Способы рафинирования масла

Способы рафинирования масла

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По данной заявке испрашивается приоритет по условной заявке США No. 61/252638, поданной 16 октября 2009 года. Содержание указанной выше заявки включено в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПРЕДОСТАВЛЕННЫЙ ЧЕРЕЗ EFS-WEB

Эта заявка была подана в электронной форме через сервер USPTO EFS-WEB, что разрешено и указано в MPEP § 1730 II.B.2.(a)(A), и эти поданные в электронной форме документы включают представленный в электронной форме список последовательностей (SEQ ID); полное содержание этого списка последовательностей включено в настоящий документ в качестве ссылки для любых целей. Список последовательностей обозначен на поданном в электронном виде файле.txt следующим образом:

Название файла	Дата создания	Размер
001631-0051-888_SeqListing.txt	15 октября 2009 года	17,4 кбайт

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится, главным образом, к ферментам фосфолипазам, полинуклеотидам, кодирующим эти ферменты, способам получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. В альтернативных вариантах осуществления изобретение относится к ферментам фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC), нуклеиновым кислотам, кодирующим их, антителам, которые специфично связываются с ними и способам их получения и применения. Предусматриваются промышленные способы и продукты, включающие применение этих фосфолипаз. Также в настоящем документе предусматриваются способы гидратации негидратируемых фосфолипидов (NHP) в липидной матрице.

Способы обеспечивают миграцию NHP к поверхности контакта масло-вода, тем самым позволяя проведение реакции или удаление NHP из липидов. В определенных вариантах осуществления предусматриваются способы удаления NHP, гидратируемых фосфолипидов и лецитинов (в совокупности, известных как "камеди") из растительных масел с получением продукта в виде рафинированного масла или жира, который можно использовать для производства продуктов питания и/или непищевых применений. В определенных вариантах осуществления в настоящем документе предусмотрены способы гидратации NHP с последующей ферментативной обработкой и удалением различных фосфолипидов и лецитинов. Способы, представленные в настоящем документе, можно применять на практике либо для неочищенных, либо для рафинированных гидратацией масел. В определенном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрены способы получения фосфолипидов из пищевого масла.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Неочищенные растительные масла, получаемые способами либо прессования, либо экстракции растворителем, представляют собой комплексную смесь триацилглицеринов, фосфолипидов, стеринов, токоферолов, свободных жирных кислот, металлических микроэлементов и других менее значительных соединений. Является желательным удаление фосфолипидов, свободных жирных кислот и металлических микроэлементов для получения качественного салатного масла с мягким вкусом, светлым цветом и длительным сроком годности, или масла, пригодного для преобразования в сырье, готовое для химической или ферментативной конверсии в биотопливо (метиловые или этиловые сложные эфиры), биопластик (эпоксидированное масло) и другие традиционные материалы на основе нефти.

Удаление фосфолипидов обуславливает практически все потери, связанные с очисткой растительных масел. Большинство молекул фосфолипидов обладают как гидрофильной функциональной группой, так и липофильными цепями жирных кислот, они обычно являются превосходными природными эмульгаторами. Функциональная группа в фосфолипидах может представлять собой любую или несколько из множества известных типов, некоторые из которых проиллюстрированы на схеме 1 ниже.

Схема 1: Функциональные группы в фосфолипидах

Фосфолипиды, содержащие функциональные группы: -холин, -инозитол и -этаноламин, обладают наилучшей аффинностью к воде, в то время как кислоты, соли кислот (с кальцием (Ca), магнием (Mg) и железом (Fe)) и соли -этаноламина (Ca, Mg и Fe) обладают значительно более низкой аффинностью к воде. Фосфатидная кислота и соли фосфатидной кислоты широко известны как "негидратируемые фосфолипиды" или NHP. Таблица 1 содержит относительные степени гидратации различных фосфолипидов, как описано в Sen Gupta, A. K., Fette Seifen Anstrichmittel 88, pages 79-86 (1986), и позднее в Segers, J.C., et al., "Degumming-Theory and Practice", опубликованной American Oil Chemists's Society в "Edible fats and Oils processing: basic principals and modern practices: World conference proceedings" / edited by David Erickson, (1990) pages 88-93.

Таблица 1 Относительные степени гидратации
Фосфолипиды	Относительная степень гидратации
Фосфатидилхолин (PC)	100
Фосфатидилинозитол (PI)	44
Кальциевая соль фосфатидилинозитола	24
Фосфатидилэтаноламин (PE)	16
Фосфатидная кислота (PA)	8,5
Кальциевая соль фосфатидилэтаноламина	0,9
Кальциевая соль фосфатидной кислоты	0,6

Соли фосфолипидов с кальцием, магнием и железом образуются ферментом, присутствующим в масличных семенах, фосфолипазой D (PLD). Фермент остается бездействующим в зрелом семени до тех пор, пока не повреждается защитное покрытие семени в ходе хранения или "подготовки" семян перед извлечением масла. Реакция PLD в семени приводит к отщеплению -холина, -инозитола, -серина или -этаноламина от фосфатной группы с образованием Фосфатидной кислоты (PA). Кроме того, поскольку отщепление происходит в присутствии избытка двухвалентных металлов (Ca, Mg и Fe), образуются NHP. Комплекс фосфатидной кислоты с ионами кальция представлен ниже:

Фосфолипиды обычно измеряют в масле в качестве "содержания фосфора" в миллионных долях. В таблице 2 представлены типичные количества фосфолипидов, присутствующих в основных масличных культурах, и распределение различных функциональных групп в качестве процента фосфолипидов, присутствующих в масле.

Таблица 2 Типичные уровни и распределение фосфолипидов для основных масличных семян

В таблице 3 ниже представлены типичные количества и распределения фосфолипидов для соевых камедей. В таблице 3, "как есть" означает типичную композицию фосфолипидов, удаленных из растительного масла, с удерживаемым маслом (2 молекулы фосфолипидов и 1 молекула масла), дающую содержание нерастворимых в ацетоне веществ, равное 67%. "Нормализованная" означает композицию фосфолипидов без какого-либо присутствующего масла, дающую содержание нерастворимых в ацетоне веществ, равное 100%.

Таблица 3 Типичные количества фосфолипидов и распределения для соевых камедей
	Процент "как есть"	Процент для "нормализованной"
Фосфатидилхолин (PC)	33,9	47,2
Фосфатидилэтаноламин (PE)	14,3	19,9
Фосфатидилсерин (PS)	0,4	0,6
Фосфатидная кислота (PA)	6,4	8,9
Фосфатидилинозитол (PI)	16,8	23,4
Всего	71,8	100,0

Конверсия фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитола и фосфатидной кислоты в их лизо- или фосфо- формы значительно изменяет экономические показатели рафинирования в современном промышленном процессе очистки. Конверсия всех фосфолипидов в их лизо-формы, устраняющая потерю нейтральных масел, соответствует увеличению выхода вплоть до 1,4%, в то время как конверсия всех фосфолипидов в их фосфо-формы соответствует увеличению выхода масла вплоть до 3,0% для неочищенного масла с содержанием фосфора 1000 м.д. на протяжении рафинирования гадратацией.

Фосфолипиды можно частично или полностью удалять из растительных масел несколькими различными известными способами. Наиболее широко используемыми процессами в промышленности является рафинирование гидратацией, рафинирование кислотой, очистка щелочью и ферментативное рафинирование. Иллюстративные способы описаны в патентах США No. 4049686; 4698185; 5239096; 5264367; 5286886; 5532163; 6001640; 6103505; U.S. 6127137; 6143545; 6172248; 6548633; 7494676 и 7226771, и публикациях США no. 2007/0134777, 2005/0059130, 2008/0182322 и 2009/0069587.

Существующие способы не являются достаточными для удаления или реакции негидратируемых фосфолипидов, присутствующих в масле, поскольку NHP не доступны для гидратации или реакции для обеспечения их удаления.

Существует потребность в экономичных и эффективных способах удаления NHP, гидратируемых фосфолипидов и лецитинов (в совокупности известных как "камеди") из растительных масел для получения продукта в виде рафинированного масла или жира, который можно использовать для производства продуктов питания и/или непищевых применений.

Фосфолипазы представляют собой ферменты, которые гидролизуют сложноэфирные связи фосфолипидов. В соответствии с их значением в метаболизме фосфолипидов, эти ферменты широко распространены среди прокариот и эукариот. Фосфолипазы влияют на метаболизм, конструирование и реорганизацию биологических мембран и вовлечены в каскады передачи сигнала. Известно несколько типов фосфолипаз, которые отличаются их специфичностью в зависимости от положения связи, на которую осуществляется воздействие в молекуле фосфолипида.

Ферменты фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC) представляют собой семейство эукариотических внутриклеточных ферментов, которые играют важную роль в процессах передачи сигнала. Катализируемая PI-PLC реакция представляет собой:

1-фосфатидил-1D-миоинозитол 4,5-бифосфат (также называемый PIP₂, фосфатидилинозитолбифосфатом) + H₂O↔1D-миоинозитол 1,4,5-трифосфат (также называемый IP₃, инозитолтрифосфатом) + диацилглицерин.

Семейства ферментов фосфолипазы C (PLC) идентифицированы в бактериях и в эукариотических трипаносомах. Ферменты PLC относятся к семейству гидролаз и фосфодиэстераз. PLC участвуют в метаболизме фосфатидилинозитол-4,5-бифосфата (PIP₂) и каскадах липидной передачи сигнала зависимым от кальция образом. Изоформы PLC могут отличаться их способом активации, уровнями экспрессии, каталитической регуляцией, локализацией в клетке, авидностью связывания с мембранами и распределением в тканях. Все они способны катализировать гидролиз PIP₂ на две важных молекулы вторичных посредников, которые продолжают каскад для изменения клеточных ответов, таких как пролиферация, дифференцировка, апоптоз, ремоделирование цитоскелета, везикулярный транспорт, проводимость ионных каналов, эндокринная функция и нейротрансмиссия. PLC описаны, например, в Carmen G., J. Biol. Chem. 270 (1995) 1871 1-18714, Jianag Y., J. Biol. Chem, 271 (1996) 29528-29532, Waggoner D., J. Biol. Chem. 270 (1995) 19422-19429, Molecular Probes Product Sheet 2001, и Sano et al, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281: 844-851, 2001.

Ферменты фосфолипазы A1 (PLA1) удаляют жирную кислоту в 1 положении с образованием свободной жирной кислоты и 1-лизо-2-ацилфосфолипида. Ферменты фосфолипазы A2 (PLA2) удаляют жирную кислоту во 2 положении с образованием свободной жирной кислоты и 1-ацил-2-лизофосфолипида. Ферменты PLA1 и PLA2 могут быть внутри- или внеклеточными, мембраносвязанными или растворимыми. Внутриклеточная PLA2 встречается практически в каждой клетке млекопитающих. Ферменты фосфолипазы C (PLC) удаляют фосфатную группу с образованием 1,2-диацилглицерина и фосфатного сложного эфира. Ферменты фосфолипазы D (PLD) образуют 1,2-диацилглицерофосфат и основную группу.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем документе предусматриваются полипептиды и полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, имеющие активность фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC) или эквивалентного фермента, и/или активность другой фосфолипазы, включая активность фосфолипазы A, B, C, D, пататина, фосфатазы фосфатидной кислоты (PAP) и/или ацилгидролазы липидов (LAH) или эквивалентного фермента, и способы получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. В одном аспекте в настоящем документе предусматриваются полипептиды, например, ферменты, обладающие активностью фосфолипазы, например, активностью фосфолипазы A, B, D или C, например, активностью фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC). Ферментативная активность полипептидов и пептидов, представленных в настоящем документе, включает (содержит или состоит из) активность фосфолипазы, активность фосфолипазы C или активность фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC), включая гидролиз липидов, реакции ацидолиза (например, замена этерифицированной жирной кислоты свободной кислотой), реакции трансэтерификации (например, обмен жирными кислотами между триацилглицеридами), синтез сложных эфиров, реакции переэтерификации, и активность ацилгидролазы липидов (LAH). В другом аспекте полипептиды, представленные в настоящем документе, используют для синтеза энантиомерно чистых хиральных продуктов. Полипептиды, представленные в настоящем документе, можно использовать в различных фармацевтических, сельскохозяйственных и промышленных контекстах, включая производство косметических средств и нутрицевтиков.

Кроме того, полипептиды, представленные в настоящем документе, можно использовать в пищевой промышленности, пиоварении, добавках для ванн, производстве спирта, синтезе пептидов, энантиоселективности, получении шкур в кожевенной промышленности, обработке отходов и деградации животных отходов, регенерации серебра в фотопромышленности, медицинском обслуживании, обесклеивании шелка, деградации биопленки, конверсии биомассы в этанол, биологической защите, противомикробных средствах и дезинфицирующих средствах, средствах для персонального ухода и косметических средствах, биотехнологических реагентах, в увеличении выхода крахмала в процессе влажного измельчения кукурузы, и в качестве фармацевтических средств, таких как способствующие пищеварению средства и противовоспалительные (антифлогистонные) средства.

В определенных вариантах осуществления в настоящем документе предусматриваются композиции (например, фосфолипаза, фосфолипаза C, фосфатидилинозитол-специфическая фосфолипаза C (PI-PLC)) и способы получения масел с низким содержанием фосфолипидов, например, масел с более низким содержанием фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозитола и/или фосфатидной кислоты. Композицией или способом, предусмотренными в настоящем документе, можно обрабатывать любое масло, например, растительное масло, например, масло канолы, соевое масло или животное масло или жир, например, сало. Любые продукты питания, готовые в пищу продукты, или продукты выпекания, жарки или варки (например, соусы, маринады, приправы, распыляемые масла, маргарины, масла для выпекания, майонез, кулинарные жиры, салатные масла, черпаемые ложкой и наливаемые приправы, и т.п., и продукты, изготовленные с ними) могут содержать растительное масло или животный жир, обработанные композицией или способом, предусмотренными в настоящем документе. Растительные масла, модифицированные в масла с более низким содержанием фосфолипидов, можно применять в любых продуктах питания, годных в пищу продуктах или продуктах выпекания или варки, например, соусах, маринадах, приправах, распыляемых маслах, маргаринах, маслах для выпекания, майонезе, кулинарных жирах, салатных маслах, черпаемых ложкой и наливаемых приправах и т.п. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрены масла, такие как растительные масла, например, масло канолы или соевое масло, и продукты питания или продукты выпекания или варки, включая соусы, маринады, приправы, распыляемые масла, маргарины, масла для выпекания, майонез, кулинарные жиры, салатные масла, черпаемые ложкой и наливаемые приправы и т.п., где масло или продукт питания, продукт выпекания или варки модифицированы с использованием фермента, представленного в настоящем документе. В одном аспекте эти растительные масла, например, масло канолы, касторовое масло, кокосовое масло, кориандровое масло, кукурузное масло, хлопковое масло, масло лесного ореха, конопляное масло, льняное масло, масло пенника лугового, оливковое масло, пальмовое масло, пальмоядровое масло, арахисовое масло, рапсовое масло, рисовое масло, сафлоровое масло, масло сасанквы, соевое масло, подсолнечное масло, таловое масло, масло камелии, различные виды "природных" масел, имеющих измененный состав жирных кислот, полученных с помощью генетически модифицированных организмов (GMO) или традиционной "селекции", такие как высокоолеиновое, низколиноленовое или низконасыщенное масло (высокоолеиновое масло канолы, низколиноленовое соевое масло или высокостеариновые подсолнечные масла), животные жиры (таловый жир, сало, жир масла и куриный жир), рыбий жир (жир тихоокеанской корюшки, жир печени трески, жир хоплостета, жир сардин, жир сельди и жир менхадена), или смеси любых из указанных выше, и продукты питания или продукты выпекания, жарки или варки, содержат масла с более низким содержанием жирных кислот, включая масла с низким содержанием пальмитиновой кислоты, миристиновой кислоты, лауриновой кислоты, стеариновой кислоты, каприловой кислоты (октановая кислота) и т.д., переработанные с использованием композиции или способ, представленных в настоящем документе.

В одном аспекте в настоящем документе предусмотрены полипептиды, например, ферменты и каталитические антитела, обладающие активностью фосфолипазы, например, фосфолипазы C, например, фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC), термостабильными и термоустойчивыми видами ферментативной активности, и специфическими к жирным кислотам или селективными к жирным кислотам видами активности, и видами ферментативной активности, устойчивыми к низким или высоким значениям pH, и полинуклеотиды, кодирующие эти полипептиды, включая векторы, клетки-хозяева, трансгенные растения и не являющихся человеком животных, и способы получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов.

В другом аспекте в настоящем документе предусматриваются выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты (a), кодирующие полипептид, обладающий ферментативной активностью фосфолипазы, например, фосфолипазы C, например, фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC), и

(i) обладающие по меньшей мере приблизительно 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более, или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 5 и кодирующие полипептид, имеющий по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более, или все из аминокислотных изменений (мутаций), состоящих из изменений, описанных в таблице 12, таблице 13, таблице 14 и/или таблице 15, или эквивалентных аминокислотных замен или мутаций, или любую их комбинацию,

и необязательно идентичность последовательностей определяют с помощью анализа с алгоритмом сравнения последовательностей или визуальным исследованием,

и необязательно алгоритм сравнения последовательностей представляет собой алгоритм BLAST версии 2.2.2, где установлены параметры фильтрования: blastall-p blastp-d "nr pataa" -F F, и все другие параметры установлены как параметры по умолчанию;

(ii) кодирующие полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, как указано в SEQ ID NO: 6 и имеющий по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более, или все из аминокислотных изменений (мутаций), состоящих из изменений, описанных в таблице 12, таблице 13, таблице 14 и/или таблице 15, или эквивалентных аминокислотных изменений или замен (мутаций), или любую их комбинацию.

(iii) гибридизующиеся в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 5 и кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более, или все из аминокислотных изменений (мутаций), состоящих из изменений, описанных в таблице 12, таблице 13, таблице 14 и/или таблице 15, или эквивалентных аминокислотных изменений или замен (мутаций), или любую их комбинацию,

где жесткие условия включают стадию промывания, включающую промывание в 0,2X SSC при температуре приблизительно 65°C в течение приблизительно 15 минут;

(iv) представляющие собой нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 или состоящую из них; или

(v) имеющие по меньшей мере приблизительно 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более, или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10;

(b) последовательность нуклеиновой кислоты согласно (a), кодирующая полипептид, имеющий ферментативную активность фосфолипазы, например, фосфолипазы C, например, фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC), но лишенная нативной сигнальной последовательности или аминокислотной последовательности пробелка;

(c) последовательность нуклеиновой кислоты согласно (a) или (b), кодирующая полипептид, обладающий ферментативной активностью фосфолипазы, например, фосфолипазы C, например, фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC), но лишенная нативной промоторной последовательности;

(d) нуклеиновая кислота согласно (c), кроме того, содержащая гетерологичную промоторную последовательность или другую последовательность регуляции транскрипции;

(e) последовательность нуклеиновой кислоты по любому из (a)-(d), кроме того, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологичную аминокислотную последовательность, или, кроме того, содержащую гетерологичную нуклеотидную последовательность;

(f) нуклеиновая кислота согласно (e), где нуклеиновая кислота, кодирующая гетерологичную аминокислотную последовательность, содержит или состоит из последовательности, кодирующей гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность, или метку или эпитоп, или гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит гетерологичную промоторную последовательность;

(g) нуклеиновая кислота согласно (d), (e) или (f), где гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность, содержащую или состоящую из N-концевого и/или C-концевого удлинения для направления в эндоплазматическую сеть (ER) или эндомембрану, или в растительную эндоплазматическую сеть (ER) или эндомембранную систему, или гетерологичная последовательность кодирует участок рестрикции;

(h) нуклеиновая кислота согласно (d), (e) или (f), где гетерологичная промоторная последовательность содержит или состоит из конститутивного или индуцибельного промотора, или специфического для типа клеток промотора или специфического для растения промотора или специфического для бактерий промотора;

(i) нуклеиновая кислота согласно любому из (a)-(h), где активность фосфолипазы, например, фосфолипазы C, например, фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC), является термостабильной;

(j) нуклеиновая кислота согласно любому из (a)-(h), где активность фосфолипазы, например, фосфолипазы C, например, фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC), является термоустойчивой;

(k) последовательность нуклеиновой кислоты, полностью комплементарная нуклеотидной последовательности согласно любому из (a)-(j).

В одном аспекте выделенная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует полипептид или пептид, обладающий активностью фосфолипазы, например, фосфолипазы C, например, фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC), которая является термостабильной. Полипептиды и пептиды, кодируемые нуклеиновыми кислотами, представленными в настоящем документе, или любой полипептид или пептид, представленный в настоящем документе, могут сохранять ферментативную или связывающую активность (например, связывание субстрата) в условиях, включающий диапазон температур от приблизительно -100°C до приблизительно -80°C, от приблизительно -80°C до приблизительно -40°C, от приблизительно -40°C до приблизительно -20°C, от приблизительно -20°C до приблизительно 0°C, от приблизительно 0°C до приблизительно 5°C, от приблизительно 5°C до приблизительно 15°C, от приблизительно 15°C до приблизительно 25°C, от приблизительно 25°C до приблизительно 37°C, от приблизительно 37°C до приблизительно 45°C, от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C, от приблизительно 55°C до приблизительно 70°C, от приблизительно 70°C до приблизительно 75°C, от приблизительно 75°C до приблизительно 85°C, от приблизительно 85°C до приблизительно 90°C, от приблизительно 90°C до приблизительно 95°C, от приблизительно 95°C до приблизительно 100°C, от приблизительно 100°C до приблизительно 105°C, от приблизительно 105°C до приблизительно 110°C, от приблизительно 110°C до приблизительно 120°C, или 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 104°C, 105°C, 106°C, 107°C, 108°C, 109°C, 110°C, 111°C, 112°C, 113°C, 114°C, 115°C или более. В настоящем документе предусмотрены термостабильные полипептиды, которые сохраняют активность фосфолипазы, например, фосфолипазы C, например, фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC), при температуре в диапазонах, описанных выше, при приблизительно pH 3,0, приблизительно pH 3,5, приблизительно pH 4,0, приблизительно pH 4,5, приблизительно pH 5,0, приблизительно pH 5,5, приблизительно pH 6,0, приблизительно pH 6,5, приблизительно pH 7,0, приблизительно pH 7,5, приблизительно pH 8,0, приблизительно pH 8,5, приблизительно pH 9,0, приблизительно pH 9,5, приблизительно pH 10,0, приблизительно pH 10,5, приблизительно pH 11,0, приблизительно pH 11,5, приблизительно pH 12,0 или более.

В одном аспекте полипептиды, представленные в настоящем документе, могут быть термоустойчивыми и могут сохранять активность фосфолипазы, например, фосфолипазы C, например, фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC) после воздействия температуры в диапазоне от приблизительно -100°C до приблизительно -80°C, от приблизительно -80°C до приблизительно -40°C, от приблизительно -40°C до приблизительно -20°C, от приблизительно -20°C до приблизительно 0°C, от приблизительно 0°C до приблизительно 5°C, от приблизительно 5°C до приблизительно 15°C, от приблизительно 15°C до приблизительно 25°C, от приблизительно 25°C до приблизительно 37°C, от приблизительно 37°C до приблизительно 45°C, от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C, от приблизительно 55°C до приблизительно 70°C, от приблизительно 70°C до приблизительно 75°C, от приблизительно 75°C до приблизительно 85°C, от приблизительно 85°C до приблизительно 90°C, от приблизительно 90°C до приблизительно 95°C, от приблизительно 95°C до приблизительно 100°C, от приблизительно 100°C до приблизительно 105°C, от приблизительно 105°C до приблизительно 110°C, от приблизительно 110°C до приблизительно 120°C, или 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 104°C, 105°C, 106°C, 107°C, 108°C, 109°C, 110°C, 111°C, 112°C, 113°C, 114°C, 115°C или более.

В некоторых вариантах осуществления термоустойчивые полипептиды сохраняют активность фосфолипазы, например, фосфолипазы C, например, фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC) после воздействия температуры в диапазонах, описанных выше, при приблизительно pH 3,0, приблизительно pH 3,5, приблизительно pH 4,0, приблизительно pH 4,5, приблизительно pH 5,0, приблизительно pH 5,5, приблизительно pH 6,0, приблизительно pH 6,5, приблизительно pH 7,0, приблизительно pH 7,5, приблизительно pH 8,0, приблизительно pH 8,5, приблизительно pH 9,0, приблизительно pH 9,5, приблизительно pH 10,0, приблизительно pH 10,5, приблизительно pH 11,0, приблизительно pH 11,5, приблизительно pH 12,0 или более.

В другом аспекте в настоящем документе предусмотрены зонды нуклеиновой кислоты или праймеры для амплификации для выделения, получения и/или идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фосфолипазы, например, фосфолипазы C, например, фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC). В одном варианте осуществления зонд нуклеиновой кислоты, например, зонд для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фосфолипазы, например, фосфолипазы C, например, фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC), включает зонд, содержащий или состоящий из по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 или более последовательно расположенных оснований последовательности, представленной в настоящем документе, или ее фрагментов или подпоследовательностей, где зонд идентифицирует нуклеиновую кислоту путем связывания или гибридизации. Зонд может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50, приблизительно от 20 до 60, приблизительно от 30 до 70, приблизительно от 40 до 80, или приблизительно от 60 до 100 последовательно расположенных оснований последовательности, содержащей последовательность, представленную в настоящем документе, или ее фрагменты или подпоследовательности. Зонд может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50, приблизительно от 20 до 60, приблизительно от 30 до 70, приблизительно от 40 до 80, или приблизительно от 60 до 100 последовательно расположенных оснований последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем документе, или ее подпоследовательности.

В одном варианте осуществления последовательности пары праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фосфолипазы, например, фосфолипазы C, например, фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC), содержат пару праймеров, содержащую или состоящую из пары праймеров, способной амплифицировать нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, представленную в настоящем документе, или ее фрагменты или подпоследовательности. Один или каждый представитель последовательностей пары праймеров для амплификации может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50 последовательно расположенных оснований последовательности.

В одном варианте осуществления способы амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фосфолипазы, например, фосфолипазы C, например, фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC), включают амплификацию матричной нуклеиновой кислоты с помощью последовательностей пары праймеров для амплификации, способной амплифицировать последовательность нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем документе, или ее фрагменты или подпоследовательности.

В одном варианте осуществления векторы, экспрессирующие кассеты, экспрессирующие векторы, плазмиды, или носители для клонирования содержат нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе, или ее подпоследовательность. В одном аспекте вектор, экспрессирующая кассета, экспрессирующий вектор, плазмида или носитель для клонирования могут содержать или содержатся в вирусном векторе, фаге, фагмиде, космиде, фосмиде, бактериофаге, искусственной хромосоме, аденовирусном векторе, ретровирусном векторе или аденоассоциированном вирусном векторе; или бактериальной искусственной хромосоме (BAC), происходящем из бактериофага PI векторе (PAC), искусственной хромосоме дрожжей (YAC), или искусственной хромосоме млекопитающих (MAC).

В одном аспекте экспрессирующая кассета содержит нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе, которая функционально связана с промотором. Промотор может представлять собой вирусный, бактериальный промотор, промотор млекопитающих или растений. В одном аспекте промотор растений может представлять собой промотор картофеля, риса, кукурузы, пшеницы, табака или ячменя. Промотор может представлять собой конститутивный промотор. Конститутивный промотор может включать CaMV35S. В другом аспекте промотор может представлять собой индуцибельный промотор. В одном аспекте промотор может представлять собой тканеспецифичный промотор или промотор, регулируемый окружающей средой, или промотор, регулируемый в зависимости от стадии развитии. Таким образом, промотор может представлять собой, например, промотор, специфичный для семян, специфичный для листьев, специфичный для корней, специфичный для стебля, или промотор, индуцируемый опаданием листвы. В одном аспекте экспрессирующая кассета может дополнительно содержать экспрессирующий вектор растений или вирусов растений.

В одном варианте осуществления клетка-хозяин или трансформированная клетка содержит нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе. В одном аспекте клетка-хозяин или трансформированная клетка может представлять собой бактериальную клетку, клетку млекопитающего, клетку гриба, дрожжевую клетку, клетку насекомых или клетку растений. В одном аспекте клетка растений может представлять собой клетку картофеля, пшеницы, риса, кукурузы, табака или ячменя. Трансформированная клетка может представлять собой любую из клеток-хозяев, известных специалистам в данной области, включая прокариотические клетки, эукариотические клетки, такие как бактериальные клетки, клетки грибов, клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки насекомых или клетки растений. Иллюстративные клетки бактерий включают клетки любого вида из рода Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Salmonella, Pseudomonas и Staphylococcus, включая, например, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens. Иллюстративные клетки грибов включают клетки любого вида Aspergillus. иллюстративные клетки дрожжей включают клетки любого вида из Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Schwanniomyces, включая Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae или Schizosaccharomyces pombe. Иллюстративные клетки насекомых включают любой вид Spodoptera или Drosophila, включая Drosophila S2 и Spodoptera Sf9. Иллюстративные клетки животных включают клетки CHO, COS или меланомы Bowes или любую клеточную линию мыши или человека.

В другом варианте осуществления трансгенные не являющиеся человеком животные содержат нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе, или вектор, экспрессирующую кассету, экспрессирующий вектор, плазмиду или носитель для клонирования, представленные в настоящем документе. Трансгенным не являющимся человеком животным может быть мышь, крыса, коза, кролик, овца, свинья или корова.

В одном варианте осуществления трансгенное растение или семя содержит нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе, или вектор, экспрессирующую кассету, экспрессирующий вектор, плазмиду или носитель для клонирования, представленные в настоящем документе. В одном варианте осуществления растение представляет собой растение кукурузы, растение сорго, растение картофеля, растение томата, растение пшеницы, масличное растение, растение рапса, растение сои, растение риса, растение ячменя, траву, семя хлопчатника, пальму, растение кунжута, растение арахиса, растение подсолнуха или растение табака; трансгенное семя. В одном варианте осуществления семя представляет собой кукурузное семя, пшеничное зерно, масличное семя, семя рапса, семя сои, ядро кокосового ореха, семя подсолнуха, семя кунжута, рис, ячмень, арахис, семя хлопчатника, семя пальмы, арахис, семя кунжута, семя подсолнуха или семя растения табака.

В одном аспекте в настоящем документе предусмотрены антисмысловой олигонуклеотид или ингибиторная РНК, содержащие нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе или состоящие из них.

В другом аспекте в настоящем документе предусмотрен способ ингибирования трансляции содержащей информацию последовательности фосфолипазы (транскрипт,