Липиды, подходящие для липосомной доставки кодирующей белок рнк

Липиды, подходящие для липосомной доставки кодирующей белок рнк

Иллюстрации

Показать все

Реферат

В этой заявке заявлен приоритет к предварительной заявке на патент США № 61/378833, которая была подана 31 августа 2010 г., полное содержание которой включено сюда в качестве ссылки для всех целей.

Область техники

Данное изобретение относится к области не вирусной доставки РНК животным.

Уровень техники

Доставку нуклеиновых кислот для in vivo экспрессии кодированных белков используют для генотерапии и иммунизации. Были протестированы различные подходы к успешной доставке, включая применение ДНК или РНК, вирусных и не вирусных средств доставки (или даже при отсутствии средства доставки, в "голой" вакцине), или реплицирующие или не реплицирующие векторы, или вирусные или не вирусные векторы.

Все еще остается необходимость в дополнительных и улучшенных способах доставки нуклеиновых кислот животным для in vivo экспрессии их кодированных белков.

Описание изобретения

В соответствии с данным изобретением РНК доставляют инкапсулированной в липосому. РНК кодирует целевой полипептид. Липосома включает, по крайней мере, одно соединение, выбранное из группы, включающей соединения формулы (I) и формулы (XI). Эти липосомы могут эффективно доставлять РНК для in vivo экспрессии. Данное изобретение особенно полезно для иммунизации, при которой кодированным полипептидом является иммуноген.

Таким образом, в изобретении представлена липосома, в которую инкапсулирована РНК, кодирующая целевой полипептид, где липосома включает, по крайней мере, одно соединение, выбранное из группы, включающей соединения формулы (I) и формулы (XI).

Формула (I) представляет собой:

,

где

R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную C_3-20-гетероциклоалкильную, C_3-20-гетероциклоалкенильную, C_3-20-гетероциклоалкинильную или C_5-20-гетероарильную группу;

a отсутствует или является необязательно замещенным C_1-4алкиленом;

b отсутствует или является необязательно замещенным C_1-4алкиленом;

c отсутствует или является необязательно замещенным C_1-4алкиленом;

X¹ является O или S;

X² является O или S;

Y¹ является необязательно замещенным C_10-30алкенилом, C_10-30алкинилом, C_10-30гетероалкенилом или C_10-30гетероалкинилом;

L отсутствует или является -(L^a)_d-(L^b)_e-(L^c)_f-, где

L^a является необязательно замещенным C_1-15алкиленом, C_1-15алкениленом, C_1-15алкиниленом, C_1-15гетероалкиленом, C_1-15гетероалкениленом или C_1-15гетероалкиниленом;

L^b является необязательно замещенным C_6-14ариленом или C_5-13гетероариленом;

L^c является необязательно замещенным C_1-15лкиленом, C_1-15алкениленом, C_1-15алкиниленом, C_1-15гетероалкиленом, C_1-15гетероалкениленом или C_1-15гетероалкиниленом;

d равно 0 или 1;

e равно 0 или 1; и

f равно 0 или 1; и

Y² является необязательно замещенным стероидом.

Формула (XI) представляет собой:

R^a-(AA)_z-R^b,

где

R^a является N-концевым алкиламидом;

z является целым числом от 2 до 10;

каждый AA является аминокислотой, при условии, что присутствуют, по крайней мере, один гистидин и, по крайней мере, одна катионная аминокислота;

R^b является -H или -NH₂.

В данном изобретении также представлен способ получения РНК-содержащей липосомы, включающий стадию смешивания РНК с соединением, выбранным из группы, включающей соединения формулы (I) и формулы (XI), в таких условиях, что соединения образуют липосому, в которую инкапсулирована РНК. РНК и соединение могут быть смешаны в присутствии других соединений, которые также становятся инкапсулированными в липосому, например, других липидов.

Липосома

В изобретении применяют липосомы, в которые инкапсулирована кодирующая полипептид РНК. Таким образом, РНК (как в природном вирусе) отделена от любой внешней среды. Было обнаружено, что инкапсулирование в липосому защищает РНК от переваривания рибонуклеазы. Липосомы могут включать некоторые внешние РНК {например, на их поверхности), но, по крайней мере, половина РНК (и, в идеале, все) инкапсулированы в оболочку липосомы. Инкапсулирование в липосомы отличается от, например, комплексов липид/РНК, описанных в ссылке 1, где РНК смешивают с предварительно полученными липосомами.

Различные амфифильные липиды могут образовывать двухслойные структуры в водной среде для инкапсулирования РНК-содержащей водной оболочки в виде липосомы. Эти липиды могут иметь анионную, катионную или цвиттерионную гидрофильные концевые группы. Получение липосом из анионных фосфолипидов ведет свое начало от 1960-х, и липиды, образующие катионные липосомы, изучают с 1990-х. Некоторые фосфолипиды являются анионными, в то время как другие являются цвиттерионными и другие являются катионными. Подходящие классы фосфолипида включают, но не ограничены ими, фосфатидилэтаноламины, фосфатидилхолины, фосфатидилсерины и фосфатидилглицерины, и некоторые полезные фосфолипиды перечислены таблице I. Полезные катионные липиды известного уровня техники включают, но не ограничены ими, диолеоил триметиламмонийпропан (DOTAP), 1,2-дистеарилокси-N,N-диметил-3-аминопропан (DSDMA), 1,2-диолеилокси-N,N-диметил-3-аминопропан (DODMA), 1,2-дилинолеилокси-N,N-диметил-3-аминопропан (DlinDMA), 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметил-3-аминопропан (DLenDMA). Цвиттерионные липиды включают, но не ограничены ими, ацильные цвиттерионные липиды и простые эфирные цвиттерионные липиды. Примеры полезных цвиттерионных липидов включают DPPC, DOPC, ДСФХ, додецилфосфохолин, 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин (DOPE) и 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DPyPE). Липиды в липосомах в соответствии с данным изобретением могут быть насыщенными или ненасыщенными. Применение, по крайней мере, одного ненасыщенного липида для получения липосом является предпочтительным. Если ненасыщенный липид имеет два хвоста, оба хвоста могут быть ненасыщенными, или он может иметь один насыщенный хвост и один ненасыщенный хвост. Липид может включать стероидную группу в одном хвосте, например, в виде RV05.

Липосомы в соответствии с данным изобретением могут быть получены из одного липида или, более часто, из смеси липидов. Смесь может содержать (i) смесь катионных липидов, (ii) смесь анионных липидов и катионных липидов, (iii) смесь цвиттерионных липидов и катионных липидов или (vii) смесь анионных липидов, катионных липидов и цвиттерионных липидов. Также смесь может содержать насыщенные и ненасыщенные липиды. Если применяют смесь липидов, не все составляющие липиды в смеси должны быть амфифильными, например, один или более амфифильных липидов могут быть смешаны с холестерином.

Липосомы в соответствии с данным изобретением включают, по крайней мере, одно соединение формулы (I) и/или, по крайней мере, одно соединение формулы (XI). Предпочтительные липосомы в соответствии с данным изобретением включают катионный липид формулы (I). Как показано в примерах, такие липосомы особенно полезны для in vivo доставки РНК для экспрессии белка. Другие предпочтительные липосомы в соответствии с данным изобретением включают липопептид формулы (XI).

Липосома может включать липосому формулы (I) и липопептид формулы (XI), но обычно включает только один из этих двух классов катионного соединения.

Если липосому в соответствии с данным изобретением получают из смеси липидов, предпочтительно, чтобы доля липидов, имеющих формулу (I) или (XI), должна составлять 20-80% от общего количества липидов, например, 30-70% или 40-60%. Например, полезные липосомы показаны ниже, в которых 40% или 60% от общего количества липидов являются липидами формулы (I). Остаток составляют, например, холестерин (например, 35-50% холестерина) и/или ДМГ (необязательно ПЭГилированный) и/или ДСФХ. Такие смеси используют ниже. Указанные процентные значения являются мольными процентами.

Липосома может включать амфифильный липид, гидрофильная часть которого ПЭГилирована (т.е. модифицирована ковалентным присоединением полиэтиленгликоля). Такая модификация может повысить стабильность и предотвратить не специфическую абсорбцию липосом. Например, липиды могут быть конъюгированы с ПЭГ с применением методов, таких как описаны в ссылках 2 и 3. Полезные ПЭГилированные липиды включают PEG-ДМГ и липиды из ссылки 8 формулы (XI). ПЭГ обеспечивает липосомам оболочку, которая может придавать благоприятные фармакокинетические характеристики. Могут применяться ПЭГ различной длины, например, 0,5-8 кДа.

Полезные смеси липидов для получения липосом в соответствии с данным изобретением включают: катионный липид формулы (I); холестерин; и ПЭГилированный липид, такой как ПЭГ-ДМГ, т.е. ПЭГ-конъюгированный 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)]. Эта смесь также может включать нейтральный цвиттерионный липид, такой как ДСФХ (1,2-диастеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин) или DPyPE. Эти (и другие) смеси применяют в примерах ниже.

Липосомы обычно разделены на три группы: мультиламеллярные везикулы (MLV); малые моноламеллярные везикулы (SUV); и большие моноламеллярные везикулы (LUV). MLV имеют множество двухслойных структур в каждой везикуле, образуя несколько отдельных водных отделений. SUV и LUV имеют одну двухслойную структуру, инкапсулирующую водную оболочку; SUV обычно имеет диаметр <50 нм, и LUV имеют диаметр >50 нм. Липосомы в соответствии с данным изобретением являются идеальными LUV с диаметром в интервале 60-180 нм, и предпочтительно в интервале 80-160 нм.

Липосома в соответствии с данным изобретением может быть частью композиции, содержащей множество липосом, и липосомы во множестве могут иметь различные диаметры. Для композиции, включающей множество липосом с различными диаметрами: (i) по крайней мере, 80% от количества липосом должны иметь диаметры в интервале 60-180 нм, и предпочтительно в интервале 80-160 нм, и/или (ii) средний диаметр (по интенсивности, например, Z-средний) множества в идеале составляет 60-180 нм, и предпочтительно в интервале 80-160 нм. Диаметры во множестве в идеале должны иметь коэффициент полидисперсности <0,2. Комплексы липосома/РНК из ссылки 1 предположительно имеют диаметр в интервале 600-800 нм и имеют высокую полидисперсность. Диаметры во множестве могут быть измерены с применением динамического светорассеяния.

Методики получения подходящих липосом хорошо известны в данной области техники, например, см. ссылки 4-6. Одна из полезных методик описана в ссылке 7 и включает смешивание (i) этанольного раствора липидов, (ii) водного раствора нуклеиновой кислоты и (iii) буфера, с последующим смешиванием, уравновешиванием, разбавлением и очисткой. Предпочтительные липосомы в соответствии с данным изобретением получают таким методом смешивания.

Для получения липосом с желаемым диаметром(ами) смешивание проводят с применением способа, в котором два потока сырья водного раствора РНК объединяют в одной зоне смешивания с одним потоком этанольного раствора липидов, где все потоки имеют одинаковую скорость, например, в микрофлюидном канале, как описано ниже.

Формула (I)

Катионные липиды формулы (I) являются следующими:

,

где

R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную C_3-20-гетероциклоалкильную, C_3-20-гетероциклоалкенильную, C_3-20-гетероциклоалкинильную или C_5-20-гетероарильную группу;

a отсутствует или является необязательно замещенным C_1-4алкиленом;

b отсутствует или является необязательно замещенным C_1-4алкиленом;

c отсутствует или является необязательно замещенным C_1-4алкиленом;

X¹ является O или S;

X² является O или S;

Y¹ является необязательно замещенным C_10-30алкенилом, C_10-30алкинилом, C_10-30гетероалкенилом или C_10-30гетероалкинилом;

L отсутствует или является -(L^a)_d-(L^b)_e-(L^c)_f-, где

L^a является необязательно замещенным C_1-15алкиленом, C_1-15алкениленом, C_1-15алкиниленом, C_1-15гетероалкиленом, C_1-15гетероалкениленом или C_1-15гетероалкиниленом;

L^b является необязательно замещенным C_6-14ариленом или C_5-13гетероариленом;

L^c является необязательно замещенным C_1-15алкиленом, C_1-15алкениленом, C_1-15алкиниленом, C_1-15гетероалкиленом, C_1-15гетероалкениленом или C_1-15гетероалкиниленом;

d равно 0 или 1;

e равно 0 или 1; и

f равно 0 или 1; и

Y² является необязательно замещенным стероидом.

Таким образом, R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют циклическую "головную группу" с третичным амином. Эти соединения описаны более подробно в ссылке 8, полное описание которой включено сюда в качестве ссылки.

В некоторых вариантах соединения формулы (I) имеют формулу (II):

,

где

R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную C_3-20-гетероциклоалкильную, C_3-20-гетероциклоалкенильную, C_3-20-гетероциклоалкинильную или C_5-20-гетероарильную группу;

a отсутствует или является необязательно замещенным C_1-4алкиленом;

b отсутствует или является необязательно замещенным C_1-4алкиленом;

c отсутствует или является необязательно замещенным C_1-4алкиленом;

X¹ является O или S;

X² является O или S;

Y¹ является необязательно замещенным C_10-30алкенилом, C_10-30алкинилом, C_10-30гетероалкенилом или C_10-30гетероалкинилом;

L является -(L^a)_d-(L^b)_e-(L^c)_f-, где

L^a является необязательно замещенным C_1-15алкиленом, C_1-15алкениленом, C_1-15алкиниленом, C_1-15гетероалкиленом, C_1-15гетероалкениленом или C_1-15гетероалкиниленом;

L^b является необязательно замещенным C_6-14ариленом или C_5-13гетероариленом;

L^c является необязательно замещенным C_1-15алкиленом, C_1-15алкениленом, C_1-15алкиниленом, C_1-15гетероалкиленом, C_1-15гетероалкениленом или C_1-15гетероалкиниленом;

d равно 0 или 1;

e равно 0 или 1; и

f равно 0 или 1;

при условии, что L содержит один или более гетероатомов, и

Y² является необязательно замещенным стероидом.

В некоторых вариантах соединения формулы (I) имеют формулу (III):

,

где

R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную C_3-20-гетероциклоалкильную, C_3-20-гетероциклоалкенильную, C_3-20-гетероциклоалкинильную или C_5-20-гетероарильную группу;

a является метиленом;

b является метиленом;

c отсутствует;

X¹ является O или S;

X² является O или S;

Y¹ является необязательно замещенным C_10-30алкенилом, C_10-30алкинилом, C_10-30гетероалкенилом или C_10-30гетероалкинилом;

L является -(L^a)_d-(L^b)_e-(L^c)_f-, где

L^a является необязательно замещенным C_1-15алкиленом, C_1-15алкениленом, C_1-15алкиниленом, C_1-15гетероалкиленом, C_1-15гетероалкениленом или C_1-15гетероалкиниленом;

L^b является необязательно замещенным C_6-14ариленом или C_5-13гетероариленом;

L^c является необязательно замещенным C_1-15алкиленом, C_1-15алкениленом, C_1-15алкиниленом, C_1-15гетероалкиленом, C_1-15гетероалкениленом или C_1-15гетероалкиниленом;

d равно 0 или 1;

e равно 0 или 1; и

f равно 0 или 1; и

Y² является необязательно замещенным стероидом.

В некоторых вариантах соединения формулы (I) имеют формулу (IV):

,

где

R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную C_3-20-гетероциклоалкильную, C_3-20-гетероциклоалкенильную, C_3-20-гетероциклоалкинильную или C_5-20-гетероарильную группу;

a является метиленом;

b является метиленом;

c отсутствует;

X¹ является O или S;

X² является O или S;

Y¹ является необязательно замещенным C_10-30алкенилом, C_10-30алкинилом, C_10-30гетероалкенилом или C_10-30гетероалкинилом;

L является -(L^a)_d-(L^b)_e-(L^c)_f-, где

L^a является необязательно замещенным C_1-15алкиленом, C_1-15алкениленом, C_1-15алкиниленом, C_1-15гетероалкиленом, C_1-15гетероалкениленом или C_1-15гетероалкиниленом;

L^b является необязательно замещенным C_6-14ариленом или C_5-13гетероариленом;

L^c является необязательно замещенным C_1-15алкиленом, C_1-15алкениленом, C_1-15алкиниленом, C_1-15гетероалкиленом, C_1-15гетероалкениленом или C_1-15гетероалкиниленом;

d равно 0 или 1;

e равно 0 или 1; и

f равно 0 или 1;

при условии, что L содержит один или более гетероатомов, и

Y² является необязательно замещенным стероидом.

В некоторых вариантах соединения формулы (I) имеют формулу (V):

,

где

R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную C_3-20-гетероциклоалкильную, C_3-20-гетероциклоалкенильную, C_3-20-гетероциклоалкинильную или C_5-20-гетероарильную группу;

a является метиленом;

b является метиленом;

c отсутствует;

X¹ является O;

X² является O;

Y¹ является необязательно замещенным C_10-30алкенилом, C_10-30алкинилом, C_10-30гетероалкенилом или C_10-30гетероалкинилом;

L является -(L^a)_d-(L^b)_e-(L^c)_f-, где

L^a является необязательно замещенным C_1-15алкиленом, C_1-15алкениленом, C_1-15алкиниленом, C_1-15гетероалкиленом, C_1-15гетероалкениленом или C_1-15гетероалкиниленом;

L^b является необязательно замещенным C_6-14ариленом или C_5-13гетероариленом;

L^c является необязательно замещенным C_1-15алкиленом, C_1-15алкениленом, C_1-15алкиниленом, C_1-15гетероалкиленом, C_1-15гетероалкениленом или C_1-15гетероалкиниленом;

d равно 0 или 1;

e равно 0 или 1; и

f равно 0 или 1;

при условии, что L содержит один или более гетероатомов, и

Y² является необязательно замещенным стероидом.

В некоторых вариантах соединения формулы (I) имеют формулу (VI):

,

где

R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную C_3-20-гетероциклоалкильную, C_3-20-гетероциклоалкенильную, C_3-20-гетероциклоалкинильную или C_5-20-гетероарильную группу;

a является метиленом;

b является метиленом;

c отсутствует;

X¹ является O;

X² является O;

Y¹ является необязательно замещенным C_10-30алкенилом, C_10-30алкинилом, C_10-30гетероалкенилом или C_10-30гетероалкинилом;

L является -L^c-, где L^c является необязательно замещенным C_1-15гетероалкиленом, C_1-15гетероалкениленом или C_1-15гетероалкиниленом; и

Y² является необязательно замещенным стероидом.

В некоторых вариантах соединения формулы (I) имеет формулу (VII):

,

где

R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную C_3-20-гетероциклоалкильную, C_3-20-гетероциклоалкенильную, C_3-20-гетероциклоалкинильную или C_5-20-гетероарильную группу;

a является метиленом;

b является метиленом;

c отсутствует;

X¹ является O;

X² является O;

Y¹ является необязательно замещенной C_16-22алкенильной группой;

L является -L^c-, где L^c является необязательно замещенным C_1-15гетероалкиленом, C_1-15гетероалкениленом или C_1-15гетероалкиниленом; и

Y² является необязательно замещенным стероидом.

В некоторых вариантах соединения формулы (I) имеют формулу (VIII):

,

где

R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную C_3-20-гетероциклоалкильную, C_3-20-гетероциклоалкенильную, C_3-20-гетероциклоалкинильную или C_5-20-гетероарильную группу;

a является метиленом;

b является метиленом;

c отсутствует;

X¹ является O;

X² является O;

Y¹ является необязательно замещенной C_16-22алкенильной группой;

L является -L^c-, где L^c является необязательно замещенным C_1-15гетероалкиленом, C_1-15гетероалкениленом или C_1-15гетероалкиниленом; и

Y² является холестерином, связанным через гидроксигруппу в положении 3 стероидного кольца А, где атом водорода в указанной гидроксигруппе отсутствует.

В некоторых вариантах соединения формулы (I) имеют формулу (IX):

,

где

R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную C_3-20-гетероциклоалкильную, C_3-20-гетероциклоалкенильную, C_3-20-гетероциклоалкинильную или C_5-20-гетероарильную группу;

a является метиленом;

b является метиленом;

c отсутствует;

X¹ является O или S;

X² является O или S;

Y¹ является необязательно замещенным C_10-30алкенилом, C_10-30алкинилом, C_10-30гетероалкенилом или C_10-30гетероалкинилом;

L является -(L^a)_d-(L^b)_e-(L^c)_f-, где

L^a является необязательно замещенным C_1-15алкиленом, C_1-15алкениленом, C_1-15алкиниленом, C_1-15гетероалкиленом, C_1-15гетероалкениленом или C_1-15гетероалкиниленом;

L^b является необязательно замещенным C_6-14ариленом или C_5-13гетероариленом;

L^c является необязательно замещенным C_1-15алкиленом, C_1-15алкениленом, C_1-15алкиниленом, C_1-15гетероалкиленом, C_1-15гетероалкениленом или C_1-15гетероалкиниленом;

d равно 0 или 1;

e равно 0 или 1; и

f равно 0 или 1;

при условии, что L содержит один или более гетероатомов,

Y² является необязательно замещенным стероидом, и

pKa соединения составляет от около 5,9 до около 7.

В некоторых вариантах соединения формулы (I) имеют формулу (X):

,

где

R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную C_3-20-гетероциклоалкильную, C_3-20-гетероциклоалкенильную, C_3-20-гетероциклоалкинильную или C_5-20-гетероарильную группу;

a является метиленом;

b является метиленом;

c отсутствует;

X¹ является O или S;

X² является O или S;

Y¹ является необязательно замещенным C_10-30алкенилом, C_10-30алкинилом, C_10-30гетероалкенилом или C_10-30гетероалкинилом;

L является -(L^a)_d-(L^b)_e-(L^c)_f-, где

L^a является необязательно замещенным C_1-15алкиленом, C_1-15алкениленом, C_1-15алкиниленом, C_1-15гетероалкиленом, C_1-15гетероалкениленом или C_1-15гетероалкиниленом;

L^b является необязательно замещенным C_6-14ариленом или C_5-13гетероариленом;

L^c является необязательно замещенным C_1-15алкиленом, C_1-15алкениленом, C_1-15алкиниленом, C_1-15гетероалкиленом, C_1-15гетероалкениленом или C_1-15гетероалкиниленом;

d равно 0 или 1;

e равно 0 или 1; и

f равно 0 или 1;

при условии, что L содержит один или более гетероатомов,

Y² является необязательно замещенным стероидом, и

pKa соединения составляет от около 4,5 до около 6,2.

a, b и c

В одном варианте a является необязательно замещенным C_1-2алкиленом. В другом варианте a является необязательно замещенным C₁-алкиленом.

В одном варианте b является необязательно замещенным C_0-2 алкиленом. В другом варианте b является необязательно замещенным C₁-алкиленом.

В одном варианте c отсутствует или является необязательно замещенным C₁-алкиленом. В другом варианте c отсутствует.

В одном варианте a, b и c, если присутствуют, не замещены.

Головная группа

В одном варианте R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную C_3-20-гетероциклоалкильную, C_3-20-гетероциклоалкенильную, C_3-20-гетероциклоалкинильную группу, C₅-гетероарильную или C₆-гетероарильную группу. В одном варианте R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную C_3-20-гетероциклоалкильную, C_3-20-гетероциклоалкенильную или C_3-20-гетероциклоалкинильную группу. В другом варианте R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную C_3-20-гетероциклоалкильную группу.

В одном варианте R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную C_5-16 группу. В другом варианте R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную C_5-12 группу. В другом варианте R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную C₅ группу, C₆ группу или C₇ группу. В другом варианте R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенную C₅ группу или C₆ группу.

В одном из предпочтительных вариантов данного изобретения, R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют соединения, которые включают, по крайней мере, один атом кислорода.

В одном варианте R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, выбирают из H¹-H⁴⁸, представленных в таблице 1.

X¹ и X²

В одном варианте X¹ является O. В другом варианте X² является O. В другом варианте оба X¹ и X² являются O.

Связующая группа

В предпочтительном варианте L содержит, по крайней мере, один гетероатом. Это означает, что группа, которая является прямой связью между X² и Y², содержит, по крайней мере, один гетероатом, или, другими словами, что любой гетероатом в a заместителе L не рассматривается для этих целей. В другом варианте L содержит, по крайней мере, один атом O.

В одном варианте L содержит, по крайней мере, два гетероатома. В другом варианте L содержит, по крайней мере, два атома O.

В одном варианте L^c является необязательно замещенным С_1-15алкиленом или С_1-15гетероалкиленом. В одном варианте L^c является необязательно замещенным С_1-15алкиленом или С_1-15гетероалкиленом и d и e оба равны 0.

В одном варианте L^c выбирают из одной из формул L^c-i-L^c-xxiii. В одном варианте L^c выбирают из одной из формул L^c-i-L^c-xxiii, и d и e оба равны 0.

Lc-i	-(CH2)2O(CH2)2-
Lc-ii	-(CH2)4-
Lc-iii	-CO(CH2)2CO-
Lc-iv	-CO-
Lc-v	-COCH2OCH2CO-
Lc-vi	-(CH2)2O(CH2)2NHCO-
Lc-vii	-(CH2)3O(CH2)3-
Lc-viii	-(CH2)2-
Lc-ix	-(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2-
Lc-x	-(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2-
Lc-xi
Lc-xii
Lc-xiii
Lc-xiv

Lc-xv	-(CH2)2O(CH2)2OCH(CH3)-
Lc-xvi	-(CH2)2O(CH2)2OC(=O)(CH2)2CO-
Lc-xvii	-(CH2)2OC(=O)(CH2)2CO-
Lc-xviii	-(CH2)2O(CH2)2OCO-
Lc-xix	-(CH2)2NHC(=O)CH2OCH2C(=O)-
Lc-xx	-(CH2)2NHC(=O)(CH2)2C(=O)-
Lc-xxi	-(CH2)2NHC(=O)-
Lc-xxii	-(CH2)2NHC(=O)CH2NHC(=O)-
Lc-xxiii	-(CH2)2NHC(=O)CH(боковая цепь-1)NHC(=O)-, где боковая цепь-1 является группой , пунктирная линия означает связь с остальной молекулой.

Так как группы, в которых L содержит, по крайней мере, один гетероатом, являются предпочтительными, L^c предпочтительно выбирают из L^c-i, L^c-v-L^c-vii и L^c-ix-L^c-xxiii.

В одном варианте L^c является необязательно замещенным C_1-15гетероалкиленом.

В одном варианте L^c является необязательно замещенной C_1-11 группой. В другом варианте L^c является необязательно замещенной C_1-9 группой. В другом варианте L^c является необязательно замещенной C_3-8 группой. В другом варианте L^c является необязательно замещенной C_4-7 группой. В другом варианте L^c является необязательно замещенной C₅, C₆ или C₇ группой.

В предпочтительном варианте d равно 0; e равно 0; и f равно 1. В предпочтительном варианте d равно 0; e равно 0; и f равно 1; и L^c является, в пределах длины цепи, указанной выше, гетероалкиленом.

Y¹

В одном варианте Y¹ является C_12-28 группой. В другом варианте Y¹ является C_14-26 группой. В другом варианте Y¹ является C_16-24 группой. В другом варианте Y¹ является C_16-22 группой. В другом варианте цепь Y¹ имеет длину 18, 19, 20 или 21 атом.

В пределах количества углерода, указанного выше, Y¹ предпочтительно является алкенилом или гетероалкенилом.

В одном варианте Y¹ имеет, по крайней мере, одну алкеновую группу. В другом варианте Y¹ имеет 1, 2 или 3 алкеновых группы.

В одном варианте Y¹ имеет алкеновую группу в положении омега-3. В другом варианте Y¹ имеет алкеновую группу в положении омега-6. В другом варианте Y¹ имеет алкеновую группу в положении омега-9. В другом варианте Y¹ имеет алкеновую группу в двух или трех из положений омега-3, омега-6 и омега-9. В одном варианте Y¹ является ненасыщенным в положениях омега-6 и омега-9. В другом варианте Y¹ является ненасыщенным в положениях омега-3, омега-6 и омега-9. В одном варианте Y¹ является ненасыщенным в положении омега-9.

В одном варианте Y¹ имеет, по крайней мере, одну цис-ненасыщенную алкеновую группу. В другом варианте Y¹ имеет, по крайней мере, две цис-ненасыщенные алкеновые группы. В другом варианте Y¹ имеет, по крайней мере, три цис-ненасыщенные алкеновые группы. По крайней мере, одна цис-ненасыщенная алкеновая группа может быть в одном, двух или трех положениях омега-3, омега-6 и омега-9. Ненасыщенность в липидных цепях обсуждается в MacLachlan et al., Journal of Controlled Release 107 (2005) 276-287.

В одном варианте Y¹ выбирают из Y^1-i-Y^1-vi в таблице 2.

Y²

В одном варианте Y² связан с L через атом кислорода на необязательно замещенном стероиде. В другом варианте Y² связан с L через атом кислорода в положении 3 стероидного кольца A. В другом варианте Y² является стерином, в котором атом водорода гидроксигруппы в положении 3 стероидного кольца A удален (и связь с L происходит через атом кислорода указанной гидроксигруппы).

В одном варианте указанный стерин выбирают из группы, включающей: аннастерин; авенастерин; бета-ситостерин; брассикастерин; кальциферол; кампестерин; чалиностерин; чинастерин; холестанол; холестерин; копростанин; циклоартенин; дегидрохолестерин; десмостерин; дигидрокальциферол; дигидрохолестерин; дигидроэргостерин; диностерин; эпихолестерин; эргостерин; фукостерин; гексагидролюмистерин; гексаол; гидроксихолестерин; ланостерин; люмистерин; паркеол; пориферастерин; сарингостерин; ситостанол; ситостерин; стигмастанол; стигмастерин; вейнберстерин; зимостерин; стериновые желчные кислоты (такие как холиновая кислота; ченодеоксихолиновая кислота; гликохолиновая кислота; таурохолиновая кислота; деоксихолиновая кислота и литохолиновая кислота); и их соли.

В другом варианте стерином является холестерин.

pKa

pKa липида является pH, при котором 50% жиров заряжены, который находится посередине между точкой, в которой липиды полностью заряжены, и точкой, в которой липиды полностью не заряжены. Он может быть измерен различными путями, но предпочтительно его измеряют с применением описанного ниже метода. pKa обычно должен быть измерен только для чистого липида, а не для липида в контексте смеси, которая также включает другие липиды (например, не такая, как указано в ссылке 2, который выглядит как pKa SNALP, а не отдельных липидов).

pKa липида измеряют в воде при стандартной температуре и давлении с применением следующей методики:

- 2 мМ раствор липида в этаноле получают взвешиванием липида и растворением в этаноле. 0,3 мМ раствор флуоресцентной пробы толуолнитросульфоновой кислоты (ТНС) в этанол:метанол 9:1 получают сначала получением 3 мМ раствора ТНС в метаноле с последующим разбавлением до 0,3 мМ этанолом.

- Получают водный буфер, содержащий фосфат натрия, цитрат натрия, ацетат натрия и хлорид натрия, в концентрациях 20 мМ, 25 мМ, 20 мМ и 150 мМ, соответственно. Буфер разделяют на восемь частей и pH доводят либо 12н HCl, либо 6н NaOH до 4,44-4,52, 5,27, 6,15-6,21, 6,57, 7,10-7,20, 7,72-7,80, 8,27-8,33 и 10,47-11,12. 400 мкл 2 мМ липидного раствора и 800 мкл 0,3 мМ раствора ТНС смешивают.

- 7,5 мкл смеси проба/липид добавляют к 242,5 мкл буфера в 1-мл 96-луночном планшете. Добавление проводят к каждому из восьми буферов. После смешивания 100 мкл каждой смеси проба/липид/буфер переносят в 250-мкл 96-луночный планшет, черный с прозрачным дном (например, модель COSTAR 3904, Corning).

- Флуоресценцию каждой смеси проба/липид/буфер измеряют (например, на спектрофотометре SpectraMax M5 с применением программы SoftMax pro 5.2) с возбуждением при 322 нм, испусканием при 431 нм (авто-предел при 420 нм).

- После измерения значение фоновой флуоресценции пустой лунки в 96-луночном планшете вычитают из каждой смеси проба/липид/буфер. Значения интенсивности флуоресценции затем нормализуют до значения при самом низком pH. Нормализованную интенсивность флуоресценции затем наносят на график к рН и проводят линию максимального соответствия.

- Находят точку на линии максимального соответствия, в которой нормализованная интенсивность флуоресценции равна 0,5. pH, соответствующий нормализованной интенсивности флуоресценции, равной 0,5, находят и считают pKa липида.

Наилучшие иммунологические результаты показаны для жиров, имеющих pKa в интервале от 5,0 до 7,6. В данном интервале pKa предпочтительные липиды имеют pKa от 5,5 до 6,7, например, от 5,6 до 6,8, от 5,6 до 6,3, от 5,6 до 6,0, от 5,5 до 6,2 или от 5,7 до 5,9.

Определенные соединения формулы (I)

Определенные соединения формулы (I), которые применяются в соответствии с данным изобретением, описаны в ссылке 8. Например, соединениями могут быть E0024, E0014, E0052, E0118, E0083, E0011, E0008, E0025, E0026, E0069, E0076, E0077, E0078, E0085 или E0088. Соединением могут быть липиды, показанные ниже, которые применяют в "RV03"-"RV12" липосомах, или в "RV15" липосомах. Предпочтительными соединениями являются E0026, E0069 и E0078. Предпочтительными соединениями являются липиды, показанные ниже, которые применяют в "RV05", "RV08" и "RV09" липосомах.

В альтернативном варианте, вместо применения соединения формулы (I), в липосоме в соответствии с данным изобретением применяется соединение "RV02" (структура показана ниже). За исключением этого замещения все другие аспекты таких RV02-содержащих липосом такие, как описаны здесь.

Формула (XI)