Биспецифические антигенсвязывающие белки

Биспецифические антигенсвязывающие белки

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к биспецифическим антигенсвязывающим белкам, способам их получения, фармацевтическим композициям, которые содержат указанные антитела, и их применению.

Предпосылки создания изобретения

В данной области известны сконструированные белки, такие как би- и мультиспецифические антитела, которые могут связываться с двумя или большим количеством антигенов. Указанные мультиспецифические связывающие белки можно создавать на основе методов клеточного слияния, химической конъюгации или рекомбинантной ДНК.

В последние годы создано широкое разнообразие форматов рекомбинантных мультиспецифических антител, например, четырехвалентные биспецифические антитела, полученные путем слияния, например, антитела IgG-формата и одноцепочечных доменов (см., например, Coloma M.J. и др. Nature Biotech 15, 1997, сс. 159-163; WO 001/077342 и Morrison S.L., Nature Bio'tech 25, 2007,cc. 1233-1234).

Разработано также несколько других новых форматов, в которых уже не сохранялась основная структура антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM), таких как димерные (диабоди), тримерные (триабоди) или тетрамерные (тетрабоди) антитела, мини-антитела, несколько одноцепочечных форматов (scFv, бис-scFv), которые могут связываться с двумя или большим количеством антигенов (Holliger Р. и др.. Nature Biotech 23, 2005, cc. 1126 - 1136; Fischer N., Leger О., Pathobiology 74, 2007, cc. 3-14; Shen J и др.. Journal of Immunological Methods 318, 2007, cc. 65-74; Wu С.и др.. Nature Biotech 25, 2007, cc. 1290-1297).

Во всех указанных форматах используют линкеры либо для слияния основной структуры антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) с дополнительным связывающим белком (например, scFv), либо для слияния, например, двух Fab-фрагментов или scFv (Fischer N., Leger О., Pathobiology 74, 2007, cc. 3-14). Хотя очевидно, что линкеры дают преимущества при создании биспецифических антител, с ними могут быть связаны также проблемы терапевтического плана. Фактически эти чужеродные пептиды могут вызывать иммунный ответ против самого линкера или области стыка между белком и линкером. Кроме того, гибкая природа этих пептидов делает их более чувствительными к протеолитическому расщеплению, что может приводить к плохой стабильности, агрегации и повышенной иммуногенности антитела. Кроме того, может существовать необходимость в поддержании эффекторных функций, таких, например, как комплементзависимая цитотоксичность (CDC) или антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC), которые опосредуются Fc-областью, путем сохранения высокой степени сходства с встречающимися в естественных условиях антителами.

Таким образом, в идеальном варианте необходимо создавать биспецифические антитела, структура которых очень сходна с общей структурой встречающихся в естественных условиях антител (типа IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) и имеет минимальное отклонение от человеческих последовательностей.

В соответствии с одним из подходов биспецифические антитела с высокой степенью сходства со встречающимися в естественных условиях антителами создавали с помощью технологии квадром (квадрогибридом) (см. Milstein С. и А.С.Cuello, Nature, 305, 1983, сс. 537-540) на основе соматического слияния двух различных клеточных линий гибридом, которые экспрессируют мышиные моноклональные антитела с требуемыми для биспецифического антитела специфичностями. В результате случайного спаривания тяжелых и легких цепей двух различных антител в образующейся линии клеток гибрида-гибридомы (или квадромы) получают вплоть до 10 различных видов антител, из которых только одно представляет собой требуемое функциональное биспецифическое антитело. Из-за присутствия полученных в результате ошибочного спаривания побочных продуктов и в значительной степени сниженного выхода продукта требуются более сложные процедуры очистки (см., например, Morrison S.L„ Nature Biotech 25, 2007, сс. 1233-1234). В целом, эта же проблема, связанная с ошибочно спаренными побочными продуктами, сохраняется и при применении методов рекомбинантной экспрессии.

Подход, с помощью которого можно обойти проблему, связанную с полученными в результате ошибочных спариваний побочными продуктами, известный под названием «кпоЬ8-ш1о-по1е5»-технология (взаимодействие по типу «выступ-впадина»), направлен на усиление спаривания тяжелых цепей двух различных антител путем интродукции мутаций в СН3-домены для модификации поверхности раздела в области контакта. На одной цепи имеющие большие размеры аминокислоты заменяли на аминокислоты с короткими боковыми цепями для создания «впадины». И, наоборот, аминокислоты с более крупными боковыми цепями интродуцировали в другой СН3-домен, создавая «выступ». Путем совместной экспрессии этих двух тяжелых цепей (и двух идентичных легких цепей, которые должны соответствовать обеим тяжелым цепям) достигали высоких выходов гетеродимерной конструкции («выступ-впадина») относительно гомодимерной конструкции («впадина-впадина» или «выступ-выступ») (Ridgway J. В. и др.. Protein Eng. 9, 1996, сс. 617-621; и WO 1996/027011). Процентное содержание гетеродимера можно дополнительно повышать путем ремоделирования поверхностей раздела двух СН3-доменов с помощью технологии фагового дисплея и интродукции дисульфидного мостика с целью стабилизации гетеродимеров (Merchant A.M и др.. Nature Biotech 16, 1998, сс. 677-681; Atwell S., Ridgway J.B., Wells J.A., Carter P., J Mol Biol 270, 1997, сс. 26-35). Новые подходы к технологии «knobs-into-holes» описаны, например, в ЕР 1870459А1. Хотя указанный формат, вероятно, является очень привлекательным, в настоящее время отсутствуют данные о его усовершенствовании в направлении клинического применения. Одним из важных ограничений этой стратегии является то, что легкие цепи двух родительских антител должны быть идентичными для предупреждения ошибочного спаривания и формирования неактивных молекул. Таким образом, эта технология не пригодна в качестве основы для более легкого создания рекомбинантных биспецифических антител к двум антигенам с использованием в качестве исходных двух антител к первому и второму антигену, поскольку должны быть оптимизированы или тяжелые цепи этих антител, и/или идентичные легкие цепи.

Другой подход, позволяющий решать проблему имеющих ошибочные спаривания побочных продуктов при получении биспецифических антител, является переход с гетеродимеров на гомодимеры путем использования полноразмерного антитела, которое специфически связывается с первым антигеном и тяжелые цепи которого слиты с N-концами двух слитых Fab-фрагментов, обладающих способностью связываться со вторым антигеном, как это описано в WO 2001/077342. Одним их важных недостатков этой стратегии является образование нежелательных неактивных побочных продуктов в результате ошибочного спаривания легких цепей полноразмерного антитела с CH1-VH-доменами Fab-фрагментов и в результате ошибочного спаривания легких цепей Fab-фрагмента с CH1-VH-доменами полноразмерного антитела.

В WO 2006/093794 описаны композиции гетеродимерных связывающих белков. В WO 99/37791 описаны многоцелевые производные антител. У Morrison и др., J. Immunolog, 160, 1998, сс. 2802-2808 описано влияние замены вариабельных областей на функциональные свойства IgG.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к биспецифическому антигенсвязывающему белку содержащему:

а) две легкие цепи и две тяжелые цепи антитела, которое специфически связывается с первым антигеном и содержит два Fab-фрагмента;

б) два дополнительных Fab-фрагмента антитела, которое специфически связывается с вторым антигеном, где указанные дополнительные Fab-фрагменты оба слиты посредством пептида-коннектора с С- или N-концами тяжелых цепей или легких цепей, указанных в подпункте а);

и где в Fab-фрагментах осуществлены следующие модификации:

I) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а), или в обоих Fab-

фрагментах, указанных в подпункте б),

вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга

и/или

константные домены CL и СН1 замены друг на друга,

II) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а),

вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга

и

константные домены CL и СН1 заменены друг на друга, и

в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте б),

вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга

или

константные домены CL и СН1 заменены друг на друга,

III) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а),

вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга

или

константные домены CL и СН1 заменены друг на друга, и

в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте б),

вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга

и

константные домены CL и СН1 заменены друг на друга,

IV) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а),

вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга

и

в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте б),

константные домены CL и СН1 заменены друг на друга, или

V) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а), константные домены CL и СН1 заменены друг на друга и

в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте б), вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга. Следующим вариантом осуществления изобретения является способ

получения антигенсвязывающего белка, предлагаемого в изобретении,

заключающийся в том, что

а) трансформируют клетку-хозяина

- векторами, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие биспецифический антигенсвязывающий белок, предлагаемый в изобретении,

б) культивируют клетку-хозяина в условиях, которые позволяют синтезировать указанную молекулу антитела, и

в) выделяют молекулу антитела из культуры. Следующим вариантом осуществления изобретения является клетка-хозяин, содержащая

- векторы, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антигенсвязывающий белок, предлагаемый в изобретении.

Следующим вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержит антигенсвязывающий белок, предлагаемый в изобретении, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.

Следующим вариантом осуществления изобретения является способ лечения пациента, который нуждается в терапии, отличающийся тем, что вводят пациенту в терапевтически эффективном количестве антигенсвязывающий белок, предлагаемый в изобретении.

Согласно изобретению соотношение требуемого биспецифического антигенсвязывающего белка и нежелательных побочных продуктов можно повышать путем замены определенных доменов а) в Fab-фрагменте полноразмерного антитела, которое специфически связывается с первым антигеном, и/или б) в двух дополнительных слитых Fab-фрагментах. Таким путем можно снижать количество нежелательных ошибочных спариваний легких цепей с «несоответствующими» им CH1-VH-доменами.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к биспецифическому антигенсвязывающему белку содержащему:

а) две легкие цепи и две тяжелые цепи антитела, которое специфически связывается с первым антигеном и содержит два Fab-фрагмента;

б) два дополнительных Fab-фрагмента антитела, которое специфически связывается с вторым антигеном, где указанные дополнительные Fab-фрагмент оба слиты посредством пептида-коннектора с С- или N-концами тяжелых цепей, указанных в подпункте а);

и где в Fab-фрагментах осуществлены следующие модификации:

I) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а), или в обоих Fab-

фрагментах, указанных в подпункте б),

вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга

и/или

константные домены CL и СН1 замены друг на друга,

II) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а),

вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга

и

константные домены CL и СН1 заменены друг на друга, и

в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте б),

вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга

или

константные домены CL и СН1 заменены друг на друга,

III) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а),

вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга,

или

константные домены CL и СН1 заменены друг на друга, и

в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте б),

вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга

и

константные домены CL и СН1 заменены друг на друга,

IV) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а),

вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга и

в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте б),

константные домены CL и СН1 заменены друг на друга, или

V) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а),

константные домены CL и СН1 заменены друг на друга, и в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте б),

вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения

биспецифический антигенсвязывающий белок, предлагаемый в изобретении, отличается тем, что

указанные дополнительные Fab-фрагменты оба слиты посредством пептида-коннектора либо с С-концами тяжелых цепей, указанных в подпункте

а), либо с М-концами тяжелых цепей, указанных в подпункте а).

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения биспецифический антигенсвязывающий белок, предлагаемый в изобретении, отличается тем, что

указанные дополнительные Fab-фрагменты оба слиты посредством пептида-коннектора с С-концами тяжелых цепей, указанных в подпункте а).

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения биспецифический антигенсвязывающий белок, предлагаемый в изобретении, отличается тем, что

указанные дополнительные Fab-фрагменты оба слиты посредством пептида-коннектора с N-концами тяжелых цепей, указанных в подпункте а).

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения биспецифический антигенсвязывающий белок, предлагаемый в изобретении, отличается тем, что

в Fab-фрагментах осуществлены следующие модификации:

I) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а), или в обоих Fab- фрагментах, указанных в подпункте б), вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга

и/или

константные домены CL и СН1 замены друг на друга.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения биспецифический антигенсвязывающий белок, предлагаемый в изобретении, отличается тем, что

в Fab-фрагментах осуществлены следующие модификации:

I) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а),

вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга

и/или

константные домены CL и СН1 замены друг на друга.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения биспецифический антигенсвязывающий белок, предлагаемый в изобретении, отличается тем, что

в Fab-фрагментах осуществлены следующие модификации:

I) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а),

константные домены CL и СН1 замены друг на друга.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения биспецифический антигенсвязывающий белок, предлагаемый в изобретении, отличается тем, что

в Fab-фрагментах осуществлены следующие модификации:

I) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте б),

вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга и/или

константные домены CL и СН1 замены друг на друга.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения биспецифический антигенсвязывающий белок, предлагаемый в изобретении, отличается тем, что

в Fab-фрагментах осуществлены следующие модификации:

I) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте б),

константные домены CL и СН1 замены друг на друга.

Согласно изобретению соотношение требуемого биспецифического антигенсвязывающего белка и нежелательных побочных продуктов (которые получены в результате ошибочного спаривания легких цепей с «несоответствующими» им CH1-VH-доменами) можно повышать путем замены определенных доменов а) в Fab-фрагменте полноразмерного антитела, которое специфически связывается с первым антигеном, и/или б) в двух дополнительных слитых Fab-фрагментах. В этом плане ошибочное спаривание означает ассоциацию I) легкой цепи полноразмерного антитела, указанного в подпункте а), с CH1-VH-доменами Fab-фрагментов, указанных в подпункте б); или II) легкой цепи Fab-фрагментов, указанных в подпункте б), с CH1-VH-доменами полноразмерного антитела, указанного в подпункте а), (см. фиг.3), что приводит к получению нежелательных неактивных или не полностью функциональных побочных продуктов.

В контексте настоящего описания понятие «антитело» относится к полноразмерному антителу, состоящему из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела (см. фиг.1). Тяжелая цепь полноразмерного антитела представляет собой полипептид, который содержит в направлении от N-конца к С-концу вариабельную область (домен) тяжелой цепи антитела (VH), домен 1 константной области тяжелой цепи антитела (СН1), шарнирную область антитела (HR), домен 2 константной области тяжелой цепи антитела (СН2) и домен 3 константной области тяжелой цепи антитела (СН3), что сокращенно обозначают как VH-CH1-HR-CH2-CH3; и необязательно домен 4 константной области тяжелой цепи антитела (СН4) в случае антитела подкласса IgE. Предпочтительно тяжелая цепь полноразмерного антитела представляет собой полипептид, который содержит в направлении от N-конца к С-концу VH, CH1, HR, СН2 и СН3. Легкая цепь полноразмерного антитела представляет собой полипептид, который содержит в направлении от N-конца к С-концу вариабельную область (домен) легкой цепи антитела (VL) и константную область легкой цепи антитела (CL), что сокращенно обозначают как VL-CL. Константная область легкой цепи антитела (CL) может относиться к к-(каппа)-типу или λ-(лямбда)-типу. Цепи антитела связаны друг с другом посредством расположенных между полипептидами дисульфидных мостиков, которые находятся между CL-доменом и CH1-доменом (т.е. между легкой и тяжелой цепью) и между шарнирными областями тяжелых цепей полноразмерного антитела. Примерами типичных полноразмерных антител являются встречающиеся в естественных условиях антитела типа IgG (например, IgG1 и IgG2), IgM, IgA, IgD и IgE). Антитела, предлагаемые в изобретении, могут иметь происхождение из одного вида, например, человеческие антитела, или они могут представлять собой химерные или гуманизированные антитела. Полноразмерные антитела, предлагаемые в изобретении, содержат два антигенсвязывающих центра, каждый из которых образован парой VH- и VL-областей, которые оба специфически связываются с одним и тем же (первым) антигеном. С-конец тяжелой или легкой цепи указанного полноразмерного антитела обозначает последнюю аминокислоту на С-конце указанной тяжелой или легкой цепи. Указанное антитело содержит два идентичных Fab-фрагмента, которые состоят из VH- и СН1-домена тяжелой цепи и VL- и CL-домена легкой цепи (см. фиг.1 и 2).

«Дополнительный Fab-фрагмент» (см. фиг.2) антитела, которое специфически связывается с вторым антигеном, означает дополнительный Fab-фрагмент, состоящий из VH- и СН1-домена тяжелой цепи и VL- и CL-домена легкой цепи второго антитела. Дополнительные Fab-фрагменты сливают в немодифицированном виде (см. фиг.3) посредством участка тяжелой цепи (либо СН1-, либо VH-домена) с С- или N-концами тяжелых цепей или легких цепей антитела, которое специфически связывается с первым антигеном.

В контексте настоящего изобретения понятие «пептид-коннектор» обозначает пептид, аминокислотные последовательности которого предпочтительно являются синтетическими. Такие пептиды-коннекторы, предлагаемые в изобретении, применяют для слияния антигенсвязывающих пептидов с С- или N-концом цепей полноразмерного и/или модифицированного полноразмерного антитела с образованием биспецифического антигенсвязывающего белка, предлагаемого в изобретении. Предпочтительно пептиды-коннекторы, указанные в подпункте в), представляют собой пептиды, аминокислотная последовательность которых состоит по меньшей мере из 5 аминокислот, предпочтительно состоит из 5-100, более предпочтительно из 10-50 аминокислот. В одном из вариантов осуществления изобретения пептид-коннектор представляет собой конструкцию (G_xS)_n или (G_xS)_nG_m, где G обозначает глицин, S обозначает серии и (х=3, п=3, 4, 5 или 6 и m=0, 1, 2 или 3) или (х=4, n=2, 3, 4 или 5 и m=0, 1, 2 или 3), предпочтительно х=4 и n=2 или 3, более предпочтительно х=4, n=2. В одном из вариантов осуществления изобретения пептид-коннектор представляет собой конструкцию (G₄S)₂.

В контексте настоящего описания понятия «сайт связывания» или «антигенсвязывающий центр» обозначают область(и) антигенсвязывающего белка, предлагаемого в изобретении, с которой(ыми) фактически связывается лиганд (например, антиген или фрагмент антигена) и который выведен из молекулы антитела или его фрагмента (например, Fab-фрагмента). Согласно изобретению антигенсвязывающий центр включает вариабельные домены тяжелой цепи антитела (VH) и вариабельные домены легкой цепи антитела (VL).

Антигенсвязывающие центры (т.е. пары VH/VL), обладающие способностью специфически связываться с требуемым антигеном, можно выводить из а) известных антител к антигену или б) новых антител или фрагментов антител, полученных de novo с помощью методов иммунизации с использованием, среди прочего, либо белка, либо нуклеиновой кислоты антигена или его фрагментов, или с помощью метода фагового дисплея.

Антигенсвязывающий центр антигенсвязывающего белка, предлагаемого в изобретении, содержит шесть гипервариабельных участков (CDR), которые вносят различный вклад в аффинность сайта связывания с антигеном. Они представляют собой три вариабельных домена (CDR-участки) тяжелой цепи (CDRH1, CDRH2 и CDRH3) и три вариабельных домена (CDR-участки) легкой цепи (CDRL1, CDRL2 и CDRL3). Размер CDR и каркасных участков (FR) определяют путем сравнения с компилированной базой данных аминокислотных последовательностей, в которых такие участки были определены на основе вариабельности последовательностей.

Специфичность антитела характеризует избирательное распознавание антителом конкретного эпитопа антигена. Например, встречающиеся в естественных условиях антитела являются моноспецифическими. Биспецифические антитела представляют собой антитела, которые обладают специфичностью связывания с двумя различными антигенами. Когда антитело имеет более одной специфичности, то распознаваемые эпитопы могут быть ассоциированы с одним антигеном или с несколькими антигенами.

В контексте настоящего описания понятие «моноспецифическое» антитело или «моноспецифический» антигенсвязывающий белок обозначает антитело или антигенсвязывающий белок, которое/который имеет один или несколько сайтов связывания, каждый из которых связывается с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена.

В контексте настоящего описания понятие «валентность» означает наличие определенного количества сайтов связывания в молекуле антитела. Например, встречающееся в естественных условиях антитело или полноразмерное антитело, предлагаемое в изобретении, имеет два сайта связывания и является двухвалентным. Таким образом, понятие «четырехвалентный» означает наличие четырех сайтов связывания в антигенсвязывающем белке. В контексте настоящего описания понятие «четырехвалентный, биспецифический» обозначает антигенсвязывающий белок, предлагаемый в изобретении, который имеет четыре антигенсвязывающих центра, два из которых связываются с другим антигеном (или другим эпитопом антигена). Антигенсвязывающие белки, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют четыре сайта связывания и являются четырехвалентными.

Полноразмерные антитела, предлагаемые в изобретении, содержат константные области иммуноглобулина из одного или нескольких классов иммуноглобулинов. Классы иммуноглобулинов включают изотипы IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, а в случае IgG и IgA, также их подтипы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полноразмерное антитело, предлагаемое в изобретении, имеет структуру константного домена, которая соответствует структуре антитела IgG-типа.

В контексте настоящего описания понятия «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» относятся к препарату антитела или молекулам антитела или антигенсвязывающего белка одинакового аминокислотного состава.

Понятие «химерное антитело» относится к антителу, содержащему вариабельную область, т.е. связывающую область, полученную из одного и того же источника или из одних и тех же видов, и по меньшей мере часть константной области, полученную из другого источника или других видов, и его, как правило, получают с использованием методов рекомбинантной ДНК. Предпочтительными являются химерные антитела, которые содержат мышиную вариабельную область и человеческую константную область. Другими предпочтительными формами «химерных антител», подпадающих под объем настоящего изобретения, являются антитела, константная область которых модифицирована или изменена по сравнению с исходным антителом с целью получения свойств, предлагаемых в изобретении, прежде всего касательно связывания C1q и/или связывания Fc-рецептора (FcR). Такие химерные антитела обозначают также как «антитела переключенного класса». Химерные антитела являются продуктом экспрессии генов иммуноглобулинов, содержащих сегменты ДНК, которые кодируют вариабельные области иммуноглобулинов, и сегменты ДНК, которые кодируют константные области иммуноглобулинов. Методы получения химерных антител включают обычные методы рекомбинантной ДНК и генной трансфекции, которые хорошо известны в данной области (см., например, Morrison S.L. и др., Ргос.Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, сс. 6851-6855; US 5202238 и US 5204244).

Понятие «гуманизированное антитело» относится к антителам, в которых каркасные или «гипервариабельные участки» (CDR) модифицированы так, что они содержат CDR иммуноглобулина другой специфичности по сравнению со специфичностью родительского иммуноглобулина. В предпочтительном варианте осуществления изобретения для получения «гуманизированного антитела» мышиный CDR трансплантируют в каркасный участок человеческого антитела (см., например, Riechmann L. и др.. Nature 332, 1988, сс. 323-327; и Neuberger M.S. и др.. Nature 314, 1985, сс. 268-270). Наиболее предпочтительные CDR соответствуют участкам, которые имеют последовательности, распознающие антигены, указанные выше для химерных антител. Другими формами «гуманизированных антител», подпадающих под объем настоящего изобретения, являются антитела, константная область которых дополнительно модифицирована или изменена по сравнению с исходным антителом с целью получения свойств, предлагаемых в изобретении, прежде всего касательно связывания C1q и/или связывания Fc-рецептора (FcR).

Понятие «человеческое антитело» в контексте настоящего описания относится к антителам, вариабельные и константные области которых выведены из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышей линии. Человеческие антитела хорошо известны в данной области (van Dijk M.A. и van de Winkel J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 2001, сс. 368-374). Человеческие антитела можно получать также в трансгенных животных (например, мышах), которые в результате иммунизации могут продуцировать полный спектр или определенную часть человеческих антител при отсутствии производства эндогенного иммуноглобулина. Перенос набора генов иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии в такую мутантную мышиную зародышевую линию должен приводить к производству человеческих антител после антигенной стимуляции (см., например, Jakobovits А., и др., Рrос.Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, сс. 2551-2555; Jakobovits А. и др.. Nature 362, 1993, сс. 255-258; Bruggemann M. и др.. Year Immunol. 7, 1993, сс. 33-40). Человеческие антитела можно получать также с помощью фаговых дисплейных библиотек (Hoogenboom H.R. и Winter G., J. Mol. Biol. 227, 1992, сс. 381-388; Marks J.D. и др., J. Mol. Biol. 222, 1991, сс. 581-597). Для получения человеческих моноклональных антител можно использовать также методы, разработанные Cole с соавторами и Boerner с соавторами (Cole и др.. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, под ред. Alan R. Liss, 1985, с.77; и Boerner Р. и др., J. Immunol. 147, 1991, сс. 86-95). Как уже было отмечено для химерных и гуманизированных антител, предлагаемых в изобретении, понятие «человеческое антитело» включает также такие антитела, константная область которых модифицирована с целью получения свойств, предлагаемых в изобретении, прежде всего касательно связывания C1q и/или связывания FcR, например, путем «переключения класса», т.е. замены или мутации Fc-областей (например, IgG1 на IgG4 и/или IgGl/IgG4-мутация).

Понятие «рекомбинантное человеческое антитело» в контексте настоящего описания относится ко всем человеческим антителам, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с помощью методов рекомбинации, например, к антителам, выделенным из клетки-хозяина, такой как NSO- или СНО-клетка, или из животного (например, мыши), которое является трансгенным из-за присутствия человеческих генов иммуноглобулинов или антител, экспрессируемых с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора, которым трансфектирована клетка-хозяин. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельную и константную области, которые находятся в преобразованной форме. Рекомбинантные человеческие антитела, предлагаемые в изобретении, подвергают соматической гипермутации in vivo. Таким образом, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и выведены из последовательностей VH и VL человеческой зародышевой линии и родственных им линий, могут не существовать в естественных условиях в спектре зародышевой линии человеческих антител in vivo.

Понятие «вариабельная область (домен)» (вариабельный домен легкой цепи (VL), вариабельный домен тяжелой цепи (VH)) в контексте настоящего описания относится к областям каждой из пары легких и тяжелых цепей, которые участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном. Домены вариабельных человеческих легких и тяжелых цепей имеют одинаковую общую структуру, и каждый домен содержит четыре каркасных участка (FR), последовательности которых являются весьма консервативными, связанных тремя «гипервариабельными участками» (или определяющими комплементарность участками, CDR). Каркасные участки адоптированы к β-складчатой конформации, а CDR могут образовывать петли, соединяющие β-складчатую структуру. CDR в каждой цепи сохраняют их трехмерную структуру с помощью каркасных участков и образуют вместе с CDR из других цепей антигенсвязывающий центр. CDRS-участки тяжелых и легких цепей антитела играют особенно важную роль в специфичности связывания/аффинности антител, предлагаемых в изобретении, и поэтому являются дополнительным объектом изобретения.

Понятия «гипервариабельный участок» или «антигенсвязывающий центр антитела» в контексте настоящего описания относятся к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывания антигена. Гипервариабельный участок содержит аминокислотные остатки из «определяющих комплементарность участков» или «CDR». «Каркасные» или «РР»-участки представляют собой участки вариабельной области, отличные от указанных в настоящем описании остатков гипервариабельного участка. Таким образом, легкие и тяжелые цепи антитела содержат в направлении от N- к С-концу участки FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. CDR каждой цепи разделены аминокислотами указанного каркасного участка. В частности, CDR3 тяжелой цепи представляют собой участок, который вносит наибольший вклад в связывание с антигеном. CDR- и FR-участки определяют с помощью стандартной номенклатуры Кэбота (Kabat и др.. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

В контексте настоящего описания понятия «связывание» или «специфическое связывание» относятся к связыванию антитела с эпитопом антигена, что определяют путем анализа in vitro, предпочтительно с помощью анализа резонанса поверхностного плазмона (BIAcore-анализ, фирма GE-Healthcare, Уппсала, Швеция) с использованием очищенного антигена дикого типа. Аффинность связывания характеризуют с помощью понятий k_a (константа скорости ассоциации антитела (либо антитела, либо антигенсвязывающего белка) при формировании комплекса антитело/антиген), k_D (константа диссоциации) и k_D (k_D/ka). Наличие связывания или специфического связывания означает, что аффиность связывания (К_D) составляет 10^-8 молей/л или менее, предпочтительно от 10^-9 до 10^-13 молей/л. Так, биспецифический антигенсвязывающий белок, предлагаемый в изобретении, специфически связывается с каждым антигеном, в отношении которого он обладает специфичностью, что характеризуется аффинностью связывания (К_D), составляющей 10^-8 молей/л или менее, предпочтительно от 10^-9 до 10^-13 молей/л.

Связывание антитела с FcyRIII можно оценивать с помощью BIAcore-анализа (фирма GE-Healthcare, Уппсала, Швеция). Аффинность связывания определяют с помощью понятий k_a (константа скорости ассоциации антитела при формировании комплекса антитело/антиген), k_D (константа диссоциации) и k_D(k_D/ka).

Понятие «эпитоп» включает любую полипептидную детерминанту, обладающую способностью специфически связываться с антителом. В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитопная детерминанта включает химически активные поверхностные группы молекул, такие как аминокислоты, боковые цепи Сахаров, фосфорил или сульфонил, и в некоторых вариантах осуществления изобретения они могут иметь специфические трехмерные структурные характеристики и/или специфические характеристики заряда. Эпитоп представляет собой область антигена, с которой связывается антитело.

В некоторых вариантах осуществления изобретения считается, что антитело специфически связывается с антигеном, когда оно преимущественно распознает свой антиген-мишень в сложной смеси белков и/или макромолекул.

В другом варианте осуществления изобретения биспецифический антигенсвязывающий белок, предлагаемый в изобретении, отличается тем, что указанное полноразмерное антитело относится к подклассу человеческого IgG1 или подклассу человеческого IgG1, имеющему мутации L234A и L235A.

В другом варианте осуществления изобретения биспецифический антигенсвязывающий белок, предлагаемый в изобретении, отличается тем, что указанное полноразмерное антитело относится к подклассу человеческого IgG2.

В другом варианте осуществления изобретения биспецифический антигенсвязывающий белок, предлагаемый в изобретении, отличается тем, что указанное полноразмерное антитело относится к подклассу человеческого IgG3.

В другом варианте осуществления изобретения биспецифический антигенсвязывающий белок, предлагаемый в изобретении, отличается тем, что указанное полноразмерное антитело относится к подклассу человеческого IgG4 или подклассу человеческого IgG4, имеющему дополнительную мутацию S228P.

Предпочтительно биспецифический антигенсвязывающий белок, предлагаемый в изобретении, отличается тем, что указанное полноразмерное антитело относится к подклассу человеческого IgG1, подклассу человеческого IgG4, имеющему дополнительную мутацию S228P.

При создании настоящего изобретения было установлено, что биспецифические антигенсвязывающие белки, предлагаемые в изобретении, обладают улучшенными характеристиками, такими как биологическая или фармакологическая активность, фармакокинетические свойства или токсичность. Их можно применять, например, для лечения заболеваний, таких как рак.

В контексте настоящего описания понятие «константная область» обозначает совокупность доменов антитела, отличных от вариабельной области. Константная область не принимает непосредственного участия в связывании с антигеном, но она обладает различными эффекторными функциями. Антитела подразделяют в зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей на классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, a некоторые из них можно дополнительно подразделять на подклассы, такие как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, IgA1 и IgA2. Константные области тяжелой цепи, соответствующие различным классам антител, обозначают символами α, δ, ε, γ и µ соответственно. Константные области легкой цепи (CL), которые могут присутствовать во всех пяти классах антител, обозначают символами к (каппа) и λ (лямбда).

В контексте настоящего описания понятие «константная область, выведенная из человеческого источника» обозначает константную область тяжелой цепи человеческого антитела подкласса IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 и/или константную область легкой каппа- или лямбда-цепи. Такие константные области хорошо известны в данной области, и они описаны, например, у Kabat Е.А. (см., например, Johnson, G. и Wu T.T., Nucleic Acids Res. 28, 2000, сс. 214-218; Kabat Е.А. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 1975, сс. 2785-2788).

В то в