2573915 - Содержащие суперспираль и/или привязку белковые комплексы и их применение

Содержащие суперспираль и/или привязку белковые комплексы и их применение

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело для использования в качестве биспецифического антитела, которое характеризуется тем, что содержит 4 полипептида. Первый и второй полипептид содержат: VH-домен, который связан с константным доменом, и суперспиральный домен (СС). При этом СС связан с константным доменом расщепляемым линкером и содержит в случае первого полипептида гептадный повтор: (X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇)_n, а в случае второго полипептида СС содержит гептадный повтор: (X′₁Х′₂Х′₃Х′₄Х′₅Х′₆Х′₇)_n, где n больше или равно 2. X₁, X′₁ - гидрофобный аминокислотный остаток или аспарагин, каждый из Х₂, Х₃, Х_6, Х′₂, Х′₃ и Х′₆ представляет собой любой аминокислотный остаток, Х₄, Х′₄ - гидрофобный аминокислотный остаток, а каждый из Х₅, Х₇, Х′₅ и Х′₇ представляет собой заряженный аминокислотный остаток. Причем в каждом гептадном повторе первый СС содержит остаток Х₅, который противоположен по заряду остатку Х′₇ во втором СС, и первый СС содержит остаток Х₇, который противоположен по заряду остатку Х′₅ во втором СС. Третий и четвертый полипептид содержат первый и второй VL-домены, соответственно. Также предложено антитело для использования в качестве гетеродимерного, содержащее три полипептида. При этом первый полипептид содержит: VH-домен, который связан с константным доменом, и суперспиральный домен (СС). Второй полипептид содержит константный домен, содержащий СН2- и СH3-домены и СС-домен. При этом СС связан с константным доменом расщепляемым линкером и содержит гептадный повтор такой же, как в биспецифическом антителе. Третий полипептид содержит VL-домен. Описан также способ получения антитела, предусматривающий стадию культивирования клетки, содержащей вектор, кодирующий антитело по изобретению в культуральной среде. Использование изобретения обеспечивает новый способ димеризации антител в присутствии константных областей при наличии СС домена, что может найти применение в получении биспецифических и гетеродимерных антител. 3 н. и 14 з.п. ф-лы, 32 ил., 6 табл., 7 пр.

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к новым рекомбинантным белкам, мультиспецифическим белковым комплексам, содержащим мультиспецифические антитела, к способам их конструирования и их получения. Настоящее изобретение также относится к новому применению технологий, применимых в получении мультиспецифических белковых комплексов.

Уровень техники

Поиск технологий для построения мультиспецифических антител, применимых и масштабируемых для коммерческих и терапевтических целей, был трудно выполнимым. Подвергались анализам многие способы, но почти все характеризовались существенными недостатками, такими как, помимо прочего, плохая растворимость, неэкспрессируемость в клетках млекопитающих, низкий выход образования гетеродимеров, техническая сложность производства, иммуногенность, короткое время полужизни in vivo, нестабильность (например, Hollinger et al., (1993) PNAS 90:6444-6448; патент США №5932448; патент США №6833441; патент США №5591828; патент США №7129330; патент США №7507796; Fischer et al., (2007) Pathobiology 74:3-14; Booy (2006) Arch. Immunol. Ther. Exp. 54:85-101; Cao et al. (2003) 55:171-197; и Marvin et al., (2006) Current Opinion in Drug Discovery & Development 9(2): 184-193). Таким образом, существует потребность в улучшенных технологиях и способах создания мультиспецифических антител.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к новым белковым комплексам и к способам создания и производства белковых комплексов. В одном аспекте настоящее изобретение относится к суперспиральному домену, который связывается с СН-компонентом Fc, причем по необходимости суперспиральный домен может быть или может не быть отщепляемым от Fc-содержащего белка. В другом аспекте настоящее изобретение относится к белку, содержащему комплекс привязки и СН-компонента Fc, причем привязка может быть или может не быть отщепляемой от белка. В другом аспекте настоящее изобретение относится к белку, содержащему суперспираль, привязку и СН-компонент Fc, оптимально способный к образованию белкового комплекса, причем привязка и/или суперспираль могут быть или могут не быть отщепляемыми от белка в зависимости от желаемого эффекта. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения белка, содержащего привязку, где привязка отщепляется клеткой-хозяином или отщепляется в результате химической или ферментативной реакции in vitro. В другом аспекте настоящее изобретение относится к белку, содержащему суперспираль, привязку и СН-компонент Fc, оптимально способный к образованию белкового комплекса, причем привязка и/или суперспираль являются отщепляемыми от белка клеткой-хозяином, которая экспрессирует белок и усиленно экспрессирует ферменты, способные отщеплять привязку и/или суперспираль от белка.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения белка или белкового комплекса, содержащего суперспираль и привязку, где привязка и/или суперспираль отщепляется клеткой-хозяином или отщепляется в результате химической или ферментативной реакции in vitro. В одном конкретном варианте осуществления белковый комплекс дополнительно содержит СН-компонент Fc. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу производства гетеромерного белкового комплекса, предусматривающему стадию культивирования клетки-хозяина при условиях, обеспечивающих экспрессию двух различных белков одинаковыми или различными рекомбинантными последовательностями нуклеиновой кислоты, причем каждый белок содержит суперспиральный домен и привязку. В следующем варианте осуществления клетка-хозяин содержит рекомбинантную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент, способный расщеплять привязку и/или суперспираль. В одном варианте осуществления способ производства дополнительно предусматривает стадию выделения белков, продуцированных клеткой-хозяином. В другом варианте осуществления способ производства дополнительно предусматривает стадию отщепления привязки и/или суперспирали от белка, продуцированного клеткой-хозяином.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к белковым комплексам, описанным в настоящем документе, с привязкой и/или суперспиралью или без таковых. В дополнение ко многим усовершенствованиям и преимуществам, обеспеченным согласно настоящему документу, настоящее изобретение представляет простой, эффективный, высокопроизводительный способ производства по существу гомогенных гетеромультимерных комплексов.

В одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к белковому комплексу, содержащему два или более полипептидов, где

первый полипептид содержит первый суперспиральный домен (СС) и первый СН-компонент Fc (FcCH); a

второй полипептид содержит (1) второй суперспиральный домен (СС) и второй FcCH,

где первый СС и второй СС образуют комплекс друг с другом; и первый FcCH и второй FcCH образуют комплекс друг с другом.

В одном варианте осуществления первый СС содержит последовательность формулы I по данному документу, а второй СС содержит последовательность формулы II по данному документу.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к белковому комплексу, содержащему (а) первый полипептид, содержащий первый суперспиральный домен (СС), где первый СС содержит гептадный повтор формулы I; и (b) второй полипептид, содержащий Fc СН-компонент и вторую суперспираль (СС), где второй СС содержит гептадный повтор формулы II, где n в формулах I и II больше или равно 2, и где в каждом гептадном повторе первый СС содержит остаток X₆, который противоположен по заряду остатку Х'₇ во втором СС, а первый СС содержит остаток Х₇, который противоположен по заряду остатку Х'₅ во втором СС.

В одном варианте осуществления первый полипептид дополнительно содержит VH-домен и VL-домен, а второй полипептид дополнительно содержит VH- и VL-домены, где VH- и VL-домены каждого полипептида связываются друг с другом в направлении от N-конца к С-концу: VL-CL-привязка-VH.

В следующем варианте осуществления VH-домен каждого полипептида отличается других. В другом варианте осуществления VL-домен каждого полипептида отличается от других.

В одном варианте осуществления белковый комплекс по настоящему изобретению содержит шарнирный участок, где шарнирный участок содержит мутацию K222A в своем шарнирном участке, мутацию С220А в своем шарнирном участке или мутации K222A и С220А в своем шарнирном участке.

В одном варианте осуществления белковый комплекс выбран из группы, состоящей из антитела, иммуноадгезина, пептидного антитела или аффитела. Таким образом, в соответствии со следующим вариантом осуществления первый и/или второй полипептиды могут дополнительно содержать связывающую мишень последовательность антитела (например, VH- или VL-домен), пептидное антитело (например, пептид), иммуноадгезин (например, внеклеточный домен) или каркасный белок, содержащий последовательность, которая связывает мишень.

В соответствии с одним вариантом осуществления белковый комплекс представляет собой антитело с одним плечом.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к белковому комплексу, содержащему суперспираль, содержащему (а) первый полипептид, содержащий первый суперспиральный домен (СС), где первый СС содержит гептадный повтор формулы I:

( X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 X 7 ) n ( Ф о р м у л а I ) ( S E Q I D N O : 29 ) ,

где

X₁ представляет собой гидрофобный аминокислотный остаток или аспарагин, каждый из Х₂, Х₃ и Х₆ представляет собой любой аминокислотный остаток, Х₄ представляет собой гидрофобный аминокислотный остаток, и каждый из Х₅ и Х₇ представляет собой заряженный аминокислотный остаток; и

(b) второй полипептид, содержащий второй суперспиральный домен (СС), где второй СС содержит гептадный повтор формулы II:

( X ' 1 X ' 2 X ' 3 X ' 4 X ' 5 X ' 6 X ' 7 ) n ( Ф о р м у л а I I ) ( S E Q I D N O : 30 )

где

X'₁ представляет собой гидрофобный аминокислотный остаток или аспарагин, каждый из Х'₂, Х'₃ и Х'₆ представляет собой любой аминокислотный остаток,

Х'₄ представляет собой гидрофобный аминокислотный остаток, и каждый из Х'₅ и X'₇ представляет собой заряженный аминокислотный остаток;

где n в формулах I и II больше или равно 2; и где в каждом гептадном повторе первый СС содержит остаток X₅, который противоположен по заряду остатку Х'₇ во втором СС, и первый СС содержит остаток Х₇, который противоположен по заряду остатку Х'₅ во втором СС.

В варианте осуществления каждый из первого и второго полипептидов содержит VH- и СН1-домены, и каждый может дополнительно содержать шарнирный домен. В другом варианте осуществления каждый из первого и второго полипептидов дополнительно содержит СН2- и СН3-домены. В еще одном варианте осуществления каждый из первого и второго полипептидов содержит VH-, СН1-, шарнирный, СН2- и СН3-домены, расположенные друг относительно друга в направлении от N-конца к С-концу: VH-СН1-шарнир-СН2-СН3.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, содержащему (а) первый полипептид, содержащий VH-домен и первый суперспиральный домен (СС), где первый СС содержит гептадный повтор формулы I:

( X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 X 7 ) n ( Ф о р м у л а I ) ,

где

X₁ представляет собой гидрофобный аминокислотный остаток или аспарагин, каждый из Х₂, Х₃ и Х₆ представляет собой любой аминокислотный остаток,

Х₄ представляет собой гидрофобный аминокислотный остаток, и каждый из Х₅ и X₇ представляет собой заряженный аминокислотный остаток; и

(b) второй полипептид, содержащий VH-домен и второй суперспиральный домен (СС), где второй СС содержит гептадный повтор формулы II:

( X ' 1 X ' 2 X ' 3 X ' 4 X ' 5 X ' 6 X ' 7 ) n ( Ф о р м у л а I I )

где

Х'₄ представляет собой гидрофобный аминокислотный остаток, и каждый из Х'₅ и Х'₇ представляет собой заряженный аминокислотный остаток;

где n в формулах I и II больше или равно 2; и где в каждом гептадном повторе первый СС содержит остаток Х₅, который противоположен по заряду остатку Х'₇ во втором СС, и первый СС содержит остаток Х₇, который противоположен по заряду остатку Х'₅ во втором СС.

В конкретном варианте осуществления антитело дополнительно содержит третий и четвертый полипептиды, где третий полипептид содержит первый VL-домен, а четвертый полипептид содержит второй VL-домен. В варианте осуществления VH-домен первого полипептида связывается с VL-доменом третьего полипептида с помощью привязки, и VH-домен второго полипептида связывается с VL-доменом четвертого полипептида с помощью привязки. В другом варианте осуществления третий полипептид дополнительно содержит первый CL-домен, где первые VL- и CL-домены расположены друг относительно друга в третьем полипептиде в направлении от N-конца к С-концу: VL-CL, и четвертый полипептид дополнительно содержит второй CL-домен, и где вторые VL- и CL-домены расположены друг относительно друга в четвертом полипептиде в направлении от N-конца к С-концу: VL-CL.

В дополнительном варианте осуществления последовательности первого VL-домена и второго VL-домена являются одинаковыми. В следующем варианте осуществления N-конец VH по меньшей мере одного из первого или второго полипептидов соединен с С-концом CL привязкой.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к антителу, содержащему (а) первый полипептид, содержащий VH-домен и первый суперспиральный домен (СС), где первый СС содержит гептадный повтор формулы I; и (b) второй полипептид, содержащий СН2- и СН3-домены и второй суперспиральный домен (СС), где второй СС содержит гептадный повтор формулы II, где n в формулах I и II больше или равно 2, и где в каждом гептадном повторе первый СС содержит остаток Х₅, который противоположен по заряду остатку Х'₇ во втором СС, и первый СС содержит остаток X₇, который противоположен по заряду остатку Х'₅ во втором СС.

В одном варианте осуществления второго аспекта настоящего изобретения первый полипептид содержит VH- и СН1-домены и может дополнительно содержать шарнирный домен. В другом варианте осуществления первый полипептид дополнительно содержит СН2- и СН3-домены. В следующем варианте осуществления второго аспекта настоящего изобретения первый полипептид содержит VH-, СН1-, шарнирный, СН2- и СН3-домены, расположенные друг относительно друга в направлении от Н-конца к С-концу: VH-СН1-шарнир-СН2-СН3. В еще одном варианте осуществления второго аспекта настоящего изобретения антитело дополнительно содержит третий полипептид, где третий полипептид содержит VL-домен. В одном примере третий полипептид дополнительно содержит CL-домен, и VL- и CL-домены расположены друг относительно друга в направлении от N-конца к С-концу: VL-CL. В еще одном варианте осуществления второго аспекта настоящего изобретения N-конец VH первого полипептида соединен с С-концом CL привязкой.

В одном варианте осуществления антитело с двумя плечами по настоящему изобретению содержит одну, а не две привязки так, что антитело содержит (1) полипептид, содержащий суперспиральный домен и тяжелую цепь, привязанную к легкой цепи в соответствии с настоящим изобретением, (2) полипептид, содержащий суперспиральный домен и тяжелую цепь, и (3) полипептид, содержащий легкую цепь. В другом варианте осуществления предусматривается клетка-хозяин, которая экспрессирует такое антитело с двумя плечами.

В других вариантах осуществления гидрофобный аминокислотный остаток в любом из X₁, X'₁, X₄ и Х'₄ выбран из группы аланина, валина, лейцина, изолейцина, триптофана, фенилаланина и метионина. В другом варианте осуществления заряженный аминокислотный остаток в любом из Х₅, Х'₅, Х₇ и Х'₇ выбран из группы лизина, аргинина, гистидина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты. В следующем варианте осуществления по меньшей мере в одном гептадном повторе первого СС X₁ представляет собой аспарагин, и соответствующий X'₁ представляет собой аспарагин по меньшей мере в одном гептадном повторе второго СС.

В еще одном варианте осуществления первый СС содержит гептадный повтор, где X₁ представляет собой лейцин или аспарагин, Х₂ представляет собой аланин или глутамин, Х₃ представляет собой аланин или глутамин, Х₄ представляет собой лейцин, X₅ представляет собой глутаминовую кислоту, Х₆ представляет собой лизин или триптофан, а Х₇ представляет собой глутаминовую кислоту; и второй СС содержит гептадный повтор, где X'₁ представляет собой лейцин или аспарагин, Х'₂ представляет собой аланин или глутамин, Х'₃ представляет собой аланин или глутамин, Х'₄ представляет собой лейцин, X'₅ представляет собой лизин, Х'₆ представляет собой лизин или триптофан, а Х'₇ представляет собой лизин.

В следующих вариантах осуществления п в формулах I и II больше или равно 3, например, больше или равно 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100.

В дополнительных вариантах осуществления по меньшей мере один из первого или второго СС связан С-концом с константным доменом белка. Например, константным доменом является СН3-домен, и первый СС связан С-концом с СН3-доменом первого полипептида, а второй СС связан С-концом с СН3-доменом второго полипептида. Связывание, например, осуществляется расщепляемой линкерной последовательностью. В других вариантах осуществления сайт расщепления эндопептидазой Lys-C расположен ближе к N-концу по меньшей мере одного из первого или второго СС.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, содержащему первый полипептид, содержащий VL-, CL-, привязки, VH-, СН1-, СН2- и СН3-домены, расположенные друг относительно друга в направлении от N-конца к С-концу: VL-CL-привязка-VH-СН1-СН2-СН3 (формула III). В одном варианте осуществления антитело дополнительно содержит второй полипептид формулы III.

В конкретном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению является мультиспецифическим. Например, антитело является способным к связыванию по меньшей мере 2 антигенов, или антитело является способным к связыванию по меньшей мере 2 эпитопов на одном и том же антигене. В другом варианте осуществления антитело является биспецифическим.

В дополнительном варианте осуществления белки по настоящему изобретению содержат привязку, содержащую глициновый (G) и сериновый (S) остатки. В одном варианте осуществления привязка, например, характеризуется длиной от 15 до 50 аминокислот. В конкретном варианте осуществления привязка характеризуется длиной от 20 до 32 аминокислот, например, характеризуется длиной 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32 аминокислот. Привязка в одном варианте осуществления содержит GGS повторы. В другом варианте осуществления привязка является отщепляемой. В одном предпочтительном варианте осуществления привязка является отщепляемой в двух сайтах на или близко к N- и С-концам привязки одним и тем же ферментом. В одном варианте осуществления привязка содержит сайт расщепления для фурина. В следующем варианте осуществления фуриновым сайтом расщепления является RXRXRR (SEQ ID NO:25), где X является любой аминокислотой.

В следующем варианте осуществления антитело по настоящему изобретению содержит мутацию, которая удаляет сайт расщепления эндопептидазой Lys-C. В одном примере мутация, которая удаляет сайт расщепления эндопептидазой Lys-C, находится в шарнирном домене. Например, антитело содержит замену K222A (европейская система нумерации).

В другом варианте осуществления привязка или линкер являются расщепляемыми одной или несколькими из следующих эндопептидаз: фурином, тромбином, гененазой, Lys-C, Arg-C, Asp-N, Glu-C, фактором Ха, протеазой вируса гравировки табака (TEV), энтерокиназой, протеазой риновируса С3 человека (HRV С3) или кининогеназой. В конкретном варианте осуществления привязка или линкер содержат пептидную связь аспарагин-глицин, например, пептидную связь аспарагин-глицин, которая является расщепляемой гидроксиламином.

В одном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению дополнительно содержит мутации в CL/CH1 и/или в VH/VL области контакта с использованием методики «KnH». В одном варианте осуществления мультиспецифическое антитело по настоящему изобретению было сконструировано с использованием суперспирали по настоящему изобретению и «кнопки и застежки» в области контакта CL/CH1.

В дополнительном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению содержит константный участок, конъюгированный с цитотоксическим средством.

В еще одном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению экспрессируется эукариотической клеткой, например, клеткой млекопитающего, такой как клетка СНО. В альтернативном варианте осуществления антитело экспрессируется прокариотической клеткой, например, клеткой Е. coli.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения белкового комплекса, такого как антитело. В соответствии с этим настоящее изобретение представляет некоторые новые аспекты. В одном варианте осуществления этот способ предусматривает стадию культивирования клетки, содержащей вектор, кодирующий белок по настоящему изобретению, в культуральной среде. В одном варианте осуществления способ дополнительно предусматривает извлечение белка из клетки или культуральной среды. В другом варианте осуществления способ дополнительно предусматривает стадии (а) захватывания антитела в колонке, содержащей Белок А, (b) элюирование антитела из колонки и (с) разбавление элюированного антитела раствором, содержащим хаотропное средство или мягкое поверхностно-активное вещество.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу поддержания содержащего суперспираль антитела в растворе. Этот способ предусматривает поддержание антитела в присутствии хаотропного средства или мягкого поверхностно-активного вещества. Примеры хаотропных средств или мягких поверхностно-активных веществ, которые могут быть использованы в этом способе, включают аргинин, гуанидин-HCl, мочевину, перхлорат лития, гистидин, додецилсульфат натрия (SDS), Твин, Тритон и NP-40.

В одном варианте осуществления гетеромультимерный комплекс по настоящему изобретению связывается с двумя или более молекулами-мишенями. В другом варианте осуществления каждый полипептид в гетеромультимерном комплексе связывается с другой молекулой-мишенью. В еще одном варианте осуществления гетеромультимерный комплекс ингибирует биологическую активность молекулы-мишени (молекул), с которой он связывается. В одном варианте осуществления, когда желаемый биологический эффект заключается в приведении клетки в истощенное или инактивированное состояние в непосредственной близости от эффекторной клетки (например, Т-лимфоцит, натуральная киллерная клетка (NK), макрофаг или другие одноядерные клетки), одной из молекул-мишеней может быть CD3, CD16 или CD64.

В соответствии с одним вариантом осуществления гетеромультимерный комплекс по настоящему изобретению связывается по меньшей мере с двумя молекулами-мишенями, выбранными из группы, состоящей из: IL-1 альфа и IL-1 бета, IL-12 и IL-18; IL-13 и IL-9; IL-13 и IL-4; IL-13 и IL-5; IL-5 и IL-4; IL-13 и 1b-1 бета; IL-13 и IL-25; IL-13 и ТАКС; IL-13 и MDC; IL-13 и МЕР; IL-13 и TGF-P; агониста IL-13 и LHR; IL-12 и TWEAK, IL-13 и CL25; IL-13 и SPRR2a; IL-13 и SPRR2b; IL-13 и ADAM8, IL-13 и PED2, IL17A и IL17F, CD3 и CD19, CD138 и CD20; CD138 и CD40; CD19 и CD20; CD20 и CD3; CD3 8 и CD138; CD3 8 и CD20; CD3 8 и CD40; CD40 и CD20; CD-8 и IL-6; CD20 и BR3, ТNFальфа и TGF-бета, ТNFальфа и IL-1 бета; ТNFальфа и IL-2, TNFальфа и IL-3, ТNFальфа и IL-4, ТNFальфа и IL-5, ТNFальфа и IL6, ТNFальфа и IL8, TNFальфа и IL-9, ТNFальфа и IL-10, TNFальфa и IL-11, ТNFальфа и IL-12, ТNFальфа и IL-13, ТNFальфа и IL-14, ТNFальфа и IL-15, ТNFальфа и IL-16, ТNFальфа и IL-17, ТNFальфа и IL-18, ТNFальфа и IL-19, ТNFальфа и IL-20, ТNFальфа и IL-23, TNFальфа и TNFальфа, ТNFальфа и CD4, ТNFальфа и VEGF, ТNFальфа и MIF, ТМFальфа и ICAM-1, ТNFальфа и PGE4, ТNFальфа и PEG2, ТМFальфа и RANK лиганда, ТМFальфа и Те38; ТNFальфа и BAFF; ТNFальфа и CD22; ТNFальфа и CTLA-4; ТNFальфа и GP130; TNFα и IL-12p40; VEGF и HER2, VEGF-A и HER2, VEGF-A и PDGF, HER1 и HER2, VEGF-A и VEGF-C, VEGF-C и VEGF-D, HER2 и DR5, VEGF и IL-8, VEGF и MET, VEGFR и MET рецептора, VEGFR и EGFR, HER2 и CD64, HER2 и CD3, HER2 и CD16, HER2 и HER3; EGFR и HER2, EGFR и HER3, EGFR и HER4, IL-13 и CD40L, IL4 и CD40L, TNFR1 и IL-1R, TNFR1 и IL-6R и TNFR1 и IL-18R, ЕрСАМ и CD3, MAPG и CD28, EGFR и CD64, CSPG и RGM А; CTLA-4 и BTN02; IGF1 и IGF2; IGF1/2 и Erb2B; MAG и RGM A; NgR и RGM A; NogoA и RGM A; OMGp и RGM A; PDL-I и CTLA-4; и RGM А и RGM В.

В следующем варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу, содержащему первую тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:1, вторую тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:2, и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:3, где антитело специфически связывает FcεRI и FcγR2b.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу, содержащему первую тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:4, вторую тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:5, и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:6, где антитело специфически связывает HER2.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу, содержащему первую тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:7, вторую тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:5, и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:8, где антитело специфически связывает EGFR.

В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу, содержащему первую последовательность легкой цепи и первую последовательность тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO:9, и вторую последовательность легкой цепи и вторую последовательность тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO:10, где антитело специфически связывает HER2 и EGFR.

В следующем варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу, содержащему первую последовательность легкой цепи и первую последовательность тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO:11, и вторую последовательность легкой цепи и вторую последовательность тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO:10, где антитело специфически связывает HER2 и EGFR.

Настоящее изобретение также относится к применению антител, полученных в соответствии со способами, описанными в настоящем документе, в способах лечения. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению антитела, которое специфически связывает FcεR1 и FcγR2b, в способе лечения аллергической или воспалительной реакции (например, аутоиммунного заболевания) у субъекта. Этот способ предусматривает введение антитела или фрагмента антитела субъекту в течение времени и в количестве, достаточных для лечения аллергической или воспалительной реакции у субъекта. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению антитела, которое специфически связывает HER2 или EGFR (или и HER2, и EGFR), в способе лечения опухоли у субъекта. Этот способ предусматривает введение антитела или фрагмента антитела субъекту в течение времени и в количестве, достаточных для лечения опухоли у субъекта.

В конкретных вариантах осуществления способы лечения, описанные в настоящем документе, предусматривают применение фрагмента антитела, который не содержит суперспирали и/или привязки. В этом варианте осуществления последовательности суперспирали и/или привязки отщепляются от антитела после получения, и полученное в результате рекомбинантное антитело применяется для терапевтического введения. В следующих вариантах осуществления способы лечения предусматривают введение субъекту эффективного количества второго лекарства. Второе лекарство может представлять собой другое антитело или фрагмент антитела, химиотерапевтическое средство, цитотоксическое средство, антиангиогенное средство, иммуносупрессивное средство, пролекарство, цитокин, цитокиновый антагонист, цитотоксическую лучевую терапию, кортикостероид, противорвотное средство, противораковую вакцину, анальгетик или ингибирующее рост средство. Второе лекарство может быть введено до или после введения первого лекарства (например, антитела или фрагмента антитела). В другом варианте осуществления второе лекарство вводится одновременно с первым лекарством.

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему последовательность любой из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 17-18, 26, 31-32 или 35-36 или их комбинации, вектору, содержащему полинуклеотид, содержащий последовательность любой из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 17-18, 26, 31-32 или 35-36 или их комбинации, и клетке-хозяину, содержащей такой вектор. Клеткой-хозяином может быть эукариотическая клетка, такая как клетка дрожжей, насекомых или млекопитающих. В одном варианте осуществления клеткой млекопитающего является клетка яичника китайского хомячка (клетка СНО). Клеткой-хозяином также может быть прокариотическая клетка, такая как клетка Е. coli. В других вариантах осуществления настоящее изобретение характеризует выделенный полипептид, содержащий любую последовательность из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 17-18, 26, 31-32 или 35-36 или их комбинации.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания, графических материалов и формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 схематично представлены ионные и гидрофобные взаимодействия между аминокислотами в типичной структуре суперспирали (СС). Остатки в первой СС обозначены X₁-Х₇, а остатки во второй СС обозначены X'₁-X'₇. Обозначены ионные взаимодействия между остатком X₅ первой СС и остатком Х'₇ второй СС, а также остатком X₇ первой СС и остатком Х'₅ второй СС. Кроме того, показаны гидрофобные взаимодействия между остатками Х₄, и Х'₄, и X₁, и X'₁.

На фиг.2А показаны аминокислотные последовательности типичных ACID.p1 (SEQ ID NO:12) и BASE.p1 (SEQ ID NO:13) суперспиральных доменов гетеродимеризации и кодирующие их последовательности ДНК (SEQ ID NO:21 и SEQ ID NO:22, соответственно).

На фиг.2В схематично представлены взаимодействия между типичными суперспиральными доменами гетеродимеризации ACID.p1 и BASE.p1 и последовательностями ДНК SEQ ID NO:21 и SEQ ID NO:22, соответственно.

На фиг.3 схематично представлена структура типичного биспецифического антитела, содержащего общую легкую цепь (общую LC), гетеродимерную суперспираль и мутацию в шарнирном участке (K222A; система нумерации по Kabat) первой и второй тяжелых цепей (НС1 и НС2), которая удаляет сайт расщепления эндопептидазой Lys-C.

На фиг.4А схематично представлена структура типичного антитела с одним плечом, содержащего полноразмерную тяжелую цепь (НС1), неполную тяжелую цепь (НС2), не содержащую VH- и СН1-доменов, легкую цепь (общую LC), гетеродимерную суперспираль и мутацию в шарнирном участке (K222A) НС1, которая удаляет сайт расщепления эндопептидазой Lys-C.

На фиг.4В схематично представлена структура типичного конъюгированного антитела, содержащего две полноразмерные тяжелые цепи, общую легкую цепь, суперспираль и цитотоксическое средство, конъюгированный с одним из константных участков тяжелой цепи. Цитотоксическое средство отмечено звездочкой.

На фиг.5 схематично представлена структура типичного привязанного биспецифического антитела. Антитело содержит две тяжелых цепи (НС1 и НС2) и две легких цепи (LC1 и LC2). Привязка связывает N-конец вариабельной тяжелой цепи НС1 с С-концом константной легкой цепи LC1, а вторая привязка связывает N-конец вариабельной тяжелой цепи НС2 с С-концом константной легкой цепи LC2. В этом примере привязки включают повторы глицин-глицин-серин (GGS). На этой фигуре легкие цепи (LC1 и LC2) являются различными, но привязанное антитело также может содержать общую легкую цепь. Типичное привязанное антитело дополнительно содержит гетеродимерную суперспираль и мутацию в шарнирном участке (K222A) НС1 и НС2, которая удаляет сайт расщепления эндопептидазой Lys-C.

На фиг.6 схематично представлена структура типичных тяжелой цепи (НС) и легкой цепи (LC), а также типичной привязки, связывающей N-конец вариабельной тяжелой цепи с С-концом константной легкой цепи. В этом примере расстояние, перекрытое привязкой, составляет приблизительно 92А или приблизительно 22 аминокислот в длину. Были тестированы привязки длиной 20, 23 и 26 аминокислот.

На фиг.7А схематично представлена структура типичного антитела, содержащего отщепляемые привязки и гетеродимерную суперспираль. Как показано на фигуре, типичная привязка связывает С-конец легкой цепи (LC) с N-концом тяжелой цепи (НС). Привязка может быть отщеплена от антитела по сайтам расщепления (X) с использованием, например, эндопептидазы Lys-C, фурина (РС1) или МН₃ОН (гидроксиламина). Типичные сайты расщепления расположены на N- и С-концах привязки. Типичное антитело, показанное на фиг.7А, также содержит гетеродимерную суперспираль, которая может быть отщеплена от антитела по сайтам расщепления (X) ближе к N-концу к суперспиральным доменам с использованием, например, эндопептидазы Lys-C, фурина (РС1) или NH₂OH.

На фиг.7В схематично представлены типичные расщепляемые привязки. В верхней части схемы показана типичная 26 аминокислотная последовательность привязки (SEQ ID NO:17) в SEQ ID NO:31, которая может быть отщеплена фурином и связывает N-конец легкой цепи (LC) и С-конец тяжелой цепи (НС). Фурин может отщеплять последовательность привязки по двухосновным сайтам (аргинин-аргинин) на N- и С-концах привязки. В нижней части схемы показана типичная 26 аминокислотная последовательность привязки (SEQ ID NO:18) в SEQ ID NO:32, которая может быть отщеплена эндопептидазой Lys-C по лизиновым остаткам на N- и С-концах последовательности привязки.

На фиг.8 показаны последовательности тяжелой цепи (НС; последовательность к FcγR2b-BASE.p1 и последовательность к FcεR1-ACID.p1) и общей легкой цепи (4d5 LC) биспецифического антитела, которое связывается и с FcεR1, и с FcγR2b. Последовательность к FcγR2b-BASE.p1 (SEQ ID NO:1) содержит последовательность тяжелой цепи к FcγR2b человека с последовательностью BASE.p1 суперспирального домена гетеродимеризации и мутацию K222A в шарнирном участке. Последовательность к FcεR1-ACID.p1 (SEQ ID NO:2) содержит последовательность тяжелой цепи к FcεR1 человека с последовательностью ACID.p1 суперспирального домена гетеродимеризации и мутацию K222A в шарнирном участке. Легкая цепь 4d5 антитела (SEQ ID NO:3) является общей для НС и FcγR2b, и FcεR1 этого биспецифического антитела.

На фиг.9-1 и 9-2 представлены последовательности, использованные для образования типичных антител с одним плечом. Одно типичное антитело с одним плечом специфически связывает HER2 и содержит последовательность антитела к HER2 1.ACID.p1 (НС анти-HER2 антитела-1 с последовательностью ACID.p1 суперспирального домена гетеродимеризации и мутацией K222A; SEQ ID NO:4), последовательность truncFC.BASE.p1 (тяжелую цепь, не содержащую VH- и СН1-домены с последовательностью BASE.p1 суперспирального домена гетеродимеризации; SEQ ID NO:5) и последовательность LC анти-HER2 антитела-1 (SEQ ID NO:6). Другое типичное антитело с одним плечом специфически связывает EGFR и содержит НС последовательнос

Содержащие суперспираль и/или привязку белковые комплексы и их применение

Патент 2573915