Очистка капсульных сахаридов staphylococcus aureus типа 5 и типа 8

Очистка капсульных сахаридов staphylococcus aureus типа 5 и типа 8

Иллюстрации

Показать все

Реферат

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США № 61/256905, поданной 30 октября 2009 года, полностью включенной в настоящий документ в виде ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области очистки бактериальных капсульных полисахаридов, в частности капсульных полисахаридов Staphylococcus aureus типа 5 и типа 8, и в частности для применения в получении вакцин.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Капсульные сахариды бактерий в течение многих лет используют в вакцинах против капсулированных бактерий. Хотя сахариды являются T-зависимыми антигенами, однако они являются слабо иммуногенными. Конъюгация с носителем может конвертировать T-независимые антигены в T-зависимые антигены, таким образом, усиливая вторичный иммунный ответ и обеспечивая развитие защитного иммунитета. Таким образом, наиболее эффективные сахаридные вакцины основаны на гликоконъюгатах, а прототипическую вакцину с конъюгатами получили против Haemophilus influenzae типа b ("Hib") [например, см. главу 14 ссылки 96].

Другая бактерия, для которой описаны вакцины с конъюгатами, представляет собой Staphylococcus aureus (S.aureus). Для применения в гликоконъюгатах из S.aureus выделены различные полисахариды. Двумя полисахаридами, представляющими особый интерес, являются капсульные полисахариды типа 5 и типа 8. Приблизительно 60% штаммов S.aureus человека являются типом 8, а приблизительно 30% являются типом 5. Множество исследований конъюгатов типа 5 и типа 8 проводили и описывали в документах, таких как ссылки 1-9, Fattom et al.

Отправной точкой для вакцины на основе полисахаридов является сам полисахарид, и, как правило, его очищают из заданных бактерий. Fattom et al. разработали сложный способ очистки капсульных полисахаридов типа 5 и типа 8, который подробно описан в ссылке 1, и включает следующие ключевые этапы после культивирования бактерий: суспендирование бактериальных клеток в буфере, обработку лизостафином, обработку ДНКазой и РНКазой, центрифугирование, диализ против буфера, обработку протеазой, дополнительный диализ, фильтрация, добавление этанола до 25% с хлоридом кальция для осаждения примесей; дополнительное добавление этанола до 75% для осаждения полисахаридов; сбор и сушку осадка; анионообменную хроматографию; диализ; лиофилизацию; эксклюзионную хроматографию; диализ и конечную лиофилизацию.

Способ Fattom для лизиса стенок бактериальных клеток и, таким образом, высвобождения капсульных полисахаридов включает использование лизостафина. Однако этот этап занимает много времени и делает способ сложным для масштабирования до промышленных условий. Он также увеличивает общую стоимость и сложность способа. Другие исследователи пытались пропустить этот этап и разработать более простой, более эффективный способ очистки полисахаридов. Например, в ссылке [10] описан альтернативный способ, включающий автоклавирование клеток S. aureus, ультрафильтрацию содержащего полисахариды супернатанта, концентрацию, лиофилизацию, обработку метаперйодатом натрия, дополнительную ультрафильтрацию, диафильтрацию, высокоэффективную жидкостную эксклюзионную хроматографию, диализ и лиофилизацию. Авторы предполагают, что этот способ обеспечивает хороший выход и подходит для производства полисахарида в крупном масштабе. В этом способе для высвобождения капсульных полисахаридов обработку лизостафином заменяют автоклавированием. Способ дополнительно развивали в ссылке [11]. Важным этапом в этих альтернативных способах является обработка метаперйодатом натрия. Этот этап проводят для удаления примесей тейхоевой кислотой в капсульных полисахаридах. Однако этот этап снова увеличивает длительность, сложность и общую стоимость способа. В ссылке [12] описан сходный способ, в котором включены автоклавирование для высвобождения капсульного полисахарида и обработка метаперйодатом натрия для удаления тейхоевой кислоты. В отличие от этого большинство других групп используют способы с сохранением обработки лизостафином (см., например, ссылки 13, 14, 15, 16, 17 и 18), иногда включая обработку метаперйодатом натрия (например, в ссылках 13 и 14).

Указанные выше способы являются сложными и могут оставлять примеси в получаемом полисахариде. Таким образом, сохраняется необходимость в дополнительных и улучшенных способах очистки капсульных полисахаридов S.aureus типа 5 и типа 8, и, в особенности, в менее сложных способах, приводящих к меньшему количеству примесей.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение основано на способе очистки, в котором полисахариды сначала выделяют из бактериальных клеток посредством обработки кислотой. Этот этап устраняет необходимость обработки лизостафином и его можно использовать в качестве альтернативы автоклавированию, как в указанных выше способах. Авторы изобретения выявили, что способ приводит к очищенным полисахаридам, с малым количеством примесей тейхоевой кислоты. Это означает отсутствие необходимости обработки полисахарида метаперйодатом натрия. В очищенных полисахаридах также мало примесей пептидогликанов, делая их особенно подходящими для медицинского применения. Способ авторов изобретения может являться быстрым и простым вследствие отсутствия необходимости в трудоемких этапов из ранее указанных способов.

Изобретение относится к способу выделения капсульных полисахаридов из клеток S. aureus типа 5 или типа 8, включающему этап обработки клеток кислотой. Изобретение дополнительно относится к способу очистки капсульных полисахаридов из клеток S. aureus типа 5 или типа 8, включающему этот способ. В способ можно включать другие этапы обработки, такие как, например, ферментативная обработка для удаления примесей нуклеиновых кислот, белков и/или пептидогликанов; диафильтрацию, например, для удаления высокомолекулярных примесей; анионообменную хроматографию, например, для удаления остаточного белка; и концентрирование.

Таким образом, изобретение относится к способу очистки капсульных полисахаридов S.aureus типа 5 или типа 8, включающему этап выделения полисахаридов из клеток S.aureus типа 5 или типа 8 посредством обработки клеток кислотой. Подобным образом, изобретение относится к способу очистки капсульных полисахаридов S.aureus типа 5 или типа 8, где улучшение заключается в использовании обработки клеток S.aureus типа 5 или типа 8 кислотой с выделением полисахаридов из клеток. Выделение при обработки кислотой устраняет необходимость в обработке лизостафином или автоклавировании для выделения полисахаридов.

Изобретение также относится к способу очистки капсульных полисахаридов S.aureus типа 5 или типа 8, где способ не включает этапа обработки лизостафином. Подобным образом, изобретение относится к способу очистки капсульных полисахаридов S.aureus типа 5 или типа 8, где способ не включает этапа обработки метаперйодатом натрия. Как правило, способ не включает один или оба из этих этапов.

Изобретение также относится к способу очистки капсульных полисахаридов S.aureus типа 5 или типа 8, где способ позволяет получать композицию, содержащую полисахариды и уровень примесей пептидогликанов, меньший 5% (например, ≤4%, ≤3%, ≤2%, ≤1% и т.д.) пептидогликана по массе относительно общей массы полисахаридов. Как правило, композиция содержит менее 4%, в частности - менее 3% пептидогликана по массе. Авторы изобретения выявили, что способами по изобретению можно получать уровни приблизительно 2% или даже приблизительно 1%. Авторы изобретения выявили, что композиции с этими уровнями пептидогликанов пригодны для производства вакцин. В отличие от этого, в ссылке 17 указано, что для этой цели следует использовать уровни выше 5%. Уровень примесей пептидогликанов можно измерять способами, описываемыми в настоящем документе.

Подобным образом, изобретение относится к способу очистки капсульных полисахаридов S.aureus типа 5 или типа 8, где способ позволяет получать композицию, содержащую полисахариды и уровень примесей белков, меньший 5% (например, ≤4%, ≤3%, ≤2%, ≤1%, ≤0,5% и т.д.) белков по массе относительно общей массы полисахаридов. Как правило, композиция содержит менее 3%, в частности - приблизительно 2,4% белков по массе. Уровень примесей белков можно измерять с использованием анализа MicroBCA (Pierce).

Изобретение также относится к способу очистки капсульных полисахаридов S.aureus типа 5 или типа 8, где способ позволяет получать композицию, содержащую полисахарид и уровень примесей нуклеиновых кислот, меньший 1% (например, ≤0,75%, ≤0,50%, ≤0,25%, ≤0,10%, ≤0,01% и т.д.) нуклеиновой кислоты по массе относительно общей массы полисахарида. Как правило, композиция содержит менее 0,25%, в частности - приблизительно 0,09% нуклеиновой кислоты по массе. Уровень примесей нуклеиновых кислот можно измерять по поглощению при 260 нм в спектрофотометре.

Изобретение также относится к способу очистки капсульных полисахаридов S. aureus типа 5 или типа 8, где (a) уровень примесей кислых пептидогликанов составляет менее 5% (как описано выше); (b) уровень примесей белков составляет менее 5% (как описано выше); (c) уровень примесей нуклеиновых кислот составляет менее 1% (как описано выше).

Изобретение также относится к композиции, содержащей капсульные полисахариды S. aureus типа 5 или типа 8, получаемые любым из способов по изобретению.

В частности, изобретение относится к композиции, содержащей капсульные полисахариды S. aureus типа 5 или типа 8, где композиция содержит уровень примесей пептидогликанов, меньший 5% (например, ≤4%, ≤3%, ≤2%, ≤1% и т.д.) пептидогликана по массе относительно общей массы полисахарида. Как правило, композиция содержит менее 3%, в частности - менее 2% пептидогликана по массе. По изобретению конкретно предоставлены композиции с уровнями приблизительно 2% или даже приблизительно 1%.

Подобным образом, изобретение относится к композиции, содержащей капсульные полисахариды S.aureus типа 5 или типа 8, где композиция содержит уровень примесей белков, меньший 5% (например, ≤4%, ≤3%, ≤2%, ≤1%, ≤0,5% и т.д.) белка по массе относительно общей массы полисахарида. Как правило, композиция содержит менее 3%, в частности - приблизительно 2,4% белка по массе.

Изобретение также относится к композиции, содержащей капсульные полисахариды S. aureus типа 5 или типа 8, где композиция содержит уровень примесей нуклеиновых кислот, меньший 1% (например, ≤0,75%, ≤0,50%, ≤0,25%, ≤0,10%, ≤0,01% и т.д.) нуклеиновой кислоты по массе относительно общей массы полисахарида. Как правило, композиция содержит менее 0,25%, в частности - приблизительно 0,09% нуклеиновой кислоты по массе.

Изобретение также относится к композиции, содержащей капсульные полисахариды S. aureus типа 5 или типа 8, где a), где уровень примесей кислых пептидогликанов составляет менее 5% (как описано выше); (b) уровень примесей белков составляет менее 5% (как описано выше); (c) уровень примесей нуклеиновых кислот составляет менее 1% (как описано выше).

Капсульные полисахариды

Изобретение основано на капсульных полисахаридах S. aureus типа 5 и типа 8. Структуры капсульных полисахаридов типа 5 и типа 8 описаны в ссылках 19 и 20 как:

Тип 5

→4)-β-D-ManNAcA(3OAc)-(1→4)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→

Тип 8

→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FueNAc(1→3)-β-D-FueNAc-(1→.

Недавние данных ЯМР-спектроскопии [21] привели к пересмотру этих структур на:

Тип 5

→4)-β-D-ManNAcA-(1→4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→

Тип 8

→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-α-D-FucNAc(1→.

После выделения из клеток полисахариды S.aureus типа 5 или типа 8 можно химически модифицировать относительно капсульных полисахаридов, находящихся в природе. Например, полисахарид может являться де-O-ацетилированным (частично или полностью), де-N-ацетилированным (частично или полностью), N-пропионированным (частично или полностью) и т.д. Деацетилирование можно проводить до, в течение или после других этапов обработки, но, как правило, его проводят перед любым этапом конъюгации. В зависимости от конкретного полисахарида, деацетилирование может влиять на иммуногенность или нет, например, в вакцине NeisVac-C™ используют де-O-ацетилированный полисахарид, тогда как Menjugate™ является ацетилированной, но обе вакцины являются эффективными. Эффект деацетилирования и т.д. можно оценивать посредством общепринятых анализов. Например, значимость O-ацетилирования для капсульных полисахаридов S.aureus типа 5 или типа 8 обсуждается в ссылке 6. Указано, что природные полисахариды в настоящем документе обладают 75% O-ацетилированием. Эти полисахариды индуцируют антитела к полисахаридному каркасу и к O-ацетильным группам. Полисахариды с 0% O-ацетилированием все еще индуцируют антитела к полисахаридному каркасу. Оба типа антител являются опсонизирующими против штаммов S.aureus различающихся по их содержанию O-ацетила. Таким образом, O-ацетилирование капсульных полисахаридов типа 5 или типа 8, используемых по настоящему изобретению, может составлять от 0 до 100%. Например, степень O-ацетилирования капсульного полисахарида типа 5 может составлять 10-100%, 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40-100%, 50-100%, 60-100%, 70-100%, 80-100%, 90-100%, 50- 90%, 60-90%, 70-90% или 80-90%. Альтернативно можно использовать капсульный полисахарид типа 5 O-ацетилированный на 0%. Подобным образом, степень O-ацетилирования капсульного полисахарида типа 8 может составлять 10-100%, 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40-100%, 50-100%, 60-100%, 70-100%, 80-100%, 90-100%, 50- 90%, 60-90%, 70-90% или 80-90%. Альтернативно можно использовать капсульный полисахарид типа 8 O-ацетилированный на 0%. В одном из вариантов осуществления степень O-ацетилирования капсульных полисахаридов типа 5 и типа 8 может составлять 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40-100%, 50-100%, 60-100%, 70-100%, 80-100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%, 70-90% или 80-90%. В других вариантах осуществления используют капсульные полисахариды типа 5 и типа 8 O-ацетилированные на 0%. степень N-ацетилирования капсульного полисахарида типа 5, используемого по изобретению, может составлять 0-100%, 50-100%, 75-100%, 80-100%, 90-100% или 95-100%. Как правило, степень N-ацетилирования капсульного полисахарида типа 5 составляет 100%. Подобным образом, степень N-ацетилирования капсульного полисахарида типа 8, используемого по изобретению, может составлять 0-100%, 50-100%, 75-100%, 80-100%, 90-100%, или 95-100%. Как правило, степень N-ацетилирования капсульного полисахарида типа 8 составляет 100%. В одном из вариантов осуществления степень N-ацетилирования капсульных полисахаридов типа 5 и типа 8 может составлять 0-100%, 50-100%, 75-100%, 80-100%, 90-100% или 95-100%. Как правило, степень N-ацетилирования капсульных полисахаридов типа 5 и типа 8 составляет 100%.

Степень O-ацетилирования полисахарида можно определять любым известным в данной области способом, например, посредством протонного ЯМР (например, как описано в ссылках 22, 23, 24 или 25). Дополнительный способ описан в ссылке 26. Подобные способы можно использовать для определения степени N-ацетилирования полисахарида. O-ацетильные группы можно удалять гидролизом, например, посредством обработки основанием, таким как безводный гидразин [27] или NaOH [6], Подобные способы можно использовать для удаления N-ацетильных групп. Для поддержания высоких уровней O-ацетилирования в капсульных полисахаридах типа 5 и/или 8, обработку, приводящую к гидролизу O-ацетильных групп, минимизируют, например, обработку при крайних значениях pH.

Исходное вещество

Способ по изобретению начинается с клеток S.aureus типа 5 или типа 8. Как правило, клетки перед выделением капсульного полисахарида выращивают посредством ферментации. Подходящие способы культивирования клеток S.aureus типа 5 или типа 8 хорошо известны специалистам и описаны, например, в ссылках 1-21 и в цитируемых в них ссылках. После выращивания клеток, клетки, как правило, дезактивируют. Подходящим способом дезактивации является обработка фенолом:этанолом, например, как описано в ссылке 1.

Клетки перед выделением капсульного полисахарида можно центрифугировать. Таким образом, способ начинается с клеток в форме сырой клеточной массы. Однако, как правило, клетки ресуспендируют в водной среде, подходящей для следующего этапа в способе, например, в буфере или в дистиллированной воде. Клетки перед ресуспендированием можно промывать этой средой. В другом варианте осуществления клетки можно обрабатывать в суспензии в их исходной среде для культивирования. Альтернативно клетки обрабатывают в сухой форме.

Обработка кислотой

В способе по изобретению клетки S.aureus типа 5 или типа 8 обрабатывают кислотой. Этот этап приводит к высвобождению капсульного полисахарида из клеток. В отличие от этого в предыдущих способах для выделения полисахаридов использовали обработку лизостафином или автоклавирование. Обработку кислотой по изобретению предпочтительно проводят с использованием умеренной кислоты, например, уксусной кислоты, для минимизации повреждения полисахаридов. Специалист может определить подходящие кислоты и условия (например, концентрацию, температуру и/или время) для выделения полисахаридов. Например, авторы изобретения выявили, что подходящей является обработка клеток, суспендированных приблизительно при 0,5 мг/мл в дистиллированной воде, 1% уксусной кислотой (об./об.) при 100°C в течение 2 часов. Также подходящей может являться обработка другими кислотами, например, трифторуксусной или другими органическими кислотами.

Эффективность обработки различными кислотами можно тестировать и использованием общепринятых способов. Например, после обработки кислотой клетки можно выделять и обрабатывать с применением известных способов выделения капсульных полисахаридов S.aureus типа 5 или типа 8 (например, способ на основе лизостафина по ссылке 1) с выявлением возможности выделения дополнительных капсульных полисахаридов. Если выделяют дополнительные капсульные полисахариды, тогда условия обработки кислотой можно изменять так, чтобы при обработке кислотой выделять большую долю капсульных сахаридов. Таким образом, можно оптимизировать условия обработки кислотой так, чтобы выделять оптимальное количество капсульных сахаридов. Например, авторы изобретения выявили, что после обработки клеток, суспендированных приблизительно при 0,5 мг/мл в дистиллированной воде, 1% уксусной кислотой (об./об.) при 100°C в течение 2 часов, из клеток при последующей обработке лизостафином можно выделить очень мало дополнительных капсульных сахаридов.

Авторы изобретения выявили, что после обработки кислотой, степень O-ацетилирования капсульного полисахарида типа 5 может составлять 60-100%. В частности, степень O-ацетилирования может составлять 65-95%, в частности - 70-90%. Как правило, степень O-ацетилирования составляет 75-85%, например, приблизительно 80%. Подобные значения можно получать для капсульного сахарида типа 8. При желании, затем степень O-ацетилирования капсульного сахарида можно изменять на дополнительных этапах обработки, как указано выше.

После обработки кислотой реакционную смесь, как правило, нейтрализуют. Этого можно достигать добавлением основания, например, NaOH. Клетки можно центрифугировать и содержащий полисахариды супернатант собирать для хранения и/или дополнительной обработки.

Ферментативная обработка

Полисахарид, получаемый после обработки кислотой, может быть загрязнен и смешан с бактериальными нуклеиновыми кислотами и белками. Эти примеси можно удалять ферментативной обработкой. Например, РНК можно удалять обработкой РНКазой, ДНК - ДНКазой, а белок - протеазой (например, проназой). Специалист может определить подходящие ферменты и условия для удаления примесей. Например, авторы изобретения выявили, что подходящей является обработка содержащего полисахариды супернатанта 50 мкг/мл каждой из ДНКазы и РНКазы при 37°C в течение 6-8 часов. Другие подходящие условия описаны в литературе, например, в ссылке 1.

Полисахарид, получаемый после обработки кислотой, может быть также или альтернативно смешан с пептидогликанами. Эту примесь также можно удалять ферментативной обработкой. Авторы изобретения выявили, что для удаления примеси пептидогликанов эффективной является обработка мутанолизином. Специалист может определить подходящие условия для удаления пептидогликанов мутанолизином. Например, авторы изобретения выявили, что подходящей является обработка содержащего полисахариды супернатанта 180 Ед/мл каждого из мутанолизинов при 37°C в течение 16 часов. После обработки суспензию можно очищать посредством центрифугирования, и содержащий полисахариды супернатант собирать для хранения и/или дополнительной обработки.

Диафильтрация

Способ по изобретению может включать этап диафильтрации. Как правило, этот этап проводят после обработки кислотой и/или ферментативной обработки, описанных выше. Авторы изобретения выявили, что этап диафильтрации, в частности посредством фильтрации тангенциальным потоком, является особенно эффективным для удаления загрязнений из полисахаридов. Как правило, загрязнения представляют собой низкомолекулярные примеси, подобные фрагментам тейхоевых кислот и/или пептидогликанов. Фильтрация тангенциальным потоком подходящим образом проводят против 1 М NaCl (например, приблизительно против 10 объемов), а затем 10 мМ pH 7,2 буфера NaPi (например, против дополнительных 10 объемов). Таким образом, фильтровальная мембрана должна представлять собой фильтровальную мембрану, обеспечивающую прохождение низкомолекулярных примесей при удерживании капсульных полисахаридов. Типичным является граница пропускания в диапазоне 10 кДа-30 кДа. Авторы изобретения выявили, что фильтрация тангенциальным потоком с использованием мембраны с границей пропускания 30 кДа является особенно подходящим для способов в крупном масштабе.

Как правило, проводят по меньшей мере 5 циклов диафильтрации тангенциальным потоком, например, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или более.

Содержащий полисахариды концентрат после диафильтрации собирают для хранения и/или дополнительной обработки.

Анионообменная хроматография

Полисахариды можно дополнительно очищать на этапе анионообменной хроматографии. Авторы изобретения выявили, что анионообменная хроматография является особенно эффективным для удаления остаточных примесей белков и нуклеиновых кислот при сохранении хорошего выхода полисахаридов.

Этап анионообменной хроматографии можно проводить после этапов обработки кислотой, ферментативной обработки и/или диафильтрации, описанных выше.

Анионообменную хроматография можно проводить с использованием любого подходящего анионообменного матрикса. Широко используемыми анионообменными матриксами являются смолы, такие как Q-смолы (на основе четвертичных аминов) и DEAE смолы (на основе диэтиламиноэтана). Авторы изобретения выявили, что особенно подходящими являются DEAE смолы (например, смола DEAE-Sepharose™ Fast Flow (GE Healthcare)), хотя можно использовать другие смолы.

Подходящие стартовые буферы и буферы подвижных фаз для анионообменной хроматографии также можно определять посредством общепринятых экспериментов без чрезмерного труда. Типичные буферы для применения в анионообменной хроматографии включают буферы с N-метилпиперазином, пиперазином, L-гистидином, бис-Tris, бис-Tris-пропаном, триэтаноламином, Tris, N-метилдиэтаноламином, диэтаноламином, 1,3-диаминопропаном, этаноламином, пиперидином, хлоридом натрия и фосфатные буферы. Авторы изобретения выявили, что в качестве стартового буфера для анионообменной хроматографии подходящими являются фосфатные буферы, например, натрийфосфатный буфер. Буфер может иметь любую подходящую концентрацию. Например, выявлено, что подходящим является 10 мМ фосфат натрия. Вещество, связываемое с анионообменной смолой можно элюировать подходящим буфером. Авторы изобретения выявили, что подходящим является градиент 1M NaCl.

Фракции элюата, содержащие полисахарид, можно определять, изменяя поглощение УФ при 215 нм. Фракции, содержащие полисахарид, как правило, комбинированные вместе, собирают для хранения и/или дополнительной обработки.

Этап анионообменной хроматографии можно повторять, например, 1, 2, 3, 4 или 5 раз. Как правило, этап анионообменной хроматографии проводят однократно.

Гель-фильтрация

Способ по изобретению может включать один или несколько этапов гель-фильтрации. Эту гель-фильтрацию применяют для отбора молекулы полисахаридов конкретной длины и для дополнительного снижения примесей, особенно белков. Однако авторы изобретения выявили, что в отличие от предыдущих способов, подобных способам, описанным в ссылках 1-9, этап гель-фильтрации для получения полисахаридов высокой чистоты не требуется. Таким образом, этот этап в способах по изобретению можно пропустить. Пропуск этого этапа является выгодным, так как это упрощает способ и снижает общую стоимость.

Когда он присутствует этап(ы) гель-фильтрации можно проводить после этапов обработки кислотой, ферментативной обработки, диафильтрации и/или анионообменной хроматографии, описанных выше. Как правило, любой этап(ы) гель-фильтрации проводят после этапа анионообменной хроматографии, описанного выше.

Этап(ы) гель-фильтрация можно проводить с использованием любого подходящего гель-фильтрационного матрикса. Широко используемые гель-фильтрационные матриксы основаны на декстрановых гелях, агарозных гелях, полиакриламидных гелях, полиакрилоилморфолиновых гелях и полистироловых гелях и т.д. Также можно использовать гели из сшитого декстрана и смешанные полиакриламидные/агарозные гели. Авторы изобретения выявили, что особенно подходящими являются декстрановые гели (например, гель сефакрил (Sephacryl™) S300 (GE Healthcare)), хотя можно использовать другие гели.

Подходящие буферы для подвижных фаз для гель-фильтрации можно определять посредством общепринятых экспериментов без чрезмерного труда. Типичные буферы для применения в гель-фильтрации включают буферы с N-метилпиперазином, пиперазином, L-гистидином, бис-Tris, бис-Tris-пропаном, триэтаноламином, Tris, N-метилдиэтаноламином, диэтаноламином, 1,3-диаминопропаном, этаноламином, пиперидином, хлоридом натрия и фосфатные буферы. Например, подходящими могут являться буферы с хлоридом натрия. Буфер может иметь любую подходящую концентрацию. Например, для подвижной фазы можно использовать 50 мМ хлорид натрия.

Фракции элюата, содержащие полисахарид, можно определять, изменяя поглощение УФ при 215 нм. Фракции, содержащие полисахарид, как правило, комбинированные вместе, собирают для хранения и/или дополнительной обработки.

Концентрирование

В дополнение к одному или нескольким этапам гель-фильтрации или вместо них способ по изобретению может включать один или несколько этапов концентрирования полисахаридов. Это концентрирование пригодно для получения образца с концентрацией, подходящей для любой последующей конъюгации полисахарида с молекулой-носителем, как описано ниже. Однако авторы изобретения выявили, что этот этап концентрирования для получения полисахарида высокой чистоты не требуется. Таким образом, этот этап в способах по изобретению можно пропустить.

Когда он присутствует, этап(ы) концентрирования можно проводить после этапов обработки кислотой, ферментативной обработки, диафильтрации, анионообменной хроматографии и/или гель-фильтрации, описанных выше. Как правило, любой этап(ы) концентрирования проводят после этапа анионообменной хроматографии, описанного выше. Если его используют в дополнение к этапу(ам) гель-фильтрация, описанному выше, этап(ы) концентрирования можно проводить до или после этапа(ов) гель-фильтрация, описанного выше. Однако как правило, этап(ы) концентрирования применяют вместо этапа(ов) гель-фильтрации.

Этап(ы) концентрирования можно проводить любым подходящим способом. Например, авторы изобретения выявили, что этапом(ы) концентрирования может являться этап(ы) диафильтрации, как описано выше, например, фильтрация тангенциальным потоком с использованием отделяющей 30 кДа мембраны. Например, можно использовать отделяющую 30 кДа мембрану Hydrosart™ (Sartorius) (с площадью мембраны 200 см²).

Концентрированный образец полисахарида собирают для хранения и/или дополнительной обработки.

Дополнительная обработка капсульного полисахарида

После очистки полисахарид можно дополнительно обрабатывать для удаления примесей. Это особенно важно в ситуациях, когда неприемлемы даже малейшие примеси (например, для получения вакцины для человека).

Молекулярную массу очищенных капсульных полисахаридов S.aureus типа 5 или типа 8 можно измерять посредством гель-фильтрации относительно пуллулановых стандартов, таких как пуллулановые стандарты доступные в Polymer Standard Service [28]. Как правило, очищенные полисахариды представляют собой смесь полисахаридов с массами в диапазоне значений. Для капсульного полисахарида типа 5, молекулярная масса очищенного полисахарида, как правило, составляет 2-3500 кДа, например, 10-2000 кДа, в частности - 20-1000 кДа, а более конкретно - 100-600 кДа. Подобным образом, для капсульного полисахарида типа 8 молекулярная масса очищенного полисахарида может составлять 2-3500 кДа, например, 10-2000 кДа, в частности - 20-1000 кДа, а более конкретно - 100-600 кДа.

Очищенный полисахарид можно деполимеризовывать с получением олигосахарида. Олигосахариды могут являться предпочтительными для применения в вакцинах. Деполимеризацию до олигосахарида можно проводить до или после любого из указанных выше этапов. Как правило, деполимеризацию проводят после анионообменной хроматографии, описанной выше. Если полисахарид после этой хроматографии концентрируют, тогда деполимеризацию, как правило, проводят после этого концентрирования. Когда композиция по изобретению содержит деполимеризованный полисахарид, предпочтительно, чтобы деполимеризация предшествовала любой конъюгации.

Полноразмерные полисахариды можно деполимеризовывать с получением более коротких фрагментов для применения по изобретению различными способами. Предпочтительно, используют способ, описанный в ссылке 29. Альтернативно можно использовать другие способы деполимеризации полисахаридов. Например, полисахариды можно нагревать или подвергать микрофлюидизации [30] или облучению ультразвуком [3]. Альтернативно можно использовать деполимеризацию посредством окисления-восстановления [31] или озонолиза [32].

Олигосахариды можно идентифицировать посредством хроматографии, например, эксклюзионной хроматографии. Продукты можно разделять по размерам для удаления коротких олигосахаридов. Этого можно достигать различными способами, например, гель-фильтрацией. Конкретные молекулярные массы можно измерять посредством гель-фильтрации относительно пуллулановых стандартов, таких как пуллулановые стандарты, доступные в Polymer Standard Service [33].

Если N-ацетильные группы в природных капсульных полисахаридах были де-N-ацетилированы, тогда способ по изобретению может включать этап ре-N-ацетилирования. Контролируемое ре-N-ацетилирование можно проводить подходящим способом с использованием, например, такого реагента как уксусный ангидрид (CH₃CO)₂O в 5% бикарбонате аммония [34].

Также можно проводить дополнительные этапы фильтрации, например, стерильной фильтрации.

Как правило, эти дополнительные этапы можно проводить при комнатной температуре.

Хранение

Препараты капсульных полисахаридов S.aureus типа 5 или типа 8 можно лиофилизировать, например, посредством лиофилизации в вакууме или замораживания в растворе (например, в виде элюата после конечного этапа концентрирования, если он включен), для хранения на любом этапе способа очистки. Таким образом, необходимости немедленного перенесения препарата из одного этапа способа в другой нет. Например, если препарат полисахарида необходимо очищать посредством диафильтрации, его до этой очистки можно лиофилизировать или замораживать в растворе. Подобным образом, полисахарид можно лиофилизировать или замораживать в растворе до этапа анионообменной хроматографии. Если препарат полисахарида необходимо очищать посредством гель-фильтрации, тогда его до этого этапа можно лиофилизировать или замораживать в растворе. Подобным образом, если препарат полисахарида необходимо концентрировать, тогда его до этого этапа можно лиофилизировать или замораживать в растворе. Лиофилизированный препарат перед дальнейшей обработкой восстанавливают в подходящем растворе. Подобным образом, замороженный раствор перед дальнейшей обработкой размораживают.

Очищенный полисахарид, получаемый способом по изобретению можно перерабатывать для хранения любым подходящим способом. Например, полисахарид можно лиофилизировать, как описано выше. Альтернативно, полисахарид можно хранить в водном растворе, как правило, при низкой температуре, например, при -20°C. Подходящим способом, полисахарид можно хранить в виде элюата после этапов анионообменной хроматографии, гель-фильтрации или концентрирования.

Конъюгация

Конечные очищенные капсульные полисахариды по изобретению можно использовать в качестве антигена без дополнительной модификации, например, для применения в диагностических анализах in vitro, для применения в иммунизации и т.д.

Однако с целью иммунизации предпочтительно конъюгировать полисахариды с молекулой-носителем, такой как белок. В основном, ковалентная конъюгация полисахаридов с носителями увеличивает иммуногенность полисахаридов, так как это преобразует их из T-независимых антигенов в T-зависимые антигены, таким образом, обеспечивая примирование для иммунологической памяти. Конъюгация особенно пригодна для педиатрических вакцин [например, ссылка 35] и представляет собой хорошо известный способ [например, рассмотренный в ссылках 36-44]. Таким образом, способы по изобретению могут включать дополнительный этап конъюгации очищенного полисахарида с молекулой-носителем.

О конъюгации капсульных полисахаридов S.aureus типа 5 и типа 8 существует множество публикаций, например, см. ссылки 1-9. Типичный способ, используемый для конъюгации в литературе, включает тиолирование очищенного полисахарида с использованием цистамина. Реакция основана на наличии в капсульных полисахаридах карбоксилатных групп. Эти группы реагируют с цистамином в присутствии карбодиимида, например, EDAC. Затем дериватизированный полисахарид конъюгируют с белком-носителем, таким как эндотоксин A Pseudomononas aeruginosa (ETA), как правило, посредством линкера [2]. Показано, что полученные, таким образом, вакцины с конъюгатами являются безопасными и иммуногенными у людей [5]. Другие исследователи проводили конъюгацию очищенных капсульных полисахаридов типа 5 и типа 8 посредством восстановительного аминирования [45 и 12]; связывания глутаральдегидом [45] или реакции гидроксильных групп полисахаридов с цианилирующими средствами, такими как CDAP [46] или циануровый трихлорид [11]. Предпочтительно используют способ, описанный в ссылке 29.

Предпочтительными белками-носителями являются бактериальные токсины, такие как дифтерийный или столбнячный токсины, или анатоксины или их мутанты. Авторы изобретения выявили, что подходящим является мутант дифтерийного токсина CRM 197 [47]. Для капсульных полисахаридов S.aureus типа 5 или типа 8 в качестве белков-носителей использовали экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa (ETA) и его нетоксический мутантный рекомбинантный экзопротеин A (rEPA) ([1] и [2]). Также использовали α-гемолизин S.aureus (α-токсин) ([45] и [48]), овальбумин [11] и сывороточный альбумин человека [12]. Эти носители можно использовать по настоящему изобретению.

Другие подходящие белки-носители включают белковый комплекс наружной мембраны N.meningitidis [49], синтетические пептиды [50,51], белки теплового шока [52,53], белки коклюша [54,55], цитокины [56], лимфокины [56], гормоны [56], факторы роста [56], сывороточный альбумин человека (как правило, рекомбинантый), искусственные белки, содержащие несколько CD4⁺ T-клеточных эпитопов человека из различных происходящих из патогенов антигенов [57], таких как N19 [58], белок D H.influenzae [59-61], белок PspA поверхности пневмококков [62], пневмолизин [63] или его нетоксические производные [64], захватывающие железо белки [65], токсин A или B C.difficile [66], белок GBS [67], белок GAS [68] и т.д.

Другие подходящие белки-носители включают белковые антигены S.aureus, например, белковые антигены S.aureus, указанные ниже.

Присоединение к носителю предпочтительно проводят посредством группы -NH₂, например, в боковой цепи остатка лизина в белке-носителе или остатка аргинина. Также присоединение можно п