Способ культивирования одиночной в-клетки

Способ культивирования одиночной в-клетки

Реферат

В данном документе сообщается о способе получения аминокислотной последовательности по меньшей мере вариабельных доменов моноклонального антитела, секретируемого одиночной В-клеткой, которая была получена из популяции В-клеток экспериментального животного путем сохранения одиночной клетки и совместного культивирования с фидерными клетками в присутствии фидерной смеси.

Уровень техники

Для получения клеток, секретирующих моноклональные антитела, широко используется гибридомная технология, разработанная Келером и Мильштейном. Но в гибридомной технологии только часть В-клеток, полученных от иммунизированного экспериментального животного, можно подвергнуть слиянию и размножению. Источником В-клеток, как правило, является орган иммунизированного экспериментального животного, такой как селезенка.

Zubler и соавт. в 1984 году начали разработку другого подхода к получению клеток, секретирующих моноклональные антитела (см., например, Eur. J. Immunol. 14 (1984) 357-63, J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183). В этом подходе из крови иммунизированного экспериментального животного получали В-клетки и совместно культивировали с мышиными фидерными клетками EL-4 B5 в присутствии цитокин-содержащей фидерной смеси. С этой методикой через 10-12 дней совместного культивирования можно получить до 50 нг/мл антитела.

Weitkamp, J-H., et al. (J. Immunol. Meth. 275 (2003) 223-237) сообщают о создании рекомбинантных человеческих моноклональных антител к ротавирусу из отдельных антиген-специфических В-клеток, выбранных с помощью люминесцентных вирусподобных частиц. В патенте США 2006/0051348 сообщается о способе получения множества выделенных антител к множеству родственных антигенов. В патентах WO 2008/144763 и WO 2008/045140 сообщается, соответственно, об антителах к IL-6 и об их применении и способе культивирования для получения клональной популяции антиген-специфических В-клеток. В патенте США 2007/0269868 сообщается о способе культивирования для получения клональной популяции антиген-специфических В-клеток. Masri et al. (в Mol. Immunol. 44 (2007) 2101-2106) сообщают о клонировании и экспрессии в E.coli функционального Fab-фрагмента, полученного из одиночного человеческого лимфоцита против токсина сибирской язвы. В патенте WO 2007/031550 сообщается о способе получения иммуноглобулиновых библиотек.

Сущность изобретения

В данном документе сообщается о способе выделения В-клетки из популяции В-клеток, которая обладает особыми свойствами. Во-первых, уже через четыре недели после первой иммунизации экспериментального животного можно выделить индуцированные клетки, продуцирующие антитела, и определить специфичность связывания антител. Во-вторых, можно увеличить количество и/или качество (например, способность к продукции/секреции антитела) клеток, продуцирующих антитела, любым из следующих этапов: i) этапом предварительной инкубации, и/или ii) этапом центрифугирования, и/или iii) этапом пэннинга («просеивания» анализируемого содержимого через сорбент или субстрат с иммобилизованным лигандом). В-третьих, фидерную смесь, используемую для совместного культивирования В-клеток и фидерных клеток, можно улучшить путем добавления IL-21, или IL-6, или SAC, или BAFF.

Таким образом, в данном документе в качестве аспекта сообщается о способе выбора В-клетки, содержащем следующие этапы:

а) возможно, мечение В-клеток из популяции В-клеток,

б) индивидуальное совместное культивирование каждой В-клетки из популяции В-клеток, которые были сохранены как одиночные клетки, с фидерными клетками,

в) выбор В-клеточного клона, пролиферирующего и секретирующего антитело на этапе б).

В данном документе в качестве аспекта сообщается о способе получения В-клеточного клона, включающем следующие этапы:

а) получение В-клеток от экспериментального животного,

б) мечение В-клеток,

в) сохранение меченых В-клеток как одиночных клеток,

г) индивидуальное совместное культивирование одиночных сохраненных В-клеток с фидерными клетками,

д) выбор В-клеточного клона, пролиферирующего и секретирующего антитело на этапе г), и тем самым получение В-клеточного клона.

В данном документе в качестве другого аспекта сообщается о способе получения антитела, специфически связывающегося с антигеном-мишенью, включающем следующие этапы:

а) возможно, мечение В-клеток из популяции В-клеток по меньшей мере одной флуоресцентной меткой,

б) культивирование каждой В-клетки из популяции В-клеток, которые были сохранены как одиночные клетки в отдельных контейнерах, в присутствии фидерных клеток и фидерной смеси, для получения одиночных В-клеточных клонов и культуральных супернатантов,

в) выбор В-клеточного клона, продуцирующего антитело, специфически связывающееся с антигеном-мишенью,

г) культивирование клетки, которая содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует антитело, специфически связывающееся с антигеном-мишенью, которое продуцируется В-клеточным клоном, выбранным в этапе в), или его гуманизированный вариант, и выделение этого антитела из клетки или культурального супернатанта и тем самым получение антитела.

В одном воплощении способ включает один или более чем один из следующих этапов:

после этапа в): в1) определение нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи антитела путем ПЦР с обратной транскрипцией,

после этапа в1): в2) трансфекция клетки нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи антитела.

В этом документе также в качестве аспекта сообщается о способе получения антитела, включающем следующие этапы:

а) получение популяции (зрелых) В-клеток (полученных из крови экспериментального животного),

б) мечение клеток из популяции В-клеток по меньшей мере одной флуоресцентной меткой (в одном воплощении от одной до трех или двумя-тремя флуоресцентными метками),

в) сохранение одиночных клеток из меченой популяции В-клеток в отдельных контейнерах (в одном воплощении контейнер является лункой в многолуночном планшете),

г) культивирование сохраненных отдельных В-клеток в присутствии фидерных клеток и фидерной смеси (в одном воплощении фидерными клетками являются клетки EL-4 B5, в одном воплощении фидерной смесью является природный TSN, в одном воплощении фидерной смесью является синтетическая фидерная смесь),

д) определение специфичности связывания антител, секретируемых в культивационную среду отдельных В-клеток,

е) определение аминокислотной последовательности вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей специфически связывающих антител путем ПЦР с обратной транскрипцией и путем секвенирования и тем самым получение нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела,

ж) введение нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела, в экспрессионную кассету для экспрессии антитела,

з) введение нуклеиновой кислоты в клетку,

и) культивирование клетки и выделение антитела из клетки или клеточного культурального супернатанта и тем самым получение антитела.

В одном воплощении всех аспектов, о которых сообщается в данном документе, способ включает этап инкубации популяции В-клеток в среде для совместного культивирования перед сохранением одиночной клетки. В одном воплощении инкубация осуществляется при температуре примерно 37°C. В одном воплощении инкубация осуществляется от 0,5 до двух часов. В конкретном воплощении инкубация осуществляется в течение примерно одного часа. В одном воплощении инкубация осуществляется при температуре примерно 37°C в течение примерно одного часа.

В одном воплощении всех аспектов, о которых сообщается в данном документе, способ включает этап центрифугирования одиночной клетки из сохраненных В-клеток перед совместным культивированием. В одном воплощении центрифугирование осуществляется в течение от примерно 1 минуты до примерно 30 минут. В конкретном воплощении центрифугирование осуществляется в течение примерно 5 минут. В одном воплощении является центрифугирование осуществляется со скоростью от примерно 100 g до примерно 1000 g. В конкретном воплощении центрифугирование осуществляется со скоростью примерно 300 g. В одном воплощении центрифугирование осуществляется в течение примерно 5 минут со скоростью примерно 300 g.

В одном воплощении всех аспектов, о которых сообщается в данном документе, способ включает непосредственно перед этапом мечения следующий этап: пэннинг В-клеток с иммобилизованным антигеном.

В одном воплощении всех аспектов, о которых сообщается в данном документе, популяцию В-клетки получают из крови животного с помощью центрифугирования в градиенте плотности.

В одном воплощении всех аспектов, о которых сообщается в данном документе, популяцию В-клеток получают из крови экспериментального животного через 4 дня после иммунизации. В другом воплощении популяцию В-клеток получают из крови экспериментального животного через период от 4 дней до минимум 9 дней после иммунизации. В еще воплощении популяцию В-клеток получают из крови экспериментального животного через 4-9 дней после иммунизации.

В одном воплощении всех аспектов, о которых сообщается в данном документе, популяцию В-клеток выделяют путем центрифугирования в градиенте плотности.

В одном воплощении всех аспектов, о которых сообщается в данном документе, В-клетки являются зрелыми В-клетками.

В одном воплощении всех аспектов, о которых сообщается в данном документе, мечение осуществляется одной-тремя флуоресцентными метками. В конкретном воплощении мечение осуществляется двумя или тремя флуоресцентными метками.

В одном воплощении всех аспектов, о которых сообщается в данном документе, мечение В-клеток приводит к мечению от 0,1% до 2,5% клеток от общей В-клеточной популяции.

В одном воплощении всех аспектов, о которых сообщается в данном документе, В-клетки представляют собой В-клетки мыши, или В-клетки хомяка, или В-клетки кролика.

В одном воплощении всех аспектов, о которых сообщается в данном документе, сохранение одиночной клетки производят в лунках многолуночного планшета.

В одном воплощении всех аспектов, о которых сообщается в данном документе, фидерные клетки являются мышиными клетками EL-4 B5.

В одном воплощении всех аспектов, о которых сообщается в данном документе, антитело является моноклональным антителом.

В одном воплощении всех аспектов, о которых сообщается в данном документе, осуществляется мечение IgG⁺CD19⁺-В-клеток, IgG⁺CD38⁺-B-клеток, IgG⁺CD268⁺B-клеток, IgG^-CD138⁺B-клеток, CD27⁺CD138⁺-B-клеток или CD3^-CD27⁺-В-клеток.

В одном воплощении всех аспектов, о которых сообщается в данном документе, В-клетки имеют мышиное происхождение, и осуществляется мечение IgG⁺CD19⁺-B-клеток и/или IgG^-CD138⁺-B-клеток.

В одном воплощении всех аспектов, о которых сообщается в данном документе, В-клетки получены от хомяка, и осуществляется мечение IgG⁺IgM^--B-клеток.

В одном воплощении всех аспектов, о которых сообщается в данном документе, В-клетки получены от кролика, и осуществляется мечение IgG⁺-B-клеток, и/или CD138⁺-В-клеток, или CD138⁺IgG⁺-В-клеток, и/или IgG⁺IgM^--B-клеток.

В одном воплощении всех аспектов, о которых сообщается в данном документе, совместное культивирование осуществляют в среде RPMI 1640 с добавлением 10% (объем/объем) FCS, 1% (вес/объем) 200 мМ раствора глутамина, которая содержит пенициллин и стрептомицин, 2% (объем/объем) 100 мМ раствора пирувата натрия и 1% (объем/объем) 1 М HEPES-буфера (2-(4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин)этансульфокислота). В другом воплощении совместное культивирование осуществляют в среде, которая дополнительно содержит 0,05 мМ бета-меркаптоэтанол.

В одном воплощении всех аспектов, о которых сообщается в данном документе, совместное культивирование осуществляют с фидерными клетками и фидерной смесью. В одном воплощении фидерной смесью является супернатант природных культивированных тимоцитов (TSN) или синтетическая фидерная смесь.

В одном конкретном воплощении фидерная смесь представляет собой синтетическую фидерную смесь. В одном воплощении синтетическая фидерная смесь включает интерлейкин-1 бета и фактор некроза опухоли альфа. В одном воплощении синтетическая фидерная смесь включает интерлейкин-2 (IL-2) и/или интерлейкин-10 (IL-10). В одном воплощении синтетическая фидерная смесь также содержит клетки золотистого стафилококка штамма Cowans (SAC, Staphylococcus aureus Cowans). В одном воплощении синтетическая фидерная смесь включает интерлейкин-21 (IL-21). В одном воплощении синтетическая фидерная смесь включает В-клеточный фактор активации из семейства фактора некроза опухоли (BAFF, B-cell activation factor of the tumor necrosis factor family). В одном воплощении синтетическая фидерная смесь включает интерлейкин-6 (IL-6). В одном воплощении синтетическая фидерная смесь включает интерлейкин-4 (IL-4).

В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии супернатанта культивированных тимоцитов в качестве фидерной смеси. В конкретном воплощении супернатант культивированных тимоцитов получают из тимоцитов тимуса молодого животного.

В одном воплощении способ получения В-клеточного клона также включает этап

е) определения аминокислотной последовательности вариабельного домена легкой и тяжелой цепей антитела, произведенного выбранным В-клеточным клоном этапа д), с помощью ПЦР с обратной транскрипцией и секвенирования, и тем самым получения аминокислотной последовательности вариабельного домена моноклонального антитела.

В одном воплощении экспериментальное животное выбрано среди мыши, хомяка и кролика.

Подробное описание изобретения

Способ, о котором сообщается в данном документе, позволяет быстро охарактеризовать специфичность связывания моноклональных антител, полученных от отдельных В-клеточных клонов, т.е. в течение четырех недель после первой иммунизации экспериментального животного можно выделить индуцированные клетки, продуцирующие антитела, и определить специфичность связывания антител, продуцированных ими, в результате чего можно выполнить по меньшей мере 4 различных эксперимента из-за большого количества/концентрации антитела в супернатанте с совместным культивированием В-клеток.

Иммунизация:

Часто животные (не человек), такие как мыши, кролики, хомяки и крысы, используются в качестве животной модели для оценки терапии на основе антител. Поэтому часто требуется предоставить антитела с перекрестной реактивностью, связывающиеся с нечеловеческим животным антигеном, а также с человеческим антигеном. Способ, о котором сообщается в данном документе, может быть использован для предоставления антител с перекрестной реактивностью. В способе, о котором сообщается в данном документе, могут быть использованы В-клетки, полученные, например, от мыши, хомяка и кролика. В одном воплощении мышь является NMRI-мышью или BALB/c-мышью. В другом воплощении хомяк выбран среди армянского хомяка (Cricetulus migratorius), китайского хомяка (Cricetulus griseus) и сирийского хомяка (Mesocricetulus auratus). В конкретном воплощении хомяк является армянским хомяком. В одном воплощении кролик выбран среди белого новозеландского (NZW) кролика, кролика Zimmermann (ZIKA), кролика мутантной линии Alicia, кролика мутантной линии Basilea, трансгенного кролика с локусом иммуноглобулина человека, нокаутного кролика rbIgM и результатов их скрещивания.

В одном воплощении экспериментальные животные, например мыши, хомяки и кролики, выбранные для иммунизации, имеют возраст не старше 12 недель.

Источник и выделение В-клеток:

Кровь экспериментальных животных обеспечивает высокое разнообразие В-клеток, продуцирующих антитела. Полученные из нее В-клетки секретируют антитела, которые практически не имеют идентичных или перекрывающихся аминокислотных последовательностей в CDR и, таким образом, демонстрируют большое разнообразие.

В одном воплощении В-клетки экспериментального животного, например, из крови, получают через период от 4 дней после иммунизации до по меньшей мере 9 дней после иммунизации или самого последнего бустирования. Этот промежуток времени обеспечивает высокую гибкость в способе, о котором сообщается в данном документе. Вполне вероятно, что в этот промежуток времени В-клетки, обеспечивающие наиболее аффинные антитела, мигрируют из селезенки в кровь (см., например, Paus, D., et al., JEM 203 (2006) 1081-1091; Smith, K.G.S., et al., The EMBO J. 16 (1997) 2996-3006; Wrammert, J., et al., Nature 453 (2008) 667-672).

В-клетки из крови экспериментального животного могут быть получены любым способом, известным специалистам в данной области. Например, могут быть использованы центрифугирование в градиенте плотности (DGC, density gradient centrifugation) или лизис эритроцитов (лизис). Центрифугирование в градиенте плотности по сравнению с гипотоническим лизисом обеспечивает более высокий общий выход, т.е. число В-клеточных клонов. Кроме того, из клеток, полученных путем центрифугирования в градиенте плотности, большее количество клеток делится и растет на этапе совместного культивирования. Кроме того, концентрация секретированного антитела выше по сравнению с клетками, полученными с помощью других способов. Таким образом, в одном воплощении предоставление популяции В-клеток осуществляется путем центрифугирования в градиенте плотности.

Таблица 1
Число IgG-продуцирующих лунок/клеточных клонов, когда клетки получают путем центрифугирования в градиенте плотности (DGC) или гипотонического лизиса эритроцитов.

	мышь,DGC	мышь,лизис	хомяк,DGC	хомяк,лизис
Число выделенных клеток [×106]	1,7±0,2 (n=2)	1,6±0,1 (n=2)	2,1±0,2 (n=2)	0,9±0,1 (n=2)
IgG+-лунки [%]	22	12	7	6

Этапы выбора перед совместным культивированием:

В-клетки, продуцирующие антитела, которые специфически связываются с антигеном, могут быть получены из мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК). Таким образом, в одном воплощении всех способов, о которых сообщается в данном документе, В-клеточную популяцию получают из мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК).

Термин «специфически связывается» и его грамматические эквиваленты означают, что антитело связывается с его мишенью с константой диссоциации (Kd) 10^-7 М или менее, в одном воплощении от 10^-8 М до 10^-13 М, в другом воплощении от 10^-9 М до 10^-13 М. Этот термин также используется для указания, что антитело не связывается специфически с другими присутствующими биомолекулами, т.е. он связывается с другими биомолекулами с константой диссоциации (Kd) 10^-6 М или более, в одном воплощении от 10^-6 М до 1 М.

В одном воплощении всех способов, о которых сообщается в данном документе, МНПК обеднены макрофагами. Это выгодно, как указано ниже, например, в одном воплощении для В-клеток кроличьего происхождения для этапа совместного культивирования.

Макрофаги могут быть удалены из МНПК за счет адгезии к поверхности клеточного культурального планшета (см. этап предварительной инкубации).

В одном воплощении способа, о котором сообщается в данном документе, клетки получают из иммунизированных белком животных и обедняют их макрофагами перед мечением.

Было установлено, что инкубирование популяции В-клеток в среде для совместного культивирования перед сохранением одиночной клетки увеличивает общее число клеток, секретирующих антитела, полученных после сохранения одиночной клетки по сравнению с одиночной клеткой, сохраненной непосредственно после выделения и дополнительного обогащения популяции В-клеток из крови экспериментального животного (например, кролика, см. таблицы 2а и 2b). В частности, инкубация осуществляется при температуре примерно 37°C в течение примерно одного часа в среде EL-4 B5, например, с использованием клеточного культурального инкубатора.

Таблица 2а
IgG-положительные лунки/клеточные клоны с инкубацией в течение одного часа и без нее в среде EL-4 B5 перед сохранением по отдельности всех клеток (rb = кролик).
ИФА rbIgG	Свежие МНПК (⌀ 100-20 клеток)	МНПК после инкубации* (⌀ 50-10 клеток)
Лунки rbIgG+ [число лунок, n]	40	108
Лунки rbIgG+ [% от общего числа лунок]	28	75
* обедненные макрофагами и моноцитами

Таблица 2b
IgG-положительные лунки/клеточные клоны с инкубацией в течение одного часа и без нее в среде EL-4 B5 перед сохранением по отдельности всех В-клеток.
ИФА rbIgG	Одиночные В-клетки из свежих МНПК	Одиночные В-клетки из крови, инкубированы 1 ч	Одиночные В-клетки из свежих спленоцитов	Одиночные В-клетки из селезенки, инкубированы 1 ч
Лунки rbIgG+ [число лунок, n]	2	55	6	52
Лунки rbIgG+ [% от общего числа лунок]	2	33	7	31

В одном воплощении способов, о которых сообщается в данном документе, клетки получают от иммунизированного белком животного и обедняют их макрофагами.

Число клеток, не продуцирующих антитело, связывающее антиген, или, аналогично, число клеток, продуцирующих антитело, связывающее антиген, можно уменьшить или увеличить, соответственно, с помощью подхода пэннинга. При этом присутствующий связывающий партнер прикреплен к поверхности, и число клеток, связывающихся с ним, селективно увеличено в клеточной популяции в случае, когда связанные клетки подвергаются дальнейшей обработке, или уменьшено в клеточной популяции в случае, когда клетки, остающиеся в растворе, подвергаются дальнейшей обработке.

Таблица 3
Обогащение В-клетками, секретирующими антиген-специфическое антитело, путем пэннинга с соответствующим антигеном
Белковый антиген	Без пэннинга	С пэннингом с антигеном
Общее число лунок [n]	4284	2113
Антиген-специфические IgG+-лунки [число лунок, n]	235	419
Антиген-специфические IgG+-лунки [% от общего числа лунок]	5	20
Малые антигенные молекулы	Без пэннинга	С пэннингом с малой молекулой
Общее число лунок [n]	336	336
Лунки IgG+ малых молекул [число лунок, n]	2	115
Лунки IgG+ малых молекул [% от общего числа лунок]	1	34

Способ, о котором сообщается в данном документе, включает в одном воплощении перед сохранением одиночной клетки этап выбора, на котором В-клетки, продуцирующие специфические и/или не реагирующие перекрестно антитела, выбирают на основе маркеров клеточной поверхности и флуоресцентно-активированной сортировки/селекции клеток. В одном воплощении зрелые В-клетки сортируют/увеличивают/отбирают. Для выбора В-клеток у различных экспериментальных видов животных могут быть использованы различные маркеры клеточной поверхности. Было установлено, что многие из доступных маркеров клеточной поверхности не обеспечивают подходящего мечения ни по отдельности, ни в комбинации.

При мечении нецелевых клеточных популяций и неспецифически связывающих лимфоцитов можно выборочно удалять эти клетки. На этом этапе удаления (обеднения) может быть достигнуто только неполное удаление. Хотя удаление является не количественным, оно обеспечивает преимущество при последующем флуоресцентном мечении оставшихся клеток, так как число мешающих клеток может быть снижено или даже сведено к минимуму. При сохранении одиночных зрелых В-клеток (В-клеток памяти, аффинно зрелых лимфобластов и плазматических клеток) путем флуоресцентно-активированной сортировки клеток с помощью мечения, как указано ниже, может быть получено большее количество IgG⁺-лунок/клеточных клонов на этапе совместного культивирования.

Термин «мечение» обозначает наличие или отсутствие поверхностного маркера, который может быть определен путем добавления специфически связывающегося и меченого антитела против поверхностного маркера. Таким образом, наличие поверхностного маркера определяется, например, в случае флуоресцентной метки при возникновении флуоресценции, в то время как отсутствие поверхностного маркера определяется отсутствием флуоресценции после инкубации с соответствующим специфически связывающимся и меченым антителом против поверхностного маркера.

С помощью различных поверхностных маркеров могут быть помечены различные клеточные популяции, например CD3⁺-клетки (Т-клетки), CD19⁺-клетки (В-клетки), IgM⁺-клетки (зрелые наивные В-клетки), IgG⁺-клетки (зрелые В-клетки), CD38⁺-клетки (например, лимфобласты) и IgG⁺CD38⁺-клетки (преплазматические клетки).

Как сообщалось в данном документе, было разработано иммунофлуоресцентное мечение для отбора зрелых IgG⁺-B-клеток, таких как В-клетки памяти, лимфобласты и плазматические клетки. Для отбора или обогащения В-клетками клетки метят либо одной, либо двумя, либо тремя метками. Также необходимо такое мечение, которое дает примерно от 0,1% до 2,5% меченых клеток от общей популяции клеток. В одном воплощении В-клетки сохраняют в виде одиночных клеток, выбранных путем мечения поверхностных молекул, присутствующих у 0,1%-2,5% В-клеток в популяции, в другом воплощении у 0,3%-1,5% В-клеток в популяции, в еще одном воплощении у 0,5%-1% В-клеток в популяции.

Из IgG⁺-B-клеток в популяции МНПК 0,5%-1% могут быть дважды помечены как IgG⁺CD19⁺-клетки, IgG⁺CD38⁺-клетки и IgG⁺CD268⁺-клетки. Таким образом, в одном воплощении всех способов, о которых сообщается в данном документе, IgG⁺CD19⁺-B-клетки, IgG⁺CD38⁺-В-клетки или IgG⁺CD268⁺-B-клетки сохраняют как одиночные клетки.

Из IgG^--B-клеток в популяции МНПК 0,5%-1% могут быть дважды помечены как IgG^-CD138⁺-клетки. Таким образом, в одном воплощении всех способов, о которых сообщается в данном документе, IgG^-CD138⁺-B-клетки сохраняют как одиночные клетки.

Мечение CD27⁺CD138⁺-клеток или CD3^-CD27⁺-клеток приводит примерно к 1,5% клеток клеточной популяции, которые должны быть помечены, соответственно. Таким образом, в одном воплощении всех способов, о которых сообщается в данном документе, CD27⁺CD138⁺-B-клетки или CD3^-CD27⁺-B-клетки сохраняют как одиночные клетки.

Из IgG⁺-B-клеток хомяка в популяции МНПК 0,6% ± 0,1 могут быть дважды помечены как IgG⁺IgM^--B-клетки хомяка. Таким образом, в одном воплощении всех способов, о которых сообщается в данном документе, IgG⁺IgM^--B-клетки хомяка сохраняют как одиночные клетки.

В одном воплощении IgG^-CD138⁺-B-клетки сохраняют в виде одиночных клеток из В-клеток, полученных от иммунизированного животного. В одном воплощении всех способов, о которых сообщается в данном документе, IgG⁺CD19⁺-В-клетки сохраняют в виде одиночных клеток из В-клеток, полученных от неиммунизированного животного. В другом воплощении всех способов, о которых сообщается в данном документе, IgG⁺IgM^--B-клетки сохраняют в виде одиночных клеток из В-клеток, полученных от неиммунизированного или иммунизированного животного. В одном воплощении всех способов, о которых сообщается в данном документе, IgG⁺CD19⁺-B-клетки мыши сохраняют в виде одиночных клеток. Этот этап выбора приводит к повышению или даже к максимальному выходу IgG⁺-лунок в последующем этапе совместного культивирования. В другом воплощении всех способов, о которых сообщается в данном документе, IgG^-CD138⁺-B-клетки мыши сохраняют в виде одиночных клеток. При этом выбирают клетки, во-первых, продуцирующие наибольшее число В-клеточных клонов, и во-вторых, с наибольшей концентрацией IgG (см. таблицу 5). В другом воплощении всех способов, о которых сообщается в данном документе, IgG⁺CD19⁺-B-клетки мыши и IgG^-CD138⁺-B-клетки мыши сохраняют в виде одиночных клеток. В одном конкретном воплощении способ имеет условие, что, если клетки получены от кролика, мечение осуществляется не IgG⁺-B-клеток и/или не CD138⁺-В-клеток.

IgG⁺-B-клетки мыши могут быть помечены с помощью противомышиного IgG-антитела 227 (Ab 227), IgG⁺-B-клетки хомяка могут быть помечены с помощью противохомячкового IgG-антитела 213 (АВ 213) и/или противохомячкового IgG-антитела 225 (АВ 225), а В-клетки кролика могут быть помечены с помощью анти-IgG-антитела 184 (см. таблицу 4).

Таблица 4
Иммунофлуоресцентное мечение В-клеток - таблица представляет среднюю меченую часть популяции В-клеток мыши (А-Е), В-клеток хомяка (F-H) и В-клеток кролика (I-J)
	Одиночное мечение IgG	Мечение IgG+CD19	Мечение IgG+IgM
А	IgG+ АВ 185 РЕ17% ± 3% n=4	-	IgG+IgM+ АВ 185 РЕ, АВ 219 АРС12% n=1
В	IgG+ АВ 215 АРС12% ± 3% n=5	IgG+CD19+ AB 215 APC, AB 218 PE11% n=1	IgG+IgM+ АВ 215 АРС, АВ 200 РЕ14% n=1
С	IgG+ AB 217 FITC17% ± 4% n=7	IgG+CD19+ AB 217 FITC, AB 218 PE10% n=1	IgG+IgM+ АВ 217 FITC, АВ 200 РЕ19% n=1
D	IgG+ АВ 222 FITC18% ± 2% n=3	IgG+CD19+ AB 222 FITC, AB 218 PE15% n=1	IgG+IgM+ АВ 222 FITC, АВ 200 РЕ14% n=1
Е	IgG+ АВ 227 FITC0,8% ± 0,3% n=13	IgG+CD19+ AB 227 FITC, AB 218 PE0.5% n=1	IgG+IgM+ АВ 227 FITC, АВ 200 РЕ0,2% n=1
F	IgG+ АВ 212 FITC43% ± 6% n=7	Нет известного В-клеточного маркера	IgG+IgM+ AB 212 FITC, AB 223 APC43% n=1
G	IgG+ AB 213 APC0,9% ± 0,4% n=27	Нет известного В-клеточного маркера	IgG+IgM+ AB 213 APC, AB 224 FITC0,07% n=1
H	IgG+ AB 225 РЕ17% ± 3% n=5	Нет известного В-клеточного маркера	IgG+IgM+ AB 225 РЕ, AB 224 FITC0,7% n=1
I	IgG+ AB 120 PE>10%	-	-
J	IgG+ AB 184 FITC0,3-2%	-	-
AB 120 - козлиное противокроличье IgG-антитело Southern Biotech 4030-09AB 184 - козлиное противокроличье IgG Fc-антитело AbDSerotech STAR121FAB 185 - козлиное противомышиное IgG-антитело Caltag М35004-3AB 200 - козлиное противомышиное IgM-антитело Invitrogen M31504AB 212 - козлиное противохомячковое IgG-антитело AbDSerotech STAR79FAB 213 - мышиное противохомячковое IgG-антитело Becton Dickinson 554010AB 215 - козлиное противомышиное IgG-антитело Sigma В 0529AB 217 - козлиное противомышиное IgG-антитело AbDSerotech STAR120FAB 218-крысиное противомышиное CD19-антитело Abeam ab22480AB 219 - козлиное противомышиное IgM-антитело Rockland 710-1607AB 222 - козлиное противомышиное IgG-антитело Abeam ab7064AB 223 - мышиное противохомячковое IgM-антитело Becton Dickinson 554035AB 224 - мышиное противохомячковое IgM-антитело Becton Dickinson 554033AB 225 - мышиное противохомячковое IgG-антитело Becton Dickinson 554056AB 227 - козлиное противомышиное IgG-антитело Sigma F 8264

РЕ: фикоэритринАРС: аллофикоцианинFITC: изотиоцианат флуоресцеина

Следует отметить, что не все коммерчески доступные антитела могут быть использованы для мечения из-за их низкой или несуществующей специфичности.

Мышиные В-клетки могут быть помечены с помощью анти-IgG-антитела 227, В-клетки хомяка могут быть помечены с помощью анти-IgG-антитела 213.

Мышиные IgG⁺CD19⁺-B-клетки могут быть помечены с помощью антитела 227 и антитела 218,

мышиные IgG⁺IgM^--B-клетки могут быть помечены с помощью антитела 227 и антитела 219,

IgG⁺IgM^--B-клетки хомяка могут быть помечены с помощью антитела 213 и антитела 224,

IgG⁺-B-клетки кролика могут быть помечены с помощью антитела 184,

IgG⁺IgM^--B-клетки кролика могут быть помечены с помощью антитела 184, антитела 254 и SA 263,

IgG⁺CD138⁺-B-клетки кролика могут быть помечены с помощью антитела 259 и антитела 256.

Мышиные В-клетки могут быть помечены с помощью анти-CD27-антитела 235 или 236 (АВ 235, АВ 236), анти-CD38-антитела 192 (АВ 192), анти-CD138-антитела 233 (АВ 233) и анти-CD268-антитела 246 (АВ 246).

Таблица 5
Иммунофлуоресцентное мечение для определения зрелых В-клеток мыши (A-J), хомяка (K) и кролика (L-N)
Мечение	Иммунофлуоресцентное мечение для сортировки В-клеток	Процент от всех жизнеспособных клеток, %
А	IgG+CD19+ - АВ 227 FITC, АВ 218 РЕ	0,5±0,2 n=14
В	IgG+CD38+ - АВ 227 FITC, АВ 192 РЕ	0,8±0,5 n=9
С	IgG+CD138+ - АВ 227 FITC, АВ 233 РЕ	0,06±0,07 n=6
D	IgG-CD138+ - АВ 227 FITC, АВ 233 РЕ	0,6±0,5 n=6
Е	IgG+CD27+ - АВ 227 FITC, АВ 235 РЕ	0,1±0,1 n=8
F	CD27+CD138+ - АВ 236 А647, АВ 233 РЕ	1,5±0,5 n=2
G	CD27+IgG+CD3- - АВ 235 РЕ, АВ 227 FITC, АВ 241 А647	0,10±0,04 n=3
Н	CD3-CD27+ - АВ 189 FITC, АВ 235 РЕ	1,33 n=1
I	IgG+CD268+ - АВ 227 FITC, АВ 246 А647	0,8 n=1
J	CD38+CD3- - АВ 192 РЕ, АВ 189 FITC	12±7 n=2
К	IgG+IgM- - АВ 213 А647, АВ 224 FITC	0,6±0,1 n=15
L	IgG+ - AB 184 FITC	0,6±0,2, n=5
М	IgG+IgM- - АВ 184 FITC, АВ 254 Biotin, SA 263 РЕ	0,4±0,2, n=2
N	IgG+CD138+ - AB 259, АВ 256 РЕ	0,3±0,1, n=5
АВ 184 - козлиное противокроличье IgG-антитело AbD Serotec STAR121FАВ 189 - хомячковое противомышиное CD3-антитело Becton Dickinson 553062АВ 192 - крысиное противомышиное CD38-антитело Becton Dickinson 553764АВ 213 - мышиное противохомячковое IgG-антитело Becton Dickinson 554010АВ 218 - крысиное противомышиное CD19-антитело Abeam ab22480АВ 224 - мышиное противохомячковое IgM-антитело Becton Dickinson 554033АВ 227 - козлиное противомышиное IgG-антитело Sigma F 8264АВ 233 - крысиное противомышиное CD138-антитело Becton Dickinson 553714АВ 235 - хомячковое противомышиное CD27-антитело Becton Dickinson 558754АВ 236 - хомячковое противомышиное CD27-антитело Becton Dickinson 558753АВ 241 - хомячковое противомышиное CD3-антитело Becton Dickinson 553060АВ 246 - крысиное противомышиное BAFF-R-антитело eBioscience 51-5943АВ 254 - мышиное противокроличье IgM-антитело Becton Dickinson custom madeАВ 256 - козлиное противокрысиное IgG-антитело Southern Biotech 3030-09АВ 259 - крысиное противокроличье CD138-анитело Roche Glycart AGSA 263 - Стрептавидин Invitrogen S866А647: Alexa Fluor® 647FITC: изотиоцианат флуоресцеина

В одном воплощении способы включают этап обеднения В-клеточной популяции макрофагами и обогащение В-клеточной популяции В-клетками, секретирующими антитело, специфически связывающееся с антигеном-мишенью.

Сохранение одиночной клетки:

Способ, о котором сообщается в данном документе, включает этап сохранения В-клеток из В-клеточной популяции в виде одиночных клеток. В одном воплощении всех способов, о которых сообщается в данном документе, сохранение одиночных клеток осуществляют с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Мечение, необходимое для FACS-сохранения одиночных клеток, может осуществляться так, как сообщалось в предыдущем разделе.

В одном воплощении всех способов, о которых сообщается в данном документе, специфически меченые В-клетки сохраняют в виде одиночных клеток. В еще одном воплощении всех способов, о которых сообщается в данном документе, мечение является мечением маркеров клеточной поверхности флуоресцентно мечеными антителами. В другом воплощении способы, о которых сообщается в данном документе, предусматривают моноклональные антитела. В одном воплощении всех способов, о которых сообщается в данном документе, зрелые В-клетки сохраняют в виде одиночных клеток.

Кроме того, было обнаружено, что дополнительный этап центрифугирования после сохранения одиночных клеток и перед совместным культивированием обеспечивает увеличение числа клеток, секретирующих антитело, и увеличивает количество секретируемого IgG (например, экспериментальное животное с локусом иммуноглобулина человека, см. таблицу 6).

Таблица 6
IgG-положительные лунки/клеточные клоны с этапом центрифугирования и без него после сохранение одиночных клеток
ИФА huCk	с этапом центрифугирования	без этапа центрифугирования
Лунки huCk+ [число лунок, n]	9	1
Лунки huCk+ [% от общего числа лунок]	13	1
Конц. huCk во всех huCk+-лунках [среднее нг/мл]	76,4	9,7

В одном воплощении всех способов, о которых сообщается в данном документе, способ включает этап центрифугирования одиночной сохраненной клетки перед совместным культивированием. В одном конкретном воплощении центрифугирование осуществляют в течение 5 минут со скоростью 300 д.

Совместное культивиров