированных аминокислот, что может приводить к модифицированным пептидным связям (например, посредством использования изостер пептидной связи) в положении, соответствующем одному или нескольким из следующих остатков CNP: Gly1, Lys4, Gly5, Cys6, Phe7, Gly8, Leu9, Lys10, Leu11, Ile14, Gly15, Ser16, Met17, Gly19, Leu20 и Gly21; и

(x) и (z) независимо могут отсутствовать или могут представлять собой аминокислотную последовательность, полученную из натрийуретического полипептида (например, NPPC, ANP, BNP) или ненатрийуретического полипептида (например, сывороточного альбумина человека (HSA), IgG, и т.д.).

В одном варианте осуществления изобретения вариант CNP содержит: (1) модификацию в положении аминокислоты, соответствующем одному из положений 6, 7 или 8 (Cys6, Phe7 или Gly8) CNP22, (2) необязательно делецию, добавление и/или замену любой или всех аминокислот в положениях 1-5 (Gly1, Leu2, Ser3, Lys4 и Gly5) и (3) необязательно до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных модификаций (делеций, добавлений и/или замен) в положениях, соответствующих положениям 6-22, из которых 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 могут быть консервативными заменами или другими заменами, описанными в настоящей публикации, или известные в данной области.

Понятно, что указание конкретного положения аминокислоты номером (например, положение 7 CNP22) относится к соответствующему положению аминокислоты в любом варианте CNP, даже если номер положения в данном варианте CNP был изменен вследствие предшествующих инсерций или делеций. Например, указание «положение 7» или «Phe7» может означать соответствующее положение 2 для варианта CNP, в котором первые пять аминокислот были делетированы. Подобным образом указание «положение 7» может означать соответствующее положение 8 для варианта CNP, в котором одна аминокислота была добавлена к N-концу.

В любом из вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящей публикации, вариант CNP может быть циклизован посредством ковалентной связи между положениями, соответствующими положениям 6 и 22 CNP22. Предполагается, что ковалентная связь образована с использованием любых способов, известных в данной области. В другом варианте осуществления изобретения вариант CNP может быть циклизован посредством ковалентной связи, образованной между аминокислотой на N-конце или около N-конца и аминокислотой на C-конце или около C-конца (называемых для такой цели «концевыми» аминокислотами) пептида. В одном варианте ковалентная связь образована между боковыми цепями двух концевых аминокислот или аминокислот в положениях, соответствующих положениям 6 и 22 в CNP22. В другом варианте ковалентная связь образована между боковой цепью одной концевой аминокислоты и концевой группой другой концевой аминокислоты, или между концевыми группами каждой из концевых аминокислот. Например, возможны связи голова-хвост, боковая цепь-боковая цепь, боковая цепь-голова или боковая цепь-хвост в случае ковалентной связи, образованной между концевыми аминокислотами или между аминокислотами в положениях, соответствующих положениям 6 и 22 в CNP22.

В одном варианте осуществления изобретения предлагается вариант CNP, обладающий пониженной аффинностью к NEP и/или более высокой резистентностью к расщеплению под действием NEP и/или увеличенным временем полужизни в сыворотке in vivo, с сохранением при этом функциональности CNP (например, стимуляции продукции цГМФ). NEP предпочтительно узнает субстраты с молекулярной массой меньше чем примерно 3 кДа вследствие ограниченного размера полости ее активного центра (Oefner, J. Mol. Biol., 296: 341-349 (2000)). В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP модифицируют, чтобы увеличить их общую молекулярную массу до диапазона примерно от 2,6 или 2,8 кДа до примерно 4, 4,6, 5, 5,2, 5,8, 6, 6,4 или 7 кДа, например, добавлением примерно от 0,6 до примерно 5 кДа аминокислот, гидрофильных или водорастворимых полимеров, гидрофобных кислот (включая жирные кислоты) и/или углеводов. В конкретных иллюстративных вариантах осуществления изобретения варианты CNP имеют молекулярную массу примерно от 2,6 кДа до примерно 7 кДа, или примерно от 2,8 кДа до 6 кДа, или примерно от 2,8 кДа до примерно 5,8 кДа. В некоторых вариантах добавляют по меньшей мере примерно 0,6, 0,8, 1, 1,2, 1,4, 1,6 или 1,8 кДа, или вплоть до 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8 или 5 кДа, чтобы увеличить общую молекулярную массу варианта CNP, например, до диапазона примерно от 2,6 или 2,8 кДа до примерно 4 кДа, 4,2 кДа, 4,4 кДа, 4,6 кДа, 4,8 кДа, 5 кДа, 5,2 кДа, 5,4 кДа, 5,6 кДа, 5,8 кДа, 6 кДа, 6,2 кДа, 7,2 кДа, 8,2 кДа или выше. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие варианты CNP содержат аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичную или гомологичную аминокислотам 6-22 CNP22. В других вариантах осуществления изобретения такие варианты CNP содержат замену, инсерцию или делецию 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислот с использованием другой природной или неприродной аминокислоты или пептидомиметика. Хотя предполагаются и консервативные, и неконсервативные замены или инсерции в любом положении, введение модификаций может начинаться, например, консервативными заменами в областях, которые, как было выявлено в известном уровне техники, вовлечены в активность CNP или связывание NPR-B, хотя могут быть осуществлены неконсервативные замены в таких областях, в которых, как было показано ранее, допускается модификация.

В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP включают CNP, имеющий интактную циклизованную часть между Cys6 и Cys22, и N-концевые и/или C-концевые хвосты, которые содержат примерно 1-40, 1-20, 5-40, 5-35, 10-35, 15-35, 5-31, 10-31 или 15-31 аминокислоту и являются фрагментами, полученными из CNP-полипептида и/или другого полипептида, отличного от CNP. В одном варианте осуществления изобретения такие варианты CNP имеют молекулярную массу в диапазоне примерно от 2,8 кДа до примерно 4, 4,6, 5, 5,2, 5,8, 6, 6,4 или 7 кДа. Неограничивающими примерами таких вариантов CNP являются CNP22 дикого типа или CNP22 с одной или несколькими аминокислотными заменами (например, заменой K4R), имеющий N-концевое и/или C-концевое удлинение, полученное из последовательностей предшественника натрийуретического пептида (например, ANP, BNP или CNP) человека или другого вида, вариант предшественника натрийуретического пептида C (NPPC) с аминокислотными заменами, добавлениями и/или делециями (например, варианты CNP могут представлять собой укорочения CNP-53, которые приводят к получению пептидов с молекулярной массой примерно от 2,8 кДа до 5,8 кДа), или другие полипептиды, отличные от CNP, такие как, например, сывороточный альбумин или белок IgG (например, варианты CNP могут представлять собой химеры CNP, содержащие фрагменты сывороточного альбумина или IgG человека или другого вида).

В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP, имеющие общую массу, характеризуемую диапазонами, в общем описанными в настоящей публикации, например, примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа, предназначенные для повышения резистентности к разрушению под действием NEP, представлены общей формулой:

(x)-Gly₁-Leu₂-Ser₃-(b)₄-Gly₅-Cys₆-Phe₇-Gly₈-Leu₉-(h)₁₀-Leu₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-Ile₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-Met₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-Leu₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z) (SEQ ID NO: 6), где:

(x) означает синтетическую или природную полимерную группу или их сочетание, при этом неограничивающим примером синтетической полимерной группы является полиэтиленгликоль (ПЭГ, также называемый полиэтиленоксидом (ПЭО)), и неограничивающим примером природной полимерной группы является аминокислотная последовательность, содержащая от 1 до 35 аминокислот и полученная из NPPC или его вариантов с заменами и/или делециями, ANP, BNP или других отличных от CNP (поли)пептидов, таких как, например, сывороточный альбумин, IgG, богатые гистидином гликопротеиды, фибронектин, фибриноген, полипептиды, содержащие цинковые пальцы, остеокрин или фактор роста фибробластов 2 (FGF2);

(z) может отсутствовать или может представлять собой синтетическую или природную полимерную группу или их сочетание, при этом неограничивающим примером синтетической полимерной группы является ПЭГ, и неограничивающим примером природной полимерной группы является аминокислотная последовательность, полученная из натрийуретического полипептида (например, NPPC, CNP, ANP или BNP) или другого, отличного от натрийуретического полипептида (например, сывороточного альбумина или IgG); и

(b) и (h), каждый независимо, может означать Lys дикого типа в данном положении или может быть заменен с использованием консервативной аминокислотной замены или любой природной или неприродной аминокислотой или пептидомиметиком, которые не имеют реакционно-способного первичного амина в боковой цепи, включая без ограничения Arg, Gly, 6-гидроксинорлейцин, цитруллин (Cit), Gln, Glu или Ser. В одном варианте (b) означает Arg. В другом варианте для повышенной резистентности к NEP (b) не является Gly. В еще одном варианте (h) не является Arg.

Неограничивающие примеры аминокислотных последовательностей, полученных из NPPC или его вариантов включают:

Arg,

Glu-Arg,

Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 7),

Gly-Ala-Asn-Arg-Arg (SEQ ID NO: 8),

Gly-Ala-Asn-Pro-Arg (SEQ ID NO: 9),

Gly-Ala-Asn-Gln-Gln (SEQ ID NO: 10),

Gly-Ala-Asn-Ser-Ser (SEQ ID NO: 11),

Gly-Ala-Asn-Arg-Gln (SEQ ID NO: 12),

Gly-Ala-Asn-Arg-Met (SEQ ID NO: 13),

Gly-Ala-Asn-Arg-Thr (SEQ ID NO: 14),

Gly-Ala-Asn-Arg-Ser (SEQ ID NO: 15),

Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala (SEQ ID NO: 16),

Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg (SEQ ID NO: 17),

Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg (SEQ ID NO: 18),

Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 19),

Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg (SEQ ID NO: 20)

Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 21) и

Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg (SEQ ID NO: 22).

Неограничивающие примеры аминокислотных последовательностей, полученных из других полипептидов, отличных от CNP, таких как, например, ANP, BNP, сывороточный альбумин и IgG, включают:

Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser (SEQ ID NO: 23);

Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 24);

Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 25);

Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 26);

Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 27);

Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His (SEQ ID NO: 28);

Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg (SEQ ID NO: 29);

Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr (SEQ ID NO: 30);

Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln (SEQ ID NO: 31) и

Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 32).

В одном варианте N-конец и/или C-конец CNP22 или его варианта независимо могут быть конъюгированы с аминокислотным удлинением, содержащим 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 аминокислот. В одном варианте аминокислотное удлинение получено из NPPC, CNP53, ANP или BNP. В конкретном варианте аминокислотное удлинение представляет собой Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 33). В родственном варианте такое 15-аминокислотное удлинение добавлено к N-концу с получением варианта CNP формулы Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys-Gly₁-Leu₂-Ser₃-(b)₄-Gly₅-Cys₆-Phe₇-Gly₈-Leu₉-(h)₁₀-Leu₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-Ile₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-Met₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-Leu₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z) (SEQ ID NO: 34).

В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP включают wtCNP22 или его вариант (например, вариант, имеющий добавление(ия), делецию(ии) и/или замену(ны), такую как, например, замену K4R) (SEQ ID NO: 35), конъюгированный на N-конце и/или C-конце с гидрофильным полимером (например, ПЭГ), чтобы увеличить общий молекулярный размер до диапазона примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 4, 5, 6 или 7 кДа. Такие варианты CNP необязательно дополнительно конъюгированы на N-конце и/или C-конце с полимерной группой, содержащей, например, аминокислоты, углеводы, гидрофобные кислоты и/или фосфолипиды, неограничивающим примером которых является N-концевое аминокислотной удлинение, содержащее от 1 до 35 или от 5 до 31 аминокислоты. В одном варианте гидрофильный полимерный (например, ПЭГ) остаток размером по меньшей мере примерно 0,4, 0,6, 0,8, 1, 1,2, 1,4, 1,6 или 1,8 кДа, или вплоть до 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8 или 5 кДа добавляют к N-концу и/или C-концу wtCNP22 или его варианта.

Как показано в настоящем описании, конъюгирование гидрофильного или водорастворимого полимера ПЭГ (или ПЭО) с молекулярной массой примерно 0,6 кДа или больше с CNP22 или его вариантами, как правило, заметно повышает резистентность к расщеплению NEP. Однако добавление ПЭГ, даже с такой небольшой молекулярной массой как 0,6 кДа, к wtCNP22 может уменьшать функциональность CNP (например, стимуляцию передачи сигнала цГМФ), а добавление ПЭГ с молекулярной массой больше чем примерно 2 или 3 кДа к CNP22 или его вариантам может уменьшать функциональную активность CNP зависимым от размера образом. Но функциональность CNP (по меньшей мере, сравнимая с функциональностью wtCNP22) сохраняется, когда полимер ПЭГ (или ПЭО) с молекулярной массой примерно от 0,6 кДа до примерно 1,2 кДа, или потенциально примерно до 2 кДа конъюгируют с вариантом CNP, имеющим N-концевое аминокислотное удлинение, в котором по меньшей мере одна относительно крупная аминокислота, которая потенциально может быть положительно заряженной в физиологических условиях (например, аргинин) непосредственно предшествует положению, соответствующему Gly1 в CNP22, например, GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 37), ER-CNP22 (SEQ ID NO: 38), ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 39), R-CNP22 (SEQ ID NO: 40) и R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 41).

Соответственно, в одном варианте осуществления изобретения пегилированные варианты CNP содержат на N-конце CNP22 или его варианта (например, варианта, имеющего замену K4R) аминокислотное удлинение, содержащее по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, при этом полимер ПЭГ конъюгирован с N-концом удлиненного аминокислотами варианта CNP с получением общей массы, в диапазонах, в общем, описанных в настоящей публикации, например, примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа, для повышенной резистентности к расщеплению NEP. В одном варианте для получения повышенной функциональности CNP такие пегилированные, содержащие аминокислотное удлинение варианты CNP содержат по меньшей мере одну относительно крупную природную или неприродную аминокислоту, которая потенциально может быть положительно заряженной в физиологических условиях, непосредственно предшествующую положению, соответствующему Gly1 в CNP22. В конкретном варианте пегилированные, содержащие аминокислотные удлинения варианты CNP содержат по меньшей мере один остаток аргинина, который непосредственно предшествует положению, соответствующему Gly1 в CNP22.

В дополнение к вариантам CNP, конъюгированным на N-конце и/или C-конце с гидрофильным или водорастворимым полимером, таким как, например, ПЭГ (или ПЭО), изобретение охватывает варианты CNP, конъюгированные с таким полимером на внутреннем участке. Для краткости в настоящем описании ПЭГ (или ПЭО) будет использован в качестве типичного примера гидрофильного или водорастворимого полимера. Возможны различные участки пегилирования варианта CNP, включая без ограничения: (1) пегилирование только на N-конце; (2) пегилирование только на C-конце; (3) пегилирование только на внутреннем участке (например, Lys4); (4) пегилирование на обоих концах: на N-конце и C-конце; (5) пегилирование на N-конце и внутреннем участке и (6) пегилирование на C-конце и внутреннем участке. Для повышенной резистентности к расщеплению под действием NEP и сохранения функциональности CNP в некоторых вариантах общая масса пегилированных вариантов CNP находится в диапазонах, в общем, описанных в настоящей публикации, например, в диапазоне примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 4, 5, 6 или 7 кДа. В конкретном варианте CNP17, CNP22, CNP37 (которые определены ниже) или их варианты (включая варианты, имеющие добавления, замены и/или делеции аминокислот) пегилированы только на N-конце. В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP пегилированы только на внутреннем участке (например, Lys4). В еще одном варианте осуществления изобретения варианты CNP пегилированы на N-конце и внутреннем участке (например, Lys4). В еще одном варианте для лучшей функциональности варианты CNP не пегилированы на участке (например, Lys10) в циклическом домене (соответствующем Cys6-Cys22 в CNP22). Чтобы предотвратить пегилирование на внутреннем участке, Lys4 и/или Lys10 могут быть заменены природной или неприродной аминокислотой или пептидомиметиком, который не содержит реакционно-способной первичной аминогруппы, такой как, например, Gly, Ser, Arg, Asn, Gln, Asp, Glu или цитруллин (Cit). В конкретном варианте Lys4 и/или Lys10 заменены на Arg. В другом варианте Lys10 не заменен на Arg.

В описании предлагается применение гидрофильных или водорастворимых полимеров (например, молекул ПЭГ), которые могут варьировать по своему типу (например, гомополимер или сополимер; случайный, чередующийся или блок-сополимер; линейный или разветвленный; монодисперсный или полидисперсный), связи (например, гидролизуемая или стабильная связь, такая как, например, амидная, иминная, аминальная, алкиленовая или сложноэфирная связь), участку конъюгирования (например, на N-конце и/или C-конце, предпочтительно не в одном из остатков в циклизованной области CNP (соответствующей остаткам 6-22 CNP22)) и длине (например, примерно от 0,2, 0,4 или 0,6 кДа до примерно 2, 3, 4 или 5 кДа). Гидрофильный или водорастворимый полимер может быть конъюгирован с пептидом CNP с использованием химического способа, основанного на N-гидроксисукцинимиде (NHS) или альдегиде, или другого химического способа, который известен в данной области. Такие варианты CNP могут быть созданы с использованием, например, wtCNP-22 (2,2 кДа); CNP-17, сохраняющий только циклизованную область (остатки 6-22) wtCNP22, варианты CNP, имеющие аминокислотное удлинение на N-конце и/или C-конце CNP22, или варианты с аминокислотными заменами, добавлениями и/или делециями, например, GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 37), R-CNP22 (SEQ ID NO: 40), R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 41), ER-CNP22 (SEQ ID NO: 38) и ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 39). В одном варианте осуществления изобретения варианты ПЭГ-CNP, имеющие общую массу в диапазонах, в общем, описанных в настоящей публикации, например, примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа, содержат монодисперсную линейную группу ПЭГ (или ПЭО), конъюгированную на N-конце и/или C-конце с использованием основанной на NHS или альдегиде химии, или разветвленную на два плеча или три плеча группу ПЭГ, конъюгированную на N-конце и/или C-конце с использованием основанной на NHS химии. Изобретение дополнительно предполагает отрицательно заряженные варианты ПЭГ-CNP, предназначенные для пониженного почечного клиренса, включая без ограничения карбоксилированные, сульфатированные и фосфорилированные соединения.

В родственном варианте осуществления изобретения предлагаются конъюгаты ПЭГ-CNP, содержащие основанный на NHS или альдегиде ПЭГ формулы (CH₂CH₂O)_n, где n означает целое число от 12 до 50, и полимер ПЭГ имеет молекулярную массу вплоть до примерно 2,5 кДа. В конкретном варианте n равно 12 или 24. В одном варианте концевая гидроксильная группа полимера ПЭГ блокирована химически неактивной группой. В конкретном варианте блокирующей группой является алкильная группа, например, низшая алкильная группа, такая как метил.

В дополнительном варианте полимеры ПЭГ или их производные имеют среднечисловую молекулярную массу полимера в диапазоне примерно от 0,4 кДа до примерно 2,5 кДа или примерно от 0,6 кДа до примерно 1,5 кДа.

В следующем варианте пептид wtCNP или пептид варианта CNP конъюгирован с компонентом, включая, например, бисфосфонаты, углеводы, гидрофобные кислоты (включая жирные кислоты) или аминокислотные последовательности. Такие аминокислотные последовательности включают, например, поли-Asp или поли-Glu, применимые для целенаправленного воздействия на кости/хрящи, или могут быть получены из белков костей с известными направляющими к костям доменами или их производных, такие как, например, слитые белки или пептидные последовательности остеопонтина, остеокальцина, сиалопротеина и т.д. В описанных в настоящей публикации вариантах, в которых CNP22 или его вариант связан с направляющим к кости или хрящу остатком, такой остаток предназначен для стимуляции поступления модифицированного пептида CNP к хондроцитам ростовых пластинок кости, где пептид может связывать и активировать NPR-B на хондроцитах.

В другом варианте осуществления изобретения предлагаются варианты CNP с пептидной связью, которая менее чувствительна к расщеплению пептидазами, включая NEP. Изобретение охватывает вариант CNP, содержащий по меньшей мере один модифицированный остаток на участке расщепления эндопептидазой. В одном варианте пептидная связь Cys6-Phe7 (-C(=O)-NH-) на участке расщепления NEP в CNP может быть заменена любой из следующих изостер пептидной связи:

-CH₂-NH-,

-C(=O)-N(R)-, где амидная группа алкилирована любой из следующих групп R: метилом, этилом, н-пропилом, изопропилом, циклопропилом, н-бутилом, изобутилом, втор-бутилом или трет-бутилом,

-C(=O)-NH-CH₂-,

-CH₂-S-,

-CH₂-S(O)_n-, где n равно 1 или 2,

-CH₂-CH₂-,

-CH=CH-,

-C(=O)-CH₂-,

-CH(CN)-NH-,

-CH(OH)-CH₂-,

-O-C(=O)-NH- и

-NHC(=O)NH-.

В другом варианте Phe7 заменен энантиомером D-Phe. В еще одном варианте D-энантиомеры введены в одно или несколько, вплоть до всех 22 положений в wtCNP-22. В следующем варианте Phe7 заменен бета-аминокислотой, такой как 3-амино-2-фенилпропионовая кислота, которая увеличивает длину остова, при этом уменьшая длину боковой цепи. В еще одном варианте изобретение охватывает аналоги Cys в положении Cys6, включая без ограни