Гликозилированные конъюгаты молекул с повторяющимся мотивом

Гликозилированные конъюгаты молекул с повторяющимся мотивом

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к гликозилированным конъюгатам молекул с повторяющимся мотивом (glycosylated repeat-motif-molecule conjugates - GEMOC), которые получают рекомбинантно, и к гликозилированию in vivo, т.е. в типах клеток, экспрессирующих конъюгат молекул с повторяющимся мотивом (repeat-motif-molecule conjugate - ЕМОС), а также к способу получения таких конъюгатов и к их применению.

Предшествующий уровень техники

Разработаны разнообразные молекулы с повторяющимся мотивом, которые отличные от классических молекул связывания антигена, например, от иммуноглобулинов.

Примером молекул с повторяющимся мотивом являются сконструированные белки с повтором анкирина (designed ankyrin repeat protein - DARPin). Белки DARPin могут экспрессироваться в функциональной форме в цитоплазме штаммов Е.coli. Повторяющийся мотив в DARPin включает последовательность из 33 остатков аминокислот. Повторы включают мотив β-витка, за которым следует пара антипараллельных α-спиралей и петля, приводящая к витку следующего повтора. Обычно от 1 до более чем 30 повторяющихся мотивов содержится в молекулах с повторяющимся мотивом анкирина, наиболее части от 4 до 6.

Kohl и др. (Kohl А. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100, cc.1700-1705) разработали модуль из повторов анкирина, основанный на выравнивании примерно 2000 природных повторяющихся последовательностей анкирина. Такая искусственная консенсусная последовательность повторов анкирина включает 27 фиксированных аминокислотных остатков и 6 вариабельных аминокислотных остатков, формирующих сайт связывания (часть сайта) (Forrer Р. и др., ChemBioChem 5, 2004, cc.183-189).

Для получения связывания молекул DARPin с определенной молекулой-мишенью, вариабельные аминокислотные остатки искусственной консенсусной последовательности повторов анкирина рандомизируют и выявляют специфическое связующее путем рибосомального дисплея (см., например, WO 02/020565; Hanes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1997, cc.4937-4942).

В US 2009/0148905 описывают антигенсвязывающие конструкции. Конструкции антитела с коротким консенсусным повтором, производным от фактора комплемента Н, описывают в WO 2008/135237. Конъюгаты антитела с РНКазой описывают в WO 2007/122511. Вирус ньюкаслской болезни (атипичной чумы птиц), включающий рекомбинантную нуклеиновую кислоту, в котором нуклеиновая кислота кодирует связывающий белок, обладающий терапевтическим действием при экспрессии инфицированных вирусом опухолевых клеток, описывают в US 2008/0206201. В US 2008/0248026 описывают способы PTEN/AKT и композиции, относящиеся к BMP. Рекомбинантную экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидной связью описывают в WO 2005/076902 и US 2008/0103098. В WO 2009/068649 описывают антигенсвязывающие конструкции.

Краткое описание изобретения

В настоящем изобретении описывают конъюгаты молекул с повторяющимся мотивом в гликозилированной форме, т.е. экспрессированные в клетках млекопитающих.

Соответственно, первым объектом, заявляемым в настоящем изобретении, является гликозилированный конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом следующей формулы:

(молекула с повторяющимся мотивом - линкер_n)_m - (конъюгируемый партнер)_q - (линкер_o - молекула с повторяющимся мотивом)_p,

в которой n и o независимо друг от друга и независимо от каждой из величин m, и p, и q, означают целые числа 0 или 1, a m и p независимо друг от друга означают целые числа 0, или 1, или 2, или 3, или 4, или 5, или 6, или 7, а q независимо от величин n, m, o и p означает целое число 0 или 1,

и в которой конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом включает по меньшей мере один олигосахарид, присоединенный к сайту гликозилирования,

и в которой по меньшей мере m=q=1 или p=q=1.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекулой с повторяющимся мотивом является молекула с повторяющимся мотивом анкирина или молекула с повторяющимся мотивом, обогащенным лейцином. В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом анкирина имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или ее варианты. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения линкер является пептидным линкером, выбранным из последовательностей SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 25-33. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгируемый партнер является мультимеризируемым конъюгируемый партнером. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мультимеризируемый конъюгируемый партнер выбран из природных или сконструированных пар доменов CH2 и CH3 тяжелой цепи, из природных или сконструированных пар домена CH1 тяжелой цепи и константного домена легкой цепи, из природной или сконструированной шарнирной области тяжелой цепи, из природных или сконструированных последовательностей шарнирной области и доменов CH2 и CH3 тяжелой цепи, из домена лейцинового зиппера, из домена изолейцинового зиппера, из 4-спиральных пучков и из домена тетрамеризации p53 или из их комбинации.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгат по настоящему изобретению отличается тем, что имеет формулу:

((молекула с повторяющимся мотивом - линкер_n)_m - (конъюгируемый партнер)_q - (линкер_o - молекула с повторяющимся мотивом)_p)_r,

в которой

i) n=1, m=1, q=1, p=0, r=1, или

ii) n=1, m=1, q=1, p=0, r=2, или

iii) n=0, m=1, q=1, p=0, r=1, или

iv) n=0, m=1, q=1, p=0, r=2, или

v) m=0, o=1, q=1, p=1, r=1, или

vi)m=0, o=1, q=1, p=1, r=2, или

vii) m=0, o=0, q=1, p=1, r=1, или

viii) m=0, o=0, q=1, p=1, r=2, или

ix) m=1, n=0, o=1, q=1, p=1, r=1, или

x) m=1, n=0, o=1, q=1, p=1, r=2, или

xi) m=1, n=1, o=1, q=1, p=1, r=1, или

xii) m=1, n=1, o=1, q=1, p=1, r=1,

в которой конъюгируемый партнер выбран из природных или сконструированных пар доменов CH2 и CH3 тяжелой цепи, из природных или сконструированных пар домена CH1 тяжелой цепи и константного домена легкой цепи, из природных или сконструированных шарнирных областей тяжелой цепи, из природных или сконструированных последовательностей шарнирной области и доменов CH2 и CH3 тяжелой цепи,

и в которой молекула с повторяющимся мотивом является молекулой с повторяющимся повтором анкирина.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат отличается тем, что по меньшей мере один олигосахарид является смесью олигосахаридов, полученных в результате экспрессии конъюгата в клетках СНО или в клетках НЕК293.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгат отличается тем, что m=0, q=1, p=1, и o=0 или o=1, и r=1 или 2, причем конъюгируемый партнер выбран из конъюгата N-конца последовательности SEQ ID NO: 50, или 51, или 52 и С-конца последовательности SEQ ID NO: 43, или 44, или N-конца последовательности SEQ ID NO: 53, или 54, или 55, и С-конца последовательности SEQ ID NO: 45, или 46, и

и в котором молекула с повторяющимся мотивом является молекулой с повторяющимся повтором анкирина.

Другим объектом, представленным в настоящем изобретении, является гликозилированный конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом, отличающийся включением двух гликозилированных конъюгатов молекула с повторяющимся мотивом согласно описанному в настоящем изобретении.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения гликозилированный конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом представляет два гликозилированных конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом по одному из ранее описанных вариантов осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения гликозилированный конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом дополнительно включает

а) если конъюгируемый партнер молекулы с повторяющимся мотивом выбран из последовательностей SEQ ID NO: 50, 51 и 52, два конъюгата N-концевой последовательности SEQ ID NO: 53 или 54 или 55 и C-концевой последовательности SEQ ID NO: 45 или 46, или

б) если конъюгируемый партнер молекулы с повторяющимся мотивом выбран из последовательностей SEQ ID NO: 53, 54 и 55, два конъюгата N-концевой последовательности SEQ ID NO: 50 или 51 или 52 и C-концевой последовательности SEQ ID NO: 43 или 44.

Другой объект, описанный в настоящем изобретении, представляет нуклеиновую кислоту, включающую следующие элементы:

- предранний энхансер и промотор цитомегаловируса человека,

- 5'-нетранслируемую область гена зародышевой линии антитела,

- сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина,

- последовательность, кодирующую конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом,

- сигнальную последовательность полиаденилирования («поли-A»). Другой объект, пописанный в настоящем изобретении, представляет способ получения гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом согласно описанному в настоящем изобретении, включающий:

- культивирование клеток млекопитающих, включающих нуклеиновую кислоту согласно описанному в настоящем изобретении, в условиях, допускающих экспрессию молекулы с повторяющимся мотивом,

- выделение гликозилированной молекулы с повторяющимся мотивом из клеток или культуральной среды и получения в результате гликозилированной молекулы с повторяющимся мотивом,

- необязательно очистку выделенного гликозилированной молекулы с повторяющимся мотивом.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетки млекопитающих выбраны из клеток СНО и клеток НЕК293.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мультимеризируемый конъюгируемый партнер является сконструированной шарнирной областью тяжелой цепи с тремя остатками цистеина. В другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгируемый партнер включает сконструированную шарнирную областью тяжелой цепи, домен CH2 и домен CH3. В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом является антикалином. В еще одном другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом конъюгирована с N-концом конъюгируемого партнера.

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении описаны гликозилированные конъюгаты молекул с повторяющимся мотивом (glycosylated repeat-motif-molecule conjugates - GEMOC) общей формулы:

(молекула с повторяющимся мотивом - линкер_n)_m - (конъюгируемый партнер)_q - (линкер_o - молекула с повторяющимся мотивом)_p,

в которой n и o независимо друг от друга и независимо от каждой из величин тир означают целые числа 0 или 1, m и p независимо друг от друга означают другие целые числа, а именно 0, или 1, или 2, или 3, или 4, или 5, или 6, или 7, и q независимо означает 0 или 1,

в которой конъюгируемый партнер включает по меньшей мере один сайт гликозилирования и GEMOC экспрессируется в клетках млекопитающих.

Понятие «гликозилированный» или его грамматические эквиваленты означают, что соответствующая молекула с повторяющимся мотивом включает остаток сахарида, ковалентно связанный с аминокислотой каркаса молекулы аминокислоты молекулы с повторяющимся мотивом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом включает по меньшей мере один мотив сайта N- или O-гликозилирования, или природный, или сконструированный мотив (см., SEQ ID NO: 56 и 58). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мотив сайта N-гликозилирования выбран из asp-X-thr, asp-X-ser или asp-X-cys, где Х может быть каким-либо остатком аминокислоты, но не пролином (pro, P). В другом варианте осуществления настоящего изобретения добавляют метку гликозилирования к молекуле с повторяющимся мотивом (см., например, SEQ ID NO: 60, 61, 62 и 63; см., также Meder D. и др., J. Cell Biol. 168, 2005, cc.303-313; Bulbarelli А. и др., J. Cell Sci., 115, 2002, cc.1689-1702). Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгат включает в качестве молекулы с повторяющимся мотивом молекулу последовательности SEQ ID NO: 62 или 63. С применением такой метки гликозилирования, включающей молекулы с повторяющимся мотивом, может быть достигнуто хорошее гликозилирование.

Понятие «клетка млекопитающего» означает клетку, выбранную из клеток СНО, клеток ВНК, клеток НЕК, клеток COS, клеток Per.C6® или клеток гибридом.

Понятие «аминокислота», применяемое в настоящем изобретении, означает группу карбокси-α-аминокислот, которые прямо или в форме предшественников могут кодироваться нуклеиновой кислотой. Отдельные аминокислоты кодируются нуклеиновыми кислотами, состоящими из трех нуклеотидов, так называемых кодонов или триплетов оснований. Каждая аминокислота кодируется по меньшей мере одним кодоном. Это явление называется «вырожденностью генетического кода». Понятие «аминокислоты», применяемое в настоящем изобретении, означает природные карбокси-α-аминокислоты, включающие аланин (трехбуквенный код: ala, обозначение одной буквой: А), аргинин (arg, R), аспарагин (asn, N), аспарагиновую кислоту (asp, D), цистеин (cys, С), глутамин (gln, Q), глутаминовую кислоту (glu, E), глицин (gly, G), гистидин (his, H), изолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, K), метионин (met, M), фенилаланин (phe, F), пролин (pro, P), серии (ser, S), треонин (thr, T), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).

Понятие «антитело» означает молекулу, состоящую из одного или нескольких полипептидов, по существу кодируемых генами антитела. Антитело обычно включает два так называемых полипептида легкой цепи (легкую цепь) и два так называемых полипептида тяжелой цепи (тяжелую цепь). Каждый из полипептидов тяжелой и легкой цепи содержит вариабельный домен (вариабельную область) (обычно амино-концевую часть полипептидной цепи), включающий области связывания, способные взаимодействовать с антигеном. Каждый из полипептидов тяжелой и легкой цепи включает константную область (обычно с карбокси-конца). Константная область тяжелой цепи опосредует связывание антитела i) с клетками, несущими рецептор Fc-гамма (Fc gamma receptor - FcγR), например, клетками фагоцитов, или ii) с клетками, несущими неонатальный рецептор Fc (Fc receptor - FcRn), также называемый рецептором Brambell. Она также опосредует связывание некоторых факторов, включая факторы классической системы комплемента, например, компонент (C1q). Вариабельный домен легкой или тяжелой цепи антитела в свою очередь включает разные сегменты, т.е. четыре каркасных участка (framework region - FR) и три гипервариабельные области (CDR).

Понятие «шарнирная область» означает фрагмент (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения - фрагмент антитела человека) тяжелой цепи антитела полной длины от остатка в положении 216, который в норме является остатком глутаминовой кислоты, до остатка в положении 226, который в норме является остатком цистеина, или до остатка в положении 230, который в норме является остатком пролина. Шарнирная область включает остатки цистеина, которые могут формировать дисульфидные связи с соответствующими остатками цистеина второй шарнирной области, например, второй тяжелой цепи антитела. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения шарнирная область включает два остатка цистеина.

Понятия «второй константный домен тяжелой цепи», «домен CH2» и «CH2», которые могут применяться взаимозаменяемо, означают фрагмент (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения - фрагмент антитела человека) тяжелой цепи антитела полной длины с остатка 231 по остаток 340. Домен CH2 включает остаток 297, который в норме является аминокислотой аспарагином, к которой сахарид ковалентно присоединен к аминокислотному каркасу.

Понятия «третий константный домен тяжелой цепи», «домен CH3» и «CH3», которые могут применяться взаимозаменяемо, означают фрагмент (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения - фрагмент антитела человека) тяжелой цепи антитела полной длины с остатка 341 по остаток 447, т.е. С-конец домена CH2.

Понятие «антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity - ADCC)» означает механизм лизиса клеток, на которые воздействуют неспецифические цитотоксические клетки, имеющие на своей поверхности Fc-рецептор (FcR), например, природных клеток-киллеров (natural killer cells - NK), нейтрофилов и макрофагов. Эти клетки распознают и лизируют клетки со связанным с поверхностью антителом, обладающим частью связывания Fc-рецептора, например, Fc-частью.

Понятие «комплемент-зависимая цитотоксичность (complement dependent cytotoxicity - CDC)» означает механизм лизиса клеток, вызываемый комплементом, который инициируется путем связывания C1q, например, с антителом, связанным с его антигеном.

Понятие «связывание с молекулой-мишенью» означает специфическое взаимодействие между связывающей, т.е. обеспечивающей комплементарность, молекулой и ее связываемым партнером, т.е. специфической молекулой-мишенью. Силу такого специфического взаимодействия выражают в качестве связывающего сродства, представленного в виде величины K_D. Понятие «неспецифическое связывание с молекулой-мишенью» означает неспецифическое взаимодействие между связывающей молекулой и ее молекулами-мишенями с величиной K_D 10^-5 моль/л или больше (например, 10^-3 моль/л), в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения с величиной K_D 10^-6 моль/л или больше. Связывающее сродство определяют с помощью стандартного анализа связывания, например, метода поверхностного плазменного резонанса (BIAcore®). Эта величина связывающего сродства не расценивается в качестве точного значения, это всего лишь контрольная точка. Понятие «специфическое связывание с молекулой-мишенью» означает специфическое взаимодействие между связывающей молекулой и ее молекулой-мишенью с величиной K_D 10^-7 моль/л или меньше (например, 10^-10 моль/л), в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения с величиной K_D 10^-8 моль/л или меньше.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения повторы молекулы с повторяющимся мотивом составляют от 20 до 40 остатков аминокислот в длину. Повторы собраны в отдельные структурные единицы, которые вместе формируют молекулу с повторяющимся мотивом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом выбрана из молекулы с повторяющимся мотивом анкирина и молекулы с повторяющимся мотивом, обогащенным лейцином (leucine-rich-repeat-motif-molecule - LRRP).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгируемый партнер включает иммуноглобулиновый мембранный якорный домен или GPI-якорный домен.

Понятие «молекула с повторяющимся мотивом» означает природный или искусственный полипептид, который может экспрессироваться в виде одной молекулы, т.е. не конъюгировать со второй молекулой или со второй собственной копией, в растворимой форме в цитоплазме или периплазме Е.coli. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом включает по меньшей мере две структурно идентичные единицы (два повтора). Не требуется, чтобы эти единицы были идентичными gj аминокислотной последовательности. Эти единицы могут быть независимо сворачивающимися доменами, но это не является обязательным условием. Молекула с повторяющимся мотивом может, но не обязана, включать другие отрезки последовательности помимо повторяющихся единиц. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом является молекулой с повторяющимся мотивом анкирина. В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом является молекула с повторяющимся мотивом, обогащенным лейцином.

Понятие «молекула с повторяющимся мотивом анкирина» означает искусственный полипептид, включающий от 1 до 30 консенсусных последовательностей, состоящих из 33 аминокислотных остатков. Каждый из повторов включает мотив β-витка, за которым следует пара антипараллельных α-спиралей и петля, приводящая к витку следующего повтора. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом анкирина включает от 1 до 30 повторов, в другом варианте осуществления настоящего изобретения включает от 2 до 10 повторов, и в еще одном варианте осуществления настоящего изобретения включает от 3 до 6 повторов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом анкирина, производив от одной из следующих консенсусных последовательностей путем случайного мутагенеза и отбора по связыванию молекулы-мишени, например, путем рибосомального дисплея, дрожжевого дисплея и фагового дисплея:

DGNT(P,A)LHLA(A,V) ENG(H,N)LE(I,V)VKL L(L,I)EAGA(D,N)INA (SEQ ID NO: 01),

DSDGNTPLHL AAENGQLEVV KLLLEAGADV NAR (SEQ ID NO: 02),

(D,T)KNGLTPLH(L,I) AAQEGHLEVV KLLLENGA(D,N)(V,I) NAK (SEQ ID NO: 03),

DxxGxTPLHL AAxxGHLEIV EVLLK(H,N,Y)GADV NAx (SEQ ID NO: 04),

ADVNAKDKDG YTPLHLAARE GHLEIVEVLL KAG (SEQ ID NO: 05),

DxxGxTPLHLAaxxGpxpaVpxLLpxGADVNAx (SEQ ID NO: 06),

DxxGxTPLHLAxxxGxxxVVxLLLxxGADVNAx (SEQ ID NO: 07),

DxxGxTPLHLAxxxGxxxIVxVLLxxGADVNAx (SEQ ID NO: 08),

D11G1TPLHLAA11GHLEIVEVLLK2GADVNA1 (SEQ ID NO: 09),

в указанных последовательностях «x» обозначает в полной мере вариабельное положение,

аминокислоты, приведенные в скобках, обозначают специфические варианты, возможные в этом положении,

«а» обозначает аминокислоту с неполярной боковой цепью,

«p» обозначает остаток аминокислоты с полярной боковой цепью,

«1» обозначает остаток аминокислоты, выбранный из группы, включающей (выраженные в однобуквенном коде) остатки аминокислот A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Q, R, S, Т, V, W и Y, и

«2» обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, включающей остатки аминокислот Н, N и Y.

Молекулы GEMOC, включающие молекулы с повторяющимся мотивом анкирина, связывающиеся с какой-либо заранее определенной молекулой-мишенью, могут быть получены путем скрининга библиотек, включающих рандомизированные молекулы GEMOC или рандомизированные молекулы с повторяющимся мотивом анкирина, например, с помощью рибосомального дисплея (см., например, WO 02/120565; Hanes J., Plückthun A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1997, cc.4937-4942).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения GEMOC включает N-концевой кэпированный повтор аминокислотной последовательности DLGKKLLE AARAGQDDEVRILMANGADV (SEQ ID NO: 47).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения GEMOC включает C-концевой кэпированный повтор аминокислотной последовательности VNAQDKFGKT AFDISIDNGNEDLAEILQ (SEQ ID NO: 48).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекулой с повторяющимся мотивом является молекула с повторяющимся мотивом, обогащенным лейцином (leucine-rich-repeat-motif-molecule - LRR). Способы получения молекул с повторяющимся мотивом, обогащенным лейцином, описаны в WO 2006/083275.

В целом действие антител выбрано из нейтрализующего действия, нацеливающего действия в отношении токсической части молекулы, или эффекторной функции.

На фиг.1 показана конструкция домена антитела. Антитело полной длины включает две так называемые легкие цепи и две так называемые тяжелые цепи. Каждая из легких цепей в свою очередь включает вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. Константный домен легкой цепи выбран из домена типа каппа и домена типа лямбда. Каждая из тяжелых цепей в свою очередь включает вариабельный домен тяжелой цепи, первый константный домен тяжелой цепи (CH1), шарнирную область, второй константный домен тяжелой цепи (CH2), третий константный домен тяжелой цепи (CH3) и необязательно четвертый константный домен тяжелой цепи (CH4). Кроме того, включает дисульфидные связи антитела полной длины между константным доменом легкой цепи и первым константным доменом тяжелой цепи, а также две дисульфидные связи между вторыми константными доменами тяжелой цепи двух тяжелых цепей.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгируемым партнером в молекуле GEMOC является тяжелая цепь антитела полной длины или легкая цепь антитела полной длины, но каждая без вариабельного домена. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгируемым партнером в GEMOC является тяжелая цепь антитела или легкая цепь антитела, каждая из которых с вариабельным доменом. В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом конъюгирована с С-концом соответствующей цепи антитела непосредственно или через пептидный линкер. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения GEMOC включает две молекулы GEMOC предшествующего варианта осуществления настоящего изобретения.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгируемым партнером является легкая или тяжелая цепь анти-Aβ антитела. Такое анти-Aβ антитело и соответствующие последовательности нуклеиновой кислоты, например, описаны в WO 2003/070760, или US 2005/0169925, или представлены в виде последовательностей SEQ ID NO: 50-55 или их варианта.

Конъюгаты согласно описанному в настоящем изобретении включают различные варианты, содержащие одну или несколько молекул с повторяющимся мотивом, каждая из которых связывается с той же молекулой-мишенью или с другими молекулами-мишенями. В конъюгатах, согласно описанному в настоящем изобретении, с одним концом молекулы без неповторяющегося мотива, т.е. конъюгируемого партнера, независимо от наличия связи с С-концом или с N-концом, ковалентно связана только одна, т.е. единственная молекула с повторяющимся мотивом ковалентно связана.

Первый вариант является конъюгатом, включающим две или несколько молекул с повторяющимся мотивом, каждая из которых связывается с одной и той же или с разными молекулами-мишенями, причем каждая пара молекул с повторяющимся мотивом соединена пептидным линкером. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения число молекул с повторяющимся мотивом выбрано из двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти. На фиг.2 показаны примеры конъюгатов, включающих две или несколько молекул с повторяющимся мотивом, соединенных пептидными линкерами.

Вторым конъюгатом является конъюгат, включающий одну или несколько молекул с повторяющимся мотивом и одну или несколько молекул без повторяющихся мотивов. Каждая из молекул с повторяющимся мотивом связывается с одной и той же или с разными молекулами-мишенями. Молекула без повторяющегося мотива обеспечивает каркас молекулы, с которым одна или несколько молекул с повторяющимся мотивом ковалентно связаны, необязательно и независимо друг от друга через пептидный линкер. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула без повторяющихся мотивов выбрана из домена антитела CL, домена антитела CH1, шарнирной области антитела, домена антитела CH2, домена антитела CH3, домена антитела CH4, мотивов мембранного якоря, трансмембранных доменов, последовательностей метки гликозилирования, последовательностей метки для очистки или обнаружения, или комбинации одного или нескольких из указанных структур, или их природных или сконструированных вариантов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула без повторяющихся мотивов включает два или несколько полипептидов, ковалентно связанных вместе одной или несколькими дисульфидными связями. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула без повторяющихся мотивов является Fc-часть антитела. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекулой без повторяющихся мотивов является димер, состоящий из двух мономеров, каждый из которых включает в направлении от N- к С-концу шарнирную область тяжелой цепи, домен CH2 и домен CH3, или димер, состоящий из двух мономеров, каждый из которых включает в направлении от N- к С-концу домен CH1, шарнирную область тяжелой цепи, домен CH2 и домен CH3, или тетрамер, состоящий из двух мономеров, каждый из которых включает в направлении от N- к С-концу домен CH1, шарнирную область тяжелой цепи, домен CH2 и домен CH3, и два мономера, включающих константный домен легкой цепи. В другом варианте осуществления настоящего изобретения каждый из мономеров независимо друг от друга дополнительно включают вариабельный домен.

Понятие «пептидный линкер» означает линкеры природного и/или синтетического происхождения, включающие аминокислотные остатки, соединенные друг с другом пептидными связями. Они состоят из линейной аминокислотной цепи, в которой 20 природных аминокислот представлены мономерными строительными блоками. Длина цепи составляет от 1 до 50 аминокислотных остатков, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения от 3 до 28 аминокислотных остатков, в другом варианте осуществления настоящего изобретения от 4 до 20 аминокислотных остатков. Линкер может включать повторяющиеся аминокислотные последовательности или последовательности природных полипептидов. Функция линкера заключается в гарантировании того, что складчатость двух компонентов, соединенных через линкер, будет корректной и может быть представлена должным образом из-за стерической и ротационной свободы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения линкером является «синтетический пептидный линкер», который обозначен в качестве обогащенного остатками глицина, глутамина и/или серина. Эти остатки собраны, например, в малые повторяющиеся единицы, содержащие до пяти аминокислот, например, (G)GGGS, (Q)QQQG, или (S)SSSG (SEQ ID NO: 14, 15 и 16). Такие малые повторяющиеся единицы могут быть повторены от двух до пяти раз для формирования мультимерной единицы. Другие синтетические пептидные линкеры составлены из одной аминокислоты, повторенной 10-20 раз, например, серин в линкере GSSSSSSSSSSSSSSSG (SEQ ID NO: 17). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения линкер выбран из [GQ4]3GNN (SEQ ID NO: 18), LSLSPGK (SEQ ID NO: 19), LSPNRGEC (SEQ ID NO: 20), LSLSGG (SEQ ID NO: 21), LSLSPGG (SEQ ID NO: 22), G3[SG4]2SG (SEQ ID NO: 23) или G3[SG4]2SG2 (SEQ ID NO: 24).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения линкер содержит от 4 до 20 аминокислотных остатков. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения между молекулами с повторяющимся мотивом имеется один и тот же линкер, в другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат содержит линкер с двумя или несколькими разными аминокислотными последовательностями. В другом варианте осуществления настоящего изобретения линкер выбран из (G3S), (G3S)2, (G3S)3, (G3S)4, (G3S)5, (G4S), (G4S)2, (G4S)3, (G4S)4, (G4S)5 (SEQ ID NO: 14 и 25-33), предпочтительно из (G4S)3 и (G4S)4 (SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгат согласно описанному в настоящем изобретении включает одну молекулу с повторяющимся мотивом и одну молекулу без повторяющихся мотивов, и необязательно пептидный линкер между этими молекулами. Молекула с повторяющимся мотивом ковалентно связана или с С-концом, или с N-концом одной молекулы без повторяющихся мотивов или с одним из С-концов, или с одним из N-концов полипептидов, формируя молекулу без повторяющихся мотивов.

На фиг.3-5 показаны примеры конъюгатов вариантов осуществления настоящего изобретения второго варианта. На фиг.3 показаны конъюгаты одной молекулы с повторяющимся мотивом с N-концом и С-концом разных отдельных доменов антител. На фиг.4 показаны конъюгаты одной молекулы с повторяющимся мотивом с N-концом и С-концом комбинаций двух, трех или четырех доменов антитела. На фиг.5 показаны конъюгаты одной молекулы с повторяющимся мотивом с N-концом и С-концом связанных дисульфидной связью доменов антител (CL-CH1 или шарнир-шарнир), необязательно эти конъюгаты могут включать дополнительно другие домены антител, за исключением вариабельных доменов.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат согласно описанному в настоящем изобретении включает две молекулы с повторяющимся мотивом и одну молекулу без повторяющихся мотивов, и необязательно до двух пептидных линкеров. Одна молекула с повторяющимся мотивом ковалентно связана с С-концом и одна с N-концом молекулы без повторяющихся мотивов, или обе ковалентно связаны с С-концом или с N-концом полипептидов, формируя молекулу без повторяющихся мотивов, или одна из молекул с повторяющимся мотивом ковалентно связана с С-концом и одна ковалентно связана с N-концом полипептидов, формируя молекулу без повторяющихся мотивов. Указанные С-конец и N-конец являются концами одного полипептида или разных полипептидов. На фиг.6-8 показаны примеры конъюгатов по настоящему изобретению. На фиг.6 две молекулы с повторяющимся мотивом конъюгированы с молекулой без повторяющихся мотивов, содержащей только один С-конец и один N-конец, причем молекула без повторяющихся мотивов может включать один или несколько доменов антител. На фиг.7 и 8 две молекулы с повторяющимся мотивом конъюгированы с молекулой без повторяющихся мотивов, содержащей дисульфидную связь между доменами антитела, необязательно эти конъюгаты могут включать дополнительно другие домены антител, за исключением вариабельных доменов.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат включает четыре молекулы с повторяющимся мотивом и одну молекулу без повторяющихся мотивов и необязательно от одного до четырех пептидных линкеров. В этом варианте осуществления настоящего изобретения молекула без повторяющихся мотивов включает по меньшей мере два полипептида, ковалентно связанные в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения через одну или несколько дисульфидных связей. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекулы с повторяющимся мотивом ковалентно связаны с соответствующим числом С-концов и N-концов молекул без повторяющихся мотивов. В другом варианте осуществления настоящего изобретения две из молекул с повторяющимся мотивом конъюгированы друг с другом, формируя димерные молекулы с повторяющимся мотивом, и димерная молекула с повторяющимся мотивом в свою очередь конъюгирована с молекулой без повторяющихся мотивов. На фиг.9-11 показаны примеры конъюгатов настоящего варианта осуществления изобретения. На фиг.9 четыре молекулы с повторяющимся мотивом конъюгированы с молекулой без повторяющихся мотивов, включая два С-конца и два N-конца, причем молекула без повторяющихся мотивов может включать один или несколько доменов антител. На фиг.10 и 11 четыре молекулы с повторяющимся мотивом конъюгированы с молекулой без повторяющихся мотивов, содержащей связанные дисульфидной связью домены антител, необязательно эти конъюгаты могут включать дополнительно другие домены антител, за исключением вариабельных доменов.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат включает шесть молекул с повторяющимся мотивом и одну молекулу без повторяющихся мотивов и необязательно до шести пептидных линкеров. В этом варианте осуществления настоящего изобретения молекула без повторяющихся мотивов включает по меньшей мере два полипептида, ковалентно связанные, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения через одну или несколько дисульфидных связей. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекулы с повторяющимся мотивом ковалентно связаны с соответствующим числом С-концов и N-концов молекулы без повторяющихся мотивов. В другом варианте осуществления настоящего изобретения четыре молекулы из числа молекул с повторяющимся мотивом конъюгированы друг с другом, формируя димерные молекулы с повторяющимся мотивом, и димерная молекула с повторяющимся мотивом в свою очередь конъюгирована с молекулой без повторяющихся мотивов, и две молекулы без повторяющихся мотивов не конъюгированы друг с другом, но каждая конъюгирована с одним концом молекулы без повторяющихся мотивов. На фиг.12 показан пример конъюгата по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат включает восемь молекул с повторяющимся мотивом и одну молекулу без повторяющихся мотивов и необязательно до восьми пептидных линкеров. В этом варианте осуществления настоящего изобретения молекула без повторяющихся мотивов включает по меньшей мере два полипептида, связанных ковалентно, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения через одну или несколько дисульфидных связей. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекулы с повторяющимся мотивом ковалентно связаны с соответствующим числом С-концов и N-концов молекулы без повторяющихся мотивов. В другом варианте осуществления настоящего изобретения от двух до восьми молекул с повторяющимся мотивом конъюгированы друг с другом, формируя димерные молекулы с повторяющимся мотивом и димерная молекула с повторяющимся мотивом в свою очередь конъюгирована с молекулой без повторяющихся мотивов и оставшееся число молекул с повторяющимся мотивом не конъюгированы друг с другом, но каждая конъюгирована с одним концом молекулы без повторяющихся мотивов.

Молекула с повторяющимся мотивом может быть производной каркаса молекулы, выбранного из группы, включающей C