Новая о-ацетилгомосерин-сульфгидрилаза или ее мутантный белок и способ преобразования в метионин с использованием таковой

Новая о-ацетилгомосерин-сульфгидрилаза или ее мутантный белок и способ преобразования в метионин с использованием таковой

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к новому белку, обладающему активностью О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, его мутантному белку, полинуклеотиду, кодирующему таковой, рекомбинантному вектору, включающему полинуклеотид, микроорганизму, трансформированному рекомбинантным вектором, и способу для получения метионина или уксусной кислоты с использованием указанного белка.

Предшествующий уровень техники

L-метионин, который является одной из незаменимых аминокислот, in vivo содержится в большинстве белков и присутствует в свободном состоянии в соевом соусе, который является одной из приправ. Его широко используют в пище и пищевых добавках, и также используют в качестве инфузионного раствора для медицинского применения или исходного материала для синтеза лекарственных препаратов. Метионин является важной аминокислотой, вовлеченной in vivo в реакцию переноса метила. Во-первых, при реакции с АТФ метионин преобразуется в δ-аденозилметионин, который затем отдает метильную группу различным акцепторам; и затем преобразуется в цистеин через гомоцистеин и цистатионин. Красная хлебная плесень синтезирует метионин из цистеина. Запах ферментированной пищи, такой как соевый соус или сыр, часто обусловлен альдегидом, спиртом и/или сложным эфиром, полученным из метионина.

Также метионин действует как предшественник соединений, таких как холин, лецитин и креатин, и используется в качестве исходного материала для синтеза цистеина и таурина, и служит в качестве донора серы. Кроме того, метионин ассоциирован с синтезом различных нейротрансмиттеров в головном мозге. Метионин и/или S-аденозил-L-метионин (SAM) in vivo ингибируют накопление жира в печени и артериях и играют различные роли, такие как уменьшение депрессии, воспаления, заболеваний печени, и боли в мышцах. Более того, метионин и/или S-аденозил-L-метионин обеспечивают различные функции, такие как ингибирование отложения жира в печени, что запускает метаболизм жира, и артериях, увеличивая циркуляцию кровотока в головном мозге, сердце и почках, стимулируют пищеварение, обеспечивая детоксикацию и экскрецию токсических веществ, и обеспечивают экскреции тяжелых металлов, таких как тетраэтилсвинец. Сообщают, что ежедневное потребление 800-1600 мг метионина дает превосходный антидепрессантный эффект, улучшение функции печени у пациентов с заболеваниями печени, особенно заболеваниями печени, вызванными алкоголем, превосходный противовоспалительный эффект при заболеваниях суставов костей, и стимуляцию восстановления суставов у них же. Также известно, что в качестве незаменимого питательного вещества для волос, метионин обеспечивает питание ломким волосам, предотвращая потерю волос.

Для химического синтеза метионина наиболее часто L-метионин получают посредством гидролиза 5-(β-метилмеркаптоэтил)гидантоина. Однако когда метионин получают путем такого синтетического процесса, существует недостаток получения смешанных форм L-типа и D-типа. В этом отношении существует патент, описывающий методику, которая позволяет селективно получать L-метионин с использованием биологического подхода (WO2008/013432). Указанный метод, называемый просто двухстадийным методом, включает процесс получения предшественника L-метионина путем ферментации и способ преобразования предшественника L-метионина в L-метионин с использованием ферментов. Тип предшественника L-метионина предпочтительно включает О-ацетилгомосерин и О-сукцинилгомосерин. Разработка двухстадийного метода решает все существующие проблемы, такие как токсичность и субстратная специфичность к сульфиду, регуляция штамма метионином и SAM с обратной связью и разложение промежуточного продукта, специфичного для цистатионин гамма-синтазы, О-сукцинилгомосерин-сульфгидрилазы и О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы. Более того, указанный способ, который дает селективно только L-метионин, превосходит обычные процессы химического синтеза, которые дают и D-метионин и L-метионин одновременно, и указанный способ может дополнительно давать органическую кислоту, точнее, янтарную кислоту и уксусную кислоту, в качестве побочного продукта той же реакции.

Процесс ферментативного превращения в двухстадийном методе использует ферменты, обладающие активностью цистатионин гамма-синтазы, активностью О-сукцинилгомосерин-сульфгидрилазы или О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, и дает L-метионин и органические кислоты вследствие ферментативных реакций О-ацетилгомосерина или О-сукцинилгомосерина, которые являются предшественниками L-метионина, с метилмеркаптаном.

В реакции ферментативного превращения для получения L-метионина из О-ацетилгомосерина, который является предшественником L-метионина, могут быть использованы различные О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы микробного происхождения. Однако с целью использования в качестве промышленной конвертазы фермент должен соответствовать нескольким требованиям для максимального повышения экономической эффективности. Во-первых, фермент должен обладать характеристиками высокой активности и высокой скорости превращения, и его повышенная экспрессия должна быть возможна в E. coli. В общем, для реакций, которые используют очищенный фермент, необходимыми являются активность фермента, скорость реакции и высокая афинность к субстрату. Но, если гомогенат фермента добавляют непосредственно в реакционную смесь, в добавление к наличию высокой активности должна быть возможна повышенная экспрессия фермента в каждой клетке, с целью запуска реакции минимальным количеством гомогената. Во-вторых, фермент должен поддерживать высокую скорость реакции с О-ацетилгомосерином в высокой концентрации и ингибирование его активности должно быть низким даже при накоплении конечных продуктов L-метионина и уксусной кислоты до высокой концентрации. Наконец, фермент должен обладать термической стабильностью для поддержания его активности в течение 1-5 часовой реакции. Рассматривая вышеуказанные требования, ранее описанная О-ацетилгомосерин-сульфгидрилаза, полученная от Hyphomonas neptunium, является превосходным ферментом, однако с целью максимального увеличения коммерческой ценности двухстадийного метода для получения метионина, необходимым является поиск фермента с усилением трех характеристик.

ОПИСАНИЕ

Техническая проблема

Авторы настоящего изобретения получили гены О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы из различных микробных источников и окончательно посредством экспериментов выбрали ген О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы от Rhodobacter sphaeroides. Затем после использования фермента в реакции превращения авторы изобретения обнаружили, что О-ацетилгомосерин-сульфгидрилаза от Rhodobacter sphaeroides является экономически конкурентной конвертазой для применения в двухстадийном методе для получения метионина, и также подтвердили, что экономическая конкурентоспособность конвертазы может быть усилена путем улучшения фермента при помощи внесения мутаций, посредством чего осуществили настоящее изобретение.

Техническое решение

Одной задачей настоящего изобретения является обеспечение нового белка, обладающего активностью О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение полинуклеотида, кодирующего новый белок.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение мутантного белка, обладающего улучшенной активностью О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение полинуклеотида, кодирующего мутантный белок.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение рекомбинантного вектора, включающего полинуклеотид.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение микроорганизма, трансформированного рекомбинантным вектором.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение метода для получения метионина или уксусной кислоты из предшественников О-ацетилгомосерина и метилмеркаптана с использованием белка или микроорганизма, продуцирующего таковой.

Преимущественные эффекты

Настоящее изобретение обеспечивает белок, обладающий активностью О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, полученный от Rhodobacter sphaeroides, который требуется для получения L-метионина и уксусной кислоты из субстрата метилмеркаптана (CH₃SH). Если используют белок, он имеет экономические преимущества получения L-метионина и уксусной кислоты, обладая более высокой скоростью превращения и меньшим временем реакции по сравнению с существующими методами, которые используют белок, обладающий активностью О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, от Hyphomonas neptunium. Кроме того, если используют мутантный белок с улучшенной активностью О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы по настоящему изобретению, это может минимизировать количество добавляемого гомогената фермента, таким образом, легко давая L-метионин и уксусную кислоту с высоким выходом.

Описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой схематическую диаграмму вектора pCL-P_CJ1-MetZhne.

Фиг. 2а и 2b показывают результаты ВЭЖХ, демонстрирующие продукцию метионина. Во-первых, 5-10% гомогената микроорганизмов (общего реакционного объема), включающие белок, добавляли к ферментационному бульону О-ацетилгомосерина, и реакцию начинали путем добавления 15% Na-метилмеркаптана при рН 6-8. Через 2 часа собирали ферментационный бульон, и затем из него удаляли клетки для анализа продукции метионина.

На фиг. 3 показано сравнение уровня экспрессии конвертазы в 2,5 мкл, 5 мкл, 10 мкл клеточного гомогената О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы от вида hyphomonas (MetZ-hne) и О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы от вида rhodobacter (MetZ-rsp).

На фиг. 4 продемонстрированы изменения рН во время реакции превращения в 30 л периодическом реакторе.

На фиг. 5 показаны изменения концентрации О-ацетилгомосерина (OAHS) и L-метионина (Met) в течение реакции превращения в 30 литровом периодическом реакторе, соотношение метилмеркаптана (MeSH), добавленного в каждый момент времени, устанавливая общее требуемое количество метилмеркаптана как 100%, и скорость превращения метионина в каждый момент времени. Скорость превращения метионина представляет собой (г/г)%, рассчитанная путем деления общего количества метионина, образующегося в каждый момент времени, на общее количество добавленного О-ацетилгомосерина (*скорость превращения метионина, 92,59% = скорость превращения метионина в моль, 100%).

Наилучший способ осуществления

В качестве одного аспекта настоящее изобретение обеспечивает новый белок, обладающий активностью О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы.

В настоящем изобретении белок, обладающий активностью О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, относится к новому белку, способному синтезировать L-метионин с использованием О-ацетилгомосерина, который является предшественником L-метионина, и метилмеркаптана. Новый белок предпочтительно представляет собой белок, обладающий активностью О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, от Rhodobacter sphaeroides. Для целей настоящего изобретения новый белок включает любой белок, обладающий активностью О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, без ограничения, но предпочтительно он может быть белком SEQ ID No.13.

Как используется в настоящем описании термин «О-ацетилгомосерин» представляет собой вещество с молекулярной массой 161,16 и является первым специфическим промежуточным продуктом биосинтеза метионина в микроорганизмах. В кишечных бактериях в качестве промежуточного продукта используется О-сукцинилгомосерин вместо О-ацетилгомосерина, и у высших растений в качестве промежуточного продукта используется О-фосфогомосерин. О-ацетилгомосерин образуется из L-гомосерина и ацетил-СоА путем катализа гомосерин-ацетилтрансферазой в бифуркации с биосинтезом треонина.

В патентной публикации WO2008/013432 описан процесс получения L-метионина с использованием двухстадийного метода и в указанном процессе О-сукцинилгомосерин и О-ацетилгомосерин представляют собой два типа О-ацилгомосерина, который является предшественником, используемым для получения L-метионина.

Как используется в настоящем описании термин «предшественник» относится к веществу, получаемому на стадии, предшествующей конечному продукту, в метаболизме или биосинтетической реакции. Для целей настоящего изобретения предшественник относится к метаболиту, продуцируемому штаммом, продуцирующим предшественник L-метионина, как часть метионин-специфического метаболического пути, или его производных. Специфически предшественник L-метионина по настоящему изобретению относится к О-сукцинилгомосерину или О-ацетилгомосерину.

Ферменты, способные продуцировать метионин из О-сукцинилгомосерина среди предшественников L-метионина посредством ферментативного превращения, включают цистатионин гамма-синтазу и О-сукцинилгомосерин-сульфгидрилазу. В общем, ген, кодирующий цистатионин гамма-синтазу, обычно обозначают как metB, и ген, кодирующий О-сукцинилгомосерин-сульфгидрилазу, обычно обозначают как metZ. Указанные ферменты обладают следующими тремя действиями.

L-цистеин + О-сукцинилгомосерин => янтарная кислота + цистатионин

Сульфид (HS-) + О-сукцинилгомосерин => янтарная кислота + гомоцистеин

Метилмеркаптан + О-сукцинилгомосерин => янтарная кислота + L-метионин

О-ацетилгомосерин-сульфгидрилаза представляет собой фермент, способный продуцировать L-метионин с использованием О-ацетилгомосерина, который является другим предшественником L-метионина. В общем, ген, кодирующий О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазу, обычно обозначают как metY. Указанный фермент обладает следующими тремя активностями.

L-цистеин + О-ацетилгомосерин => уксусная кислота + цистатионин

Сульфид (HS-) + О-ацетилгомосерин => уксусная кислота гомосерин

Метилмеркаптан + О-ацетилгомосерин => уксусная кислота + L-метионин

Использование О-ацетилгомосерина, который для получения двух предшественников L-метионина требует меньше источников углерода, таких как глюкоза и сырые сахара, является наиболее экономически эффективным в продукции L-метионина. Однако, тогда как фермент MetZ, который является О-сукцинилгомосерин-сульфгидрилазой, не получает обратного ингибирования своим конечным продуктом L-метионином, фермент MetY, который является О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазой, ингибируется своим продуктом L-метионином и, следовательно, MetY трудно использовать в ферментативной реакции.

В одном примере настоящего изобретения посредством тестирования различных генов metZ в отношении их активности, был идентифицирован ген metZ, полученный от Rhodobacter sphaeroides, обладающий активностью О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, хотя ранее ожидали, что он является О-сукцинилгомосерин-сульфгидрилазой. Более того, было подтверждено, что metZ, полученный от Rhodobacter sphaeroides, не получает обратного ингибирования L-метионином. Выбранный белок, обладающий активностью О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, может иметь последовательность аминокислот SEQ ID No. 13.

В одном примере настоящего изобретения субстратную специфичность, уровень экспрессии конвертазы, и активность конвертазы сравнивали между белком, обладающим активностью О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, полученным от вида Hyphomonas, и О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазой, полученной от вида Rhodobacter. В результате было обнаружено, что когда L-метионин получают с использованием мутантного белка О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, полученного от вида Rhodobacter, мутантный белок проявляет более высокую субстратную специфичность в отношении О-ацетилгомосерина, чем О-сукцинилгомосерина (таблица 1), и также демонстрирует улучшенную ферментативную активность во время ранней фазы реакции, улучшенную скорость реакции и скорость превращения L-метионина (таблица 2). Кроме того, когда уровень ингибирования конечными продуктами сравнивали между рекомбинантными мутантными белками, полученными от двух штаммов, О-ацетилгомосерин-сульфгидрилаза, полученная от вида Rhodobacter, сохраняла высокую активность в продукции L-метионина даже с обратным ингибированием его конечным продуктом (таблица 3). Более того, когда сравнивали термическую стабильность фермента относительно температуры реакции, мутантный белок О-ацетилгомосерин-сульфгидрилаза, полученная от вида Rhodobacter, показала лучшую термическую стабильность по сравнению с мутантным белком О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазой, полученной от вида Hyphomonas (таблица 4).

Следовательно, белок по настоящему изобретению, обладающий активностью О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, удовлетворяет всем требованиям для использования в качестве промышленной конвертазы, включая высокую активность, высокую скорость превращения, повышенную экспрессию в E. coli, низкое ингибирование ферментативной активности конечным продуктом и способность поддержания термической стабильности в момент накопления конечного продукта, и следовательно, путем использования фермента по настоящему изобретению, L-метионин и уксусная кислота могут быть получены с высокой скоростью и высокой эффективностью.

В качестве другого аспекта настоящее изобретение обеспечивает мутантный белок, обладающий усиленной активностью О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы по сравнению с диким типом.

Как используется в настоящем описании термин «мутация» или «мутантный белок» относится к культуре или индивиду, демонстрирующим единственное стабильное генетическое или негенетическое фенотипическое изменение. В настоящем изобретении мутантный белок предпочтительно относится к белку, чья активность увеличивается по сравнению с диким типом из-за мутации в одном или более генах, кодирующих О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазу, полученных от Rhodobacter sphaeroides. Последовательность мутантного белка может включать последовательность белка, имеющего гомологию, по меньшей мере, с 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% последовательности дикого типа. Предпочтительно, белком может быть мутантный белок, обладающий усиленной активностью О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы вследствие мутации, где 3-я аминокислота с N-конца белка, представленного последовательностью аминокислот SEQ ID No.13, заменена аминокислотой, иной, чем изолейцин, 65-я аминокислота с того же конца заменена аминокислотой, иной, чем фенилаланин, и 104-я аминокислота с того же конца заменена аминокислотой иной, чем валин, или имеет место комбинация одного или более из трех типов мутаций аминокислот. Более предпочтительно могут быть скомбинированы две или более или даже более предпочтительно, три вида мутаций. Еще более предпочтительно белком может быть мутантный белок, где 3-я аминокислота с N-конца, изолейцин, заменена аспарагином, и 65-я аминокислота, фенилаланин, заменена тирозином, и 104-я аминокислот, валин, заменена аланином. Последовательностью аминокислот мутантного белка может быть предпочтительно мутантный белок, имеющий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 15, 16, 17 или 18.

Специфически мутантный белок, представленный последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 15, представляет собой вариант белка, представленный последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 13, где 3-я аминокислота с N-конца, изолейцин, заменена аспарагином.

Мутантный белок, представленный последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 16, имеет замену фенилаланина, который является 65-й аминокислотой с N-конца белка, представленного последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 13, тирозином.

Мутантный белок, представленный последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 17, имеет замену валина, который является 104-й аминокислотой с N-конца белка, представленного последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 13, аланином.

Кроме того, мутантный белок, представленный последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 18, имеет замену изолейцина, который является 3-й аминокислотой с N-конца белка, представленного последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 13, аспарагином, замену фенилаланина, 65-й аминокислоты, тирозином, и замену валина, 104-й аминокислоты, аланином.

В одном примере настоящего изобретения на основании вышеуказанных открытий создавали четыре мутантных белка, такие как I3N, F65Y, V104A и E182G с улучшенной ферментативной активностью мутантного белка О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы от вида Rhodobacter. Затем три значимых мутантных белка, такие как I3N, F65Y и V104A, выбирали путем оценки активности мутантных белков (таблица 9). Вектор, включающий комбинацию трех значимых мутантных белков, получали и переносили в E. coli. После измерения активности каждого мутантного белка было обнаружено, что мутантные белки имели в 1,75 раз повышенную активность, чем таковая дикого типа О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы (таблица 10).

В качестве другого аспекта настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотид, кодирующий новый белок, обладающий активностью О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, или мутантный белок, обладающий усиленной активностью О-ацетилгомосерин сульфгидрилазы, по сравнению с диким типом.

Как используется в настоящем описании термин «полинуклеотид» относится к полимеру нуклеотидов, имеющему мономеры нуклеотидов, связанные в длинную цепь ковалентными связями, и обычно он обозначает цепь деоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или рибонуклеиновой кислоты (РНК), более длинную, чем определенная длина. Для целей настоящего изобретения полинуклеотидом может быть фрагмент полинуклеотида, кодирующий белок. Указанный фрагмент полинуклеотида включает фрагменты полинуклеотида, имеющие гомологию, по меньшей мере, с 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% последовательности фрагмента полинуклеотида, обладающего активностью О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы.

Предпочтительно, полинуклеотидом может быть полинуклеотид, представленный последовательностью нуклеотидов SEQ ID NO: 14. Полинуклеотид, представленный последовательностью полинуклеотидов SEQ ID NO: 14, представляет собой полинуклеотид, кодирующий белок дикого типа, имеющий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 13.

Кроме того, полинуклеотид, кодирующий мутантный белок, может иметь последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 19, 20, 21 или 22. Полинуклеотиды, имеющие последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 19, 20, 21 и 22, представляют собой полинуклеотиды, кодирующие белки, имеющие последовательности аминокислот SEQ ID NO: 15, 16, 17 и 18 соответственно.

Как используется в настоящем описании термин «гомология» относится к проценту идентичности между двумя полинуклеотидными компонентами. Соответствие последовательности одного компонента другому может быть определено известной методикой в области техники. Например, гомология может быть определена путем выравнивания последовательности двух молекул полинуклеотидов непосредственно с использованием компьютерной программы, которая является легко доступной и способной выравнивать последовательности. Кроме того, гомологию можно определить путем гибридизации полинуклеотидов в условиях образования стабильной двойной цепи в гомологичных участках и переваривания гибридизованного штамма нуклеазой, специфичной к одиночной цепи, для определения размера переваренного фрагмента.

Как используется в настоящем описании, термин «гомологичный» относится к корреляции между белками, где все грамматические формы и варианты произношения включают белки суперсемейства (например, суперсемейства иммуноглобулинов) и гомологичные белки других видов (например, легких цепей миозина и др.), имеющие «общее эволюционное происхождение». Такие белки (и кодирующие их гены) имеют гомологию последовательности, отражающую высокую степень сходства последовательности. Однако, в общем применении и в настоящем изобретении, когда термин «гомогенез» модифицируется прилагательным, таким как «очень высокий», он относится к сходству последовательности, но не к общему эволюционному происхождению.

Как используется в настоящем описании термин «сходство последовательности» относится к степени идентичности или гомологии между последовательностями нуклеотидов или последовательностями аминокислот белков, которые могут разделять, или не разделять общее эволюционное происхождение. В одном специфическом примере, когда полипептидное соответствие между двумя последовательностями аминокислот составляет, по меньшей мере, 21% для фиксированной длины последовательности аминокислот (предпочтительно, по меньшей мере, около 50% и наиболее предпочтительно около 75%, 90%, 95%, 96%, 97% или 99%), такие две последовательности являются «по существу гомологичными» или «по существу сходными». По существу гомологичные последовательности могут быть идентифицированы путем сравнения последовательностей с использованием стандартного программного обеспечения, используемого в банке данных или, например, путем проведения эксперимента Саузерн гибридизации в строгих условиях, определенных для конкретных систем. Определенные условия, подходящие для гибридизации, находятся в рамках обычной методики в области техники (например, Sambrook et al., 1989, см ниже).

В качестве другого аспекта настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантный вектор, включающий полинуклеотид, кодирующий О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазу дикого типа или ее мутантный белок.

Как используется в настоящем описании термин «вектор» относится к любому носителю для клонирования и/или переноса нуклеотидов в клетку-хозяин. Вектором может быть репликон для возможности репликации фрагментов, комбинированных с другими фрагментами ДНК. «Репликон» относится к любой генетической единице, действующей как самореплицирующая единица для репликации ДНК in vivo, то есть, реплицирующейся посредством саморегуляции (например, плазмида, фаг, космида, хромосома и вирус). Вектор может включать вирусный и невирусный носитель для внесения нуклеотидов в клетку-хозяин in vitro, ex vivo или in vivo, и также может включать мини-сферическую ДНК. Например, вектором может быть плазмида без бактериальной последовательности ДНК. Удаление последовательности бактериальной ДНК, которая является обогащенной в области CpG, проводили для уменьшения отключения трансгенной экспрессии и для обеспечения более непрерывной экспрессии плазмидной ДНК из вектора (Ehrhardt A. Et al. (2003) Hum Gene Ther 10: 215-35; Yet, N.S. (2002) Mol Ther 5: 31-38; Chen, Z.Y. et al. (2004) Gene Ther 11: 856-64). Кроме того, вектор может включать транспозон, такой как Спящая красавица (Izsvzk et al. J. Mol. Biol. 302:93-102 (2000)), или искусственную хромосому. Предпочтительно могут быть использованы векторы, такие как pACYC177, pACYC184, pCL1920, pECCG117, pUC19, pBR322 и pMW118 и более предпочтительно pCL-P_CJ1, который является вектором pCL1920, с вставленным промотором CJ1 (KR20060068505).

В настоящем изобретении полинуклеотид может быть эффективно связан с рекомбинантным вектором. Термин «эффективно связанный» относится к эффективной связи регуляторной последовательности экспрессии нуклеотида с последовательностью нуклеотидов, кодирующей целевой белок, для осуществления его общей функции, таким образом влияя на экспрессию кодирующей последовательности нуклеотидов. Эффективное связывание с рекомбинантным вектором может быть осуществлено с использованием методики рекомбинантных генов, известной в области техники, и сайт-специфическое отщепление и связывание ДНК может быть произведено с использованием рестриктазы и лигазы, известных в области техники.

Кроме того, рекомбинантный вектор может дополнительно включать один или более генов устойчивости к антибиотикам, выбираемых из группы, состоящей из генов устойчивости к ампициллину, генов устойчивости к канамицину и генов хлорамфеникол ацетилтрансферазы.

Как используется в настоящем описании термин «ген устойчивости к антибиотикам» относится к гену, обладающему устойчивостью к антибиотикам, и клетки, включающие такие гены, выживают даже в окружении, обрабатываемом соответствующим антибиотиком. Следовательно, ген устойчивости к антибиотикам эффективно используется в качестве маркера селекции для масштабной продукции плазмид в E.coli. В настоящем изобретении, поскольку гены устойчивости к антибиотикам не являются фактором, который существенно влияет на эффективность экспрессии, которую получают оптимальной комбинацией компонентов вектора, которая является ключевой характеристикой настоящего изобретения, любой обычный ген устойчивости к антибиотикам без ограничения может быть использован в качестве маркера селекции. Специфически могут быть использованы гены устойчивости к ампицилину, тетрациклину, канамицину, хлорамфениколу, стрептомицину или неомицину и предпочтительно могут быть использованы гены устойчивости к спектиномицину.

В качестве другого аспекта настоящее изобретение обеспечивает микроорганизм, трансформированный рекомбинантным вектором для получения О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы.

Как используется в настоящем описании термин «трансформация» относится к введению генов в клетку хозяин для их экспрессии. Способ трансформации вектора по настоящему изобретению в клетки может включать любой способ для введения нуклеотидов в клетки, и он может быть проведен путем выбора соответствующей стандартной методики, известной в области техники. Могут быть использованы методы, такие как электропорирование, ко-преципитация фосфата кальция, ретровирусная инфекция, микроинъекция, DEAE-декстран и катионные липосомы, но ими не ограничиваются.

Трансформированный ген может быть вставлен в хромосому клетки-хозяина и расположен вне хромосомы, пока он может быть экспрессирован в клетке-хозяине. Кроме того, ген включает ДНК и РНК в качестве полинуклеотида, кодирующего полипептид, и любой ген, который может быть введен и экспрессирован в клетке-хозяине, может быть использован без ограничения. Например, ген может быть введен в клетку-хозяина в форме кассеты экспрессии, которая представляет собой полинуклеотидный конструкт, включающий все элементы, требуемые для самоэкспрессии. Экспрессионная кассета обычно включает промотор, эффективно связанный с геном, сигнал терминирования транскрипции, сайты связывания рибосом, и сигнал терминирования трансляции. Экспрессионная кассета может находиться в форме самореплицирующегося вектора экспрессии. Кроме того, геном может быть таковой, вводимый в клетку хозяина сам по себе или в форме полинуклеотидного конструкта, и эффективно связанный с последовательностями, требуемыми для экспрессии в клетке-хозяине.

Как используется в настоящем описании термин «микроорганизм, трансформированный рекомбинатным вектором», относится к клетке, трансфицированной вектором, включающим ген, кодирующий, по меньшей мере, один целевой белок. В настоящем изобретении, если микроорганизм включает белок дикого типа или мутантный белок, способный продуцировать О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазу посредством трансформации рекомбинантным вектором, может быть использован любой прокариоитический и эукариотический микроорганизм. Например, могут быть использованы микробные штаммы, принадлежащие к Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., Corynebacteria sp., Pseudomonas sp., Leptospira sp., Salmonellar sp., Brevibacteria sp., Hypomononas sp., Chromobacterium sp., и Norcardia sp. или грибы или дрожжи. Предпочтительно могут быть использованы микробные штаммы, принадлежащие к Escherichia sp., Corynebacteria sp., и Leptospira sp., и дрожжи и более предпочтительно микробные штаммы Escherichia sp., и наиболее предпочтительно E. coli.

В качестве другого аспекта настоящее изобретение обеспечивает способ для получения метионина или уксусной кислоты, включающий добавление белка дикого типа, мутантного белка или микроорганизма, продуцирующего таковой, к смеси О-ацетилгомосерина и метилмеркаптана для реакции полученной смеси.

О-ацетилгомосерин относится к очищенной форме О-ацетилгомосерина или ферментационному бульону, содержащему О-ацетилгомосерин. Также метилмеркаптан относится ко всем следующим формам, сжиженной форме метилмеркаптана натрия (CH₃S-Na), и газообразной или сжиженной форме метилмеркаптана (CH₃SH), а также метилмеркаптану, включающему диметилсульфоксид (DMS), который описан в патентной публикации WO2010/098629. В одном примере настоящего изобретения для реакции превращения L-метионина, 5-10% гомогената микроорганизмов (общего объема реакционной смеси), включающей полипептид, добавляли к ферментационному бульону О-ацетилгомосерина, и реакцию начинали путем добавления 15% Na-метилмеркаптана к смеси при рН 6-8. Затем через 2 часа ферментационный бульон собирали и из него удаляли клетки, которые затем анализировали ВЭЖХ для идентификации продукции метионина. Как показано на фиг. 2b, когда для получения метионина использовали мутантный белок по настоящему изобретению, ферментативная реакция превращения и активность были выше таковой в существующих продуцирующих штаммах. Также было минимизировано ингибирование реакции продуктом реакции, и термическая стабильность мутантного белка была превосходной, таким образом, предполагая, что мутантный белок по настоящему изобретению может быть эффективно использован для промышленных целей.

В качестве другого аспекта настоящее изобретение обеспечивает применение белка в качестве О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы.

Как описано выше, белок по настоящему изобретению может быть белком дикого типа, обладающим активностью О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, полученным от Rhodobacter sphaeroides, и его мутантным белком, и предпочтительно он может быть белком, имеющим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 13 и 15-18. Белок по настоящему изобретению имеет высокую субстратную специфичность в отношении О-ацетилгомосерина, таким образом обладая активностью О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы и ее повышенной активностью, и, следовательно, он может быть использован для получения метионина или уксусной кислоты.

Способ осуществления изобретения

В настоящем описании далее состав и эффект настоящего изобретения описаны более подробно посредством представленных ниже примеров. Однако, указанные примеры являются только иллюстративными для настоящего изобретения, но никак не ограничивают рамки настоящего изобретения.

Пример 1: Получение метионин-конвертазы

1-1. О-ацетилгомосерин-сульфгидрилаза от вида Hyphomonas

Праймеры создавали путем получения последовательности гена О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы от Hyphomonas neptunium, который конвертирует О-ацетилгомосерин в метионин, с интернет сайта KEGG (www.kegg.com). Хромосомы Hyphomonas neptunium покупали у АТСС (USA). ПЦР реакцию проводили с 30 циклами стадии денатурации при 94°С в течение 30 секунд, стадии обжига при 55°С в течение 30 секунд, и стадии удлинения при 72°С в течение 2 минут, с использованием хромосомы в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 1 и 2. Для реакции ПЦР использовали премикс набор HL PCR (Boineer, Korea).

ДНК фрагменты, полученные реакцией ПЦР, отщепляли Ncol/HindIII и клонировали в векторе pCL-P_CJ1, расщепляемом теми же ферментами. Окончательно полученный вектор называли pCL- P_CJ1-MetZhne и его схематическая диаграмма показана на фиг. 1. Клонированные векторы трансформировали в клетки Escherichia coli K12 и культивировали в планшете со средой LB с добавлением 50 мкг/л спектиномицина, и выбирали колонию. Выбранную колонию инокулировали в 3 мл LB среды, содержащей 50 мкг/л спектиномицина, и культивировали при 37°С, 200 об/мин в течение 16 часов. Культуру клеток повторно инокулировали в 25 мл новой жидкой среды LB (в 250 мл колбе) и культивировали до того как ОП ₆₀₀ достигнет 0,5-0,6 (в течение 2-3 часов) в тех же условиях культивирования, и непосредственно после этого ее культивировали в 500 мл LB среды (в 1 л баке) с добавлением 4% глюкозы до исчерпывания глюкозы. 1 мл ферментационной культуральной среды собирали, надосадочную жидкость удаляли центрифугированием и осадок клеток промывали 0,1 М буфером фосфата калия (рН 7,5). Клетки ресуспендировали в 1 мл буфера фосфата калия и измельчали пять раз с 30 секундными интервалами с использованием ультразвука. Измельченный гомогенат клеток собирали, и общее количество белка оценивали количественно с использованием количественной оценки белка BIO-Rad (BIO-Rad, USA). Кроме того, экспрессию белка подтверждали SDS-PAGE. Впоследствии собранный гомогенат клеток использовали для ферментативной реакции превращения.

1-2. О-ацетилгомосерин-сульфгидрилаза от вида Rhodobacter

Ген metZ, кодирующий О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазу от Rhodobacter sphaeroides, который конвертирует О-ацетилгомосерин в метионин, клонировали в настоящем эксперименте.

ПЦР реакцию проводили с 30 циклами стадии денатурации при 94°С в течение 30 секунд, стадии