Мультиспецифические антитела, аналоги антител, композиции и способы

Мультиспецифические антитела, аналоги антител, композиции и способы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США No. 61/267006, поданной 4 декабря 2009 г., и предварительной патентной заявки США No. 61/346566, поданной 20 мая 2010 г., полное содержание которых, таким образом, приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит список последовательностей, который подан в формате ASCII через EFS-Web, и полное содержание которого таким образом приведено в качестве ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 30 ноября 2010 г., названа P4377R1WO.txt и имеет размер 53549 байт.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Представлены мультиспецифические антитела, специфически связывающие по меньшей мере два различных эпитопа. Представлены также структурные варианты нативных антител (аналоги антител). Представлены также мультиспецифические антитела и аналоги антител с рядом видов биологической активности. Представлены мультиспецифические антитела - агонисты и антагонисты, и аналоги антител - агонисты и антагонисты. Представлены также мультиспецифические антитела и аналоги антител, конъюгированные с терапевтическими и/или диагностическими средствами, так же как мультиспецифические антитела и аналоги антител, конъюгированные со средствами для увеличения времени полужизни in vivo по сравнению с мультиспецифическими антителами и аналогами антител в отсутствие таких средств. Кроме того, представлены способы получения мультиспецифических антител и аналогов антител и композиций, содержащих мультиспецифические антитела и аналоги антител. Представлены также терапевтические, исследовательские и диагностические применения мультиспецифических антител и аналогов антител.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Моноклональные антитела обеспечивают новые лекарственные средства для лечения различных нарушений, включая злокачественные опухоли, иммунологические и неврологические нарушения, а также инфекционные заболевания. Newsome, B. W. et al., Br J Clin Pharmacol 66(1):6-19 (2008); Chames, P., et al., Br J Pharmacol 157(2):220-33 (2009); Dimitrov, D. S. et al., Methods Mol Biol 525: 1-27, xiii (2009). Эти лекарственные средства были успешными по меньшей мере, частично, из-за точного и сильного взаимодействия с белками-мишенями и уникальной специфичности, обеспечиваемых моноклональными антителами. Для относительно продолжительного времени полужизни и стабильности моноклональных антител in vivo, позволяющих желательные режимы дозирования и опосредованную клетками токсичность, можно задействовать Fc-область антитела (Tabrizi, M. A., et al., Drug Discov Today 11 (1-2):81-8 [2006]). В конкретных случаях терапевтические антитела использовали для блокирования клеточных сигналов посредством связывания и нейтрализации важных функциональных областей секретированных белков и белков поверхности клетки. Такие основные свойства моноклональных антител в настоящее время используют для разработки молекулярных лекарственных средств с механизмами действия, отличающимися по сравнению с общепринятыми антителами (Dimitrov, D. S. et al., Methods Mol Biol 525: 1-27, xiii [2009]). Такие конкретные способы находятся в клинической разработке и обладают многообещающими признаками (Chames, P., et al., Br J Pharmacol 157(2):220-33 [2009]).

Например, один способ включает специфическое для клеток нацеливание с использованием антител для доставки цитотоксических лекарственных средств к опухолям. Carter, P. J. et al., Cancer J 14(3): 154-69 (2008); Junutula, J. R., et al., Nat Biotechnol 26(8):925-32 (2008); Senter, P. D., Curr Opin Chem Biol 13(3):235-44 (2009). В этом случае, моноклональное антитело специфически направляет цитотоксические молекулы для нацеливания на клетки, таким образом, концентрируя высокую токсичность цитотоксической группы там, где необходима, в то же время минимизируя влияние на не являющиеся мишенью клетки. Такие конъюгаты антитело-лекарственное средство позволяют увеличение активности уничтожения клеток опухолей при сохранении окна дозирования, минимизирующего не направленную на мишень токсичность.

Другим примером является доставка функциональных комплексов, например, наночастиц, содержащих такие средства, как миРНК, и включающих моноклональные антитела на поверхности частиц для нацеливания. Schiffelers, R. M., et al., Nucleic Acids Res 32(19):el49 (2004); Vornlocher, H. P., Trends Mol Med 12(1): 1-3 (2006); Davis, M. E., Mol Pharm 6(3):659-68 (2009).

В другом способе используют бивалентную структуру антител для конструирования биспецифических молекул, связывающих две мишени одновременно (Fischer, N. et al., Pathobiology 74(1):3-14 [2007]). Биспецифические антитела предоставляют возможности для увеличения специфичности, расширения активности и использования новых механизмов действия, которых нельзя достичь с общепринятым моноклональным антителом. Drakeman, D. L., Expert Opin Investig Drugs 6(9): 1169-78 (1997); Kontermann, R. E., Acta Pharmacol Sin 26(1): 1-9 (2005); Marvin, J. S. et al., Acta Pharmacol Sin 26(6):649-58 (2005); Marvin, J. S., et al., Curr Opin Drug Discov Devel 9(2): 184-93 (2006); Shen, J., et al., J Biol Chem 281(16): 10706-14 (2006); Chames, P. et al., Curr Opin Drug Discov Devel 12(2):276-83 (2009). Показана эффективность в ряде применений перекрестного связывания двух различных рецепторов с использованием биспецифического антитела для ингибирования пути передачи сигнала. В одном примере, тирозинфосфатазу поверхности клеток рекрутировали в комплекс рецептора IgE для уменьшения активности фосфорилированного рецептора IgE (Jackman, et al., J. Biol. Chem. 285:20850-20859 (2010)). Этот способ являлся более эффективным, чем блокирование участка связывания лиганда, поскольку ингибирование передачи сигнала биспецифическим антителом происходило даже в присутствии высоких концентраций лиганда. Id.

Для использования биспецифических антител для рекрутирования цитотоксических T-клеток также показаны клинические возможности, когда активации T-клеток достигали вблизи клеток опухолей посредством связывающих биспецифическое антитело рецепторов одновременно на двух различных типах клеток. Bargou, R., E., et al., Science 321(5891):974-7 (2008); Shekhar, C.,Chem Biol 15(9): 877-8 (2008); Baeuerle, P. A., et al., Cancer Res 69(12):4941-4 (2009). По одному способу разработано биспецифическое антитело с одним плечом, связывающим FcγRIII, и другим, связывающим рецептор HER2, для терапии опухолей яичников и молочной железы со сверхэкспрессией антигена HER2. (Hseih-Ma et al. Cancer Research 52:6832-6839 [1992] и Weiner et al. Cancer Research 53:94-100 [1993]). Биспецифические антитела могут также опосредовать уничтожение посредством T-клеток. Как правило, биспецифические антитела связывают CD3 комплекс на T-клетках с опухолесвязанным антигеном. Полностью гуманизированное F(ab')₂ биспецифическое антитело, состоящее из анти-CD3, связанного с анти-p185^HER2, использовали для нацеливания T-клеток для уничтожения клеток опухолей со сверхэкспрессией рецептора HER2. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175(1):217 (1992). Биспецифические антитела тестировали в нескольких клинических исследованиях на ранней фазе с обнадеживающими результатами. В одном из исследований 12 пациентов с раком легкого, яичников или молочной железы лечили инфузиями активированных T-лимфоцитов, нацеленных с помощью биспецифического антитела анти-CD3/против опухоли (MOC31). deLeij et al. Bispecific Antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity, Romet-Lemonne, Fanger and Segal Eds., Lienhart (1991) p. 249. Нацеленные клетки индуцировали значительный локальный лизис клеток опухолей, умеренную воспалительную реакцию, но не токсические побочные эффекты или ответы против антител мыши.

Кроме того, биспецифические антитела можно использовать в лечении инфекционных заболеваний (например, для нацеливания эффекторных клеток на клетки, инфицированные вирусом, таким как HIV или вирус гриппа, или простейшими, такими как Toxoplasma gondii), использовать для доставки иммунотоксинов к клеткам опухолей, или для нацеливания иммунных комплексов на рецепторы поверхности клеток. См., например, Fanger et al., Crit. Rev. Immunol. 12: 101-124 (1992). Например, что касается инфекции HIV, Berg et al., PNAS (USA) 88:4723-4727 (1991) получили химеру биспецифическое антитело-иммуноадгезин, происходящую из CD4-IgG мыши. Эти авторы сконструировали тетрамерную молекулу, имеющую два плеча. Одно плечо было составлено из CD4, слитого с константным доменом тяжелой цепи антитела вместе с CD4, слитым с константным доменом легкой цепи антитела. Другое плечо было составлено из полной тяжелой цепи анти-CD3 антитела вместе с полной легкой цепью того же самого антитела. Посредством CD4-IgG плеча, эта биспецифическая молекула связывается с CD3 на поверхности цитотоксических T-клеток. Соприкосновение цитотоксических клеток и инфицированных HIV клеток приводит к специфическому уничтожению последних клеток.

Описан ряд способов для синтеза мультиспецифических антител, включая биспецифические антитела. Способы синтеза двухвалентных фрагментов антител описаны в WO 99/64460. Однако, многие из этих способов представляют множество проблем. Например, опубликованы трудности с экспрессией и крупномасштабной продукцией, стабильностью и временем полужизни in vivo, сворачиванием и агрегацией белка. Morimoto, K., et al., J Immunol Methods 224(l-2):43-50 (1999); Kriangkum, J., et al., Biomol Eng 18(2):31-40 (2001); Segal, D. M. и B. J. Bast (2001). «Production of bispecific antibodies». Curr Protoc Immunol Chapter 2:Unit 2 13; Graziano, R. F., et al., Methods Mol Biol 283:71-85 (2004); Kontermann, R. E., et al., Methods Mol Biol 248:227-42 (2004); Das, D., et al., Methods Mol Med 109:329-46 (2005); Fischer, N. et al., Pathobiology 74(1):3-14 (2007); Shen, J., et al., J Immunol Methods 318(l-2):65-74 (2007). Кроме того, многие из этих способов являются трудоемкими и требующими больших временных затрат, таким образом, ограничивая количество и разнообразие молекул, которые можно конструировать и скринировать по желательным видам активности. Способы, описанные в настоящем документе, направлены на эти проблемы, и способы, композиции, мультиспецифические антитела и аналоги антител, описанные в настоящем документе, предоставляют дополнительные преимущества.

Полное содержание всех процитированных в настоящем документе ссылок, включая патентные заявки и публикации, приведено в качестве ссылки для всех целей.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способы и композиции по изобретению основаны, по меньшей мере частично, на разработке способов надежной и воспроизводимой продукции мультиспецифических антител и аналогов антител высокой чистоты. В конкретных вариантах осуществления большое количество мультиспецифических или моноспецифических комбинаций можно легко получать и скринировать по желательным видам активности. В одном из аспектов представлены новые способы конструирования функции антитела на основании удивительного и неожиданного открытия, что структурные варианты нативных антител могут обладать широким спектром видов биологической активности, лежащих в диапазоне от сильного антагониста до сильного агониста с различными уровнями активности между ними. В другом аспекте с использованием способов, описанных в настоящем документе предоставлены мультиспецифические антитела и аналоги антител, полученные из предсуществующих исходных антител, обладающие новыми функциями, не связанными с исходными антителами. Способы и мультиспецифические антитела и аналоги антител, описанные в настоящем документе, предоставляют, по меньшей мере частично, новые способы продукции, скрининга, идентификации и разработки новых терапевтических и диагностических средств и исследовательских инструментов.

В одном из аспектов представлены способы синтеза мультиспецифического антитела, где проводят реакцию первого фрагмента антитела, полученного из первого исходного антитела, обладающего первой моноспецифичностью и свободной сульфгидрильной группой, с тио-реактивным кросслинкером для получения группы фрагмент антитела-кросслинкер, и где проводят реакцию группы фрагмент антитела-кросслинкер со вторым фрагментом антитела, полученным из второго исходного антитела, обладающего второй моноспецифичностью и свободной сульфгидрильной группой, для получения мультиспецифического антитела, и где первая моноспецифичность отличается от второй моноспецифичности. В конкретных вариантах осуществления первое исходное антитело выбрано из анти-Her1 и анти-Her2. В конкретных вариантах осуществления первое исходное антитело представляет собой анти-Her2, и второе исходное антитело представляет собой анти-Her1, или первое исходное антитело представляет собой анти-Her1, и второе исходное антитело представляет собой анти-Her2. В конкретных вариантах осуществления анти-Her2 выбрано из Герцептина® (трастузумаба) и 2C4 (пертузумаба). В конкретных вариантах осуществления первое исходное антитело представляет собой анти-Her2, и первый фрагмент антитела содержит последовательность легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO:1, 2, 3, 6 и 7, и/или последовательность тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO:4, 5 и 8. В конкретных вариантах осуществления анти-Her1 выбрано из D1-5 и C3-101. В конкретных вариантах осуществления первое исходное антитело представляет собой анти-Her1, и первый фрагмент антитела содержит последовательность легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO:18, 19, 21 и 22 и/или последовательность тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO:17 и 20. В конкретных вариантах осуществления анти-Her2 выбрано из трастузумаба и пертузумаба, и анти-Her1 выбрано из D1-5 и C3-101. В конкретных вариантах осуществления фрагмент антитела, полученный из анти-Her2, содержит последовательность легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO:1, 2, 3, 6 и 7, и/или последовательность тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO:4, 5, и 8; и фрагмент антитела, полученный из анти-Her1, содержит последовательность легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO:18, 19, 21 и 22, и/или последовательность тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO:17 и 20.

В следующем аспекте способов, описанных выше, первое исходное антитело выбрано из анти-FcγRIIb и анти-FcεRIα. В конкретных вариантах осуществления первое исходное антитело представляет собой анти-FcγRIIb, и второе исходное антитело представляет собой анти-FcεRIα, или первое исходное антитело представляет собой анти-FcεRIα, и второе исходное антитело представляет собой анти-FcγRIIb. В конкретных вариантах осуществления анти-FcγRIIb представляет собой 5A6. В конкретных вариантах осуществления первое исходное антитело представляет собой анти-FcγRIIb, и первый фрагмент антитела содержит последовательность легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO:11 и 12, и/или последовательность тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO:9 и 10. В конкретных вариантах осуществления анти-FcεRIα представляет собой 22E7. В конкретных вариантах осуществления первое исходное антитело представляет собой анти-FcεRIα, и первый фрагмент антитела содержит последовательность легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO:15 и 16, и/или последовательность тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO:13 и 14. В конкретных вариантах осуществления фрагмент антитела, полученный из анти-FcγRIIb, содержит последовательность легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO:11 и 12 и/или a последовательность тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO:9 и 10; и фрагмент антитела, полученный из анти-FcεRIα, содержит последовательность легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO:15 и 16, и/или последовательность тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO:13 и 14.

В другом аспекте тио-реактивный кросслинкер выбран из бис-малеимидогалогенидов, бис-алкилгалогенидов, пиридилдисульфидов, бис-ртутных солей, опосредованного 5-тио-2-нитробензойной кислотой перекрестного связывания и бис-тиосульфонатов. В одном варианте осуществления кросслинкер представляет собой бис-малеинимид. В конкретных вариантах осуществления первый фрагмент антитела и/или второй фрагмент антитела получены из сконструированного антитела с цистеиновыми заменами. В конкретных таких вариантах осуществления первый фрагмент антитела и/или вторые фрагменты антитела представляют собой тио-Fab. В конкретных вариантах осуществления сконструированное антитело с цистеиновыми заменами содержит цистеиновую замену в положении 110 или в положении 205 легкой цепи, где нумерация остатков присутствует в соответствии с системой нумерации EU. В конкретных вариантах осуществления сконструированное антитело с цистеиновыми заменами содержит цистеиновую замену в положении 118 или в положении 121 тяжелой цепи, где нумерация остатков присутствует в соответствии с системой нумерации EU. В конкретных вариантах осуществления первый фрагмент антитела и/или второй фрагмент антитела получен из нативного антитела, где нативное антитело расщепляют пепсином для получения F(ab')₂ фрагмента, где F(ab')₂ фрагмент очищают и обрабатывают восстанавливающим средством, а затем окисляющим средством в условиях, при которых переформируется дисульфидный мостик между тяжелой цепью и легкой цепью Fab, и остатки цистеина в шарнирной области остаются неокисленными.

В другом аспекте представлены способы синтеза аналога антитела, где проводят реакцию первого фрагмента антитела, обладающего свободной сульфгидрильной группой, с тио-реактивным кросслинкером для получения группы фрагмент антитела-кросслинкер, и где проводят реакцию группы фрагмент антитела-кросслинкер со вторым фрагментом антитела, обладающим свободной сульфгидрильной группой, для получения аналога антитела, и где первый фрагмент антитела и второй фрагмент антитела получены из одного исходного антитела. В конкретных вариантах осуществления аналог антитела обладает антигенсвязывающей областью, структурно отличающейся от антигенсвязывающей области исходного антитела. В конкретных вариантах осуществления исходное антитело выбрано из анти-Her1, анти-Her2, анти-FcεRIα и анти-FcγRIIb. В конкретных вариантах осуществления анти-Her2 выбрано из Герцептина® (трастузумаба) и 2C4 (пертузумаба). В конкретных вариантах осуществления исходное антитело представляет собой анти-Her2, и первый фрагмент антитела и второй фрагмент антитела содержат одинаковую последовательность легкой цепи, где последовательность легкой цепи выбрана из SEQ ID NO:1, 2, 3, 6 и 7, и/или одинаковую последовательность тяжелой цепи, где последовательность тяжелой цепи выбрана из SEQ ID NO:4, 5 и 8. В конкретных вариантах осуществления анти-Her1 выбрано из D1-5 и C3-101. В конкретных вариантах осуществления исходное антитело представляет собой анти-Her1, и первый фрагмент антитела и второй фрагмент антитела содержат одинаковую последовательность легкой цепи, где последовательность легкой цепи выбрана из SEQ ID NO:18, 19, 21 и 22, и/или одинаковую последовательность тяжелой цепи, где последовательность тяжелой цепи выбрана из SEQ ID NO:17 и 20. В конкретных вариантах осуществления анти-FcγRIIb представляет собой 5A6. В конкретных вариантах осуществления исходное антитело представляет собой анти-FcγRIIb, и первый фрагмент антитела и второй фрагмент антитела содержат одинаковую последовательность легкой цепи, где последовательность легкой цепи выбрана из SEQ ID NO:11 и 12 и/или одинаковую последовательность тяжелой цепи, где последовательность тяжелой цепи выбрана из SEQ ID NO:9 и 10. В конкретных вариантах осуществления анти-FcεRIα представляет собой 22E7. В конкретных вариантах осуществления исходное антитело представляет собой анти-FcεRIα, и первый фрагмент антитела и второй фрагмент антитела содержат одинаковую последовательность легкой цепи, где последовательность легкой цепи выбрана из SEQ ID NO:15 и 16, и/или одинаковую последовательность тяжелой цепи, где последовательность тяжелой цепи выбрана из SEQ ID NO:13 и 14. В конкретных вариантах осуществления исходное антитело представляет собой сконструированное антитело с цистеиновыми заменами. В конкретных вариантах осуществления исходное антитело представляет собой нативное антитело.

В следующем аспекте представлены способы синтеза мультиспецифического антитела или аналога антитела, как выше, где кросслинкер представляет собой модифицированный кросслинкер, содержащий защищенную SH-группу. В одном из вариантов осуществления модифицированный кросслинкер представляет собой бис-малеимидоацетилацетат (BMata). В конкретных вариантах осуществления проводят дополнительную реакцию мультиспецифического антитела или аналога антитела, содержащего модифицированный кросслинкер, со средством, содержащим функциональную группу. В конкретных вариантах осуществления средство выбрано из полиэтиленгликоля (PEG), альбуминсвязывающего пептида (ABP), флуоресцентной метки, средства для радиовизуализации, цитотоксического средства и миРНК. В конкретных вариантах осуществления проводят дополнительную реакцию мультиспецифического антитела или аналога антитела, содержащего модифицированный кросслинкер, с PEG. В конкретных вариантах осуществления PEG представляет собой PEG с mw 2000 (2K), PEG с mw 12000 (12K) или PEG с mw 20000 (20K).

В другом аспекте представлены способы синтеза панели мультиспецифических антител, где проводят реакцию первого фрагмента антитела, полученного из первого исходного антитела, обладающего первой моноспецифичностью и свободной сульфгидрильной группой, с тио-реактивным кросслинкером для получения группы фрагмент антитела-кросслинкер, и где проводят реакцию группы фрагмент антитела-кросслинкер попарно с каждым из двух или более дополнительных фрагментов антител, полученных из одного или нескольких исходных антител с моноспецифичностью, отличной от первого исходного антитела, каждый из которых имеет свободную сульфгидрильную группу, для получения панели мультиспецифических антител. В конкретных вариантах осуществления проводят реакцию группы фрагмент антитела-кросслинкер попарно с каждым из трех или более дополнительных фрагментов антител, или с каждым из четырех или более дополнительных фрагментов антител, или с каждым из пяти или более дополнительных фрагментов антител, или с каждым из десяти или более дополнительных фрагментов антител, или с каждым из 15 или более дополнительных фрагментов антител, или с каждым из 20 или более дополнительных фрагментов антител, или с каждым из 25 или более дополнительных фрагментов антител, или с каждым из 50 или более дополнительных фрагментов антител, или с каждым из 100 или более дополнительных фрагментов антител, в каждом случае полученными из одного или нескольких исходных антител, или двух или более исходных антител, или трех или более исходных антител, или четырех или более исходных антител, или пяти или более исходных антител, или десяти или более исходных антител, или 15 или более исходных антител, или 20 или более исходных антител, или 25 или более исходных антител, или 50 или более исходных антител, или 100 или более исходных антител, в каждом случае с моноспецифичностью, отличной от первого исходного антитела. В конкретных вариантах осуществления первое исходное антитело выбрано из анти-Her1, анти-Her2, анти-FcεRIα и анти-FcγRIIb. В конкретных вариантах осуществления первый фрагмент антитела получен из анти-Her2, и каждый из двух или более дополнительных фрагментов антител получен из анти-Her1, или первый фрагмент антитела получен из анти-Her1, и каждый из двух или более дополнительных фрагментов антител получен из анти-Her2, или первый фрагмент антитела получен из анти-FcεRIα, и каждый из двух или более дополнительных фрагментов антител получен из анти-FcγRIIb, или первый фрагмент антитела получен из анти-FcγRIIb, и каждый из двух или более дополнительных фрагментов антител получен из анти-FcεRIα. В конкретных вариантах осуществления анти-Her2 выбран из Герцептина® (трастузумаба) и 2C4 (пертузумаба). В конкретных вариантах осуществления анти-Her1 выбран из D1-5 и C3-101. В конкретных вариантах осуществления анти-Her2 выбран из трастузумаба и пертузумаба, и анти-Her1 выбран из D1-5 и C3-101. В конкретных вариантах осуществления анти-FcγRIIb представляет собой 5A6. В конкретных вариантах осуществления анти-FcεRIα представляет собой 22E7. В конкретных вариантах осуществления анти-FcγRIIb представляет собой 5A6, и анти-FcεRIα представляет собой 22E7. В конкретных вариантах осуществления тио-реактивный кросслинкер выбран из бис-малеимидогалогенидов, бис-алкилгалогенидов, пиридилдисульфидов, бис-ртутных солей, опосредованного 5-тио-2-нитробензойной кислотой перекрестного связывания и бис-тиосульфонатов. В одном варианте осуществления тио-реактивный кросслинкер представляет собой бис-малеинимид. В конкретных вариантах осуществления, первый фрагмент антитела и/или каждый из двух или более дополнительных фрагментов антител получены из сконструированного антитела с цистеиновыми заменами. В конкретных таких вариантах осуществления сконструированное антитело с цистеиновыми заменами содержит замену в положении 110 или в положении 205 легкой цепи, где нумерация остатков присутствует в соответствии с системой нумерации EU, и где замена представляет собой цистеин. В конкретных вариантах осуществления сконструированное антитело с цистеиновыми заменами содержит замену в положении 118 или в положении 121 тяжелой цепи, где нумерация остатков присутствует в соответствии с системой нумерации EU, и где замена представляет собой цистеин.

В другом аспекте представлены способы синтеза панели аналогов антител, где проводят реакцию первого фрагмента антитела, обладающего свободной сульфгидрильной группой, с тио-реактивным кросслинкером для получения группы фрагмент антитела-кросслинкер, и где проводят реакцию группы фрагмент антитела-кросслинкер попарно с каждым из двух или более дополнительных фрагментов антител, каждый из которых имеет свободную сульфгидрильную группу, для получения панели аналогов антител, где каждый из фрагментов антител получен из одного и того же исходного антитела. В конкретных вариантах осуществления проводят реакцию группы фрагмент антитела-кросслинкер попарно с каждым из трех или более дополнительных фрагментов антител, или с каждым из четырех или более дополнительных фрагментов антител, или с каждым из пяти или более дополнительных фрагментов антител, или с каждым из десяти или более дополнительных фрагментов антител, или с каждым из 15 или более дополнительных фрагментов антител, или с каждым из 20 или более дополнительных фрагментов антител, или с каждым из 25 или более дополнительных фрагментов антител, или с каждым из 50 или более дополнительных фрагментов антител, где каждый из фрагментов антител получен из одного и того же исходного антитела. В конкретных вариантах осуществления один или несколько аналогов антител из панели обладают антигенсвязывающей областью, структурно отличающейся от антигенсвязывающей области исходного антитела. В конкретных вариантах осуществления исходное антитело выбрано из анти-Her1, анти-Her2, анти-FcεRIα и анти-FcγRIIb. В конкретных вариантах осуществления анти-Her2 выбрано из трастузумаба и пертузумаба. В конкретных вариантах осуществления анти-Her1 выбрано из D1-5 и C3-101. В конкретных вариантах осуществления анти-FcγRIIb представляет собой 5A6. В конкретных вариантах осуществления анти-FcεRIα представляет собой 22E7. В конкретных вариантах осуществления тио-реактивный кросслинкер выбран из бис-малеимидогалогенидов, бис-алкилгалогенидов, пиридилдисульфидов, бис-ртутных солей, опосредованного 5-тио-2-нитробензойной кислотой перекрестного связывания и бис-тиосульфонатов. В одном из вариантов осуществления тио-реактивный кросслинкер представляет собой бис-малеинимид. В конкретных вариантах осуществления исходное антитело представляет собой сконструированное антитело с цистеиновыми заменами. В конкретных вариантах осуществления сконструированное антитело с цистеиновыми заменами содержит замену в положении 110 или в положении 205 легкой цепи, где нумерация остатков присутствует в соответствии с системой нумерации EU, и где замена представляет собой цистеин. В конкретных вариантах осуществления сконструированное антитело с цистеиновыми заменами содержит замену в положении 118 или в положении 121 тяжелой цепи, где нумерация остатков присутствует в соответствии с системой нумерации EU, и где замена представляет собой цистеин.

В следующем аспекте представлено мультиспецифическое антитело, синтензированное способом, включающим реакцию первого фрагмента антитела, полученного из первого исходного антитела, обладающего первой моноспецифичностью и свободной сульфгидрильной группой, с тио-реактивным кросслинкером для получения группы фрагмент антитела-кросслинкер, и затем реакцию группы фрагмент антитела-кросслинкер со вторым фрагментом антитела, полученным из второго исходного антитела, обладающего второй моноспецифичностью и свободной сульфгидрильной группой, для получения мультиспецифического антитела, и где первая моноспецифичность отличается от второй моноспецифичности. В конкретных вариантах осуществления первое исходное антитело выбрано из анти-Her1 и анти-Her2. В конкретных вариантах осуществления первое исходное антитело представляет собой анти-Her2, и второе исходное антитело представляет собой анти-Her1, или первое исходное антитело представляет собой анти-Her1, и второе исходное антитело представляет собой анти-Her2. В конкретных вариантах осуществления анти-Her2 выбрано из Герцептина® (трастузумаба) и 2C4 (пертузумаба). В конкретных вариантах осуществления первое исходное антитело представляет собой анти-Her2, и первый фрагмент антитела содержит последовательность легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO:1, 2, 3, 6 и 7, и/или последовательность тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO:4, 5 и 8. В конкретных вариантах осуществления анти-Her1 выбран из D1-5 и C3-101. В конкретных вариантах осуществления первое исходное антитело представляет собой анти-Her1, и первый фрагмент антитела содержит последовательность легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO:18, 19, 21 и 22, и/или последовательность тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO:17 и 20. В конкретных вариантах осуществления анти-Her2 выбран из трастузумаба и пертузумаба, и анти-Her1 выбрано из D1-5 и C3-101. В конкретных вариантах осуществления фрагмент антитела, полученный из анти-Her2, содержит последовательность легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO:1, 2, 3, 6 и 7, и/или последовательность тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO:4, 5 и 8; и фрагмент антитела, полученный из анти-Her1, содержит последовательность легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO:18, 19, 21 и 22, и/или последовательность тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO:17 и 20.

В следующем аспекте мультиспецифических антител, описанных выше, первое исходное антитело выбрано из анти-FcγRIIb и анти-FcεRIα. В конкретных вариантах осуществления первое исходное антитело представляет собой анти-FcγRIIb, и второе исходное антитело представляет собой анти-FcεRIα, или первое исходное антитело представляет собой анти-FcεRIα, и второе исходное антитело представляет собой анти-FcγRIIb. В конкретных вариантах осуществления, анти-FcγRIIb представляет собой 5A6. В конкретных вариантах осуществления первое исходное антитело представляет собой анти-FcγRIIb, и первый фрагмент антитела содержит последовательность легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO:11 и 12, и/или последовательность тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO:9 и 10. В конкретных вариантах осуществления анти-FcεRIα представляет собой 22E7. В конкретных вариантах осуществления первое исходное антитело представляет собой анти-FcεRIα, и первый фрагмент антитела содержит последовательность легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO:15 и 16, и/или последовательность тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO:13 и 14. В конкретных вариантах осуществления фрагмент антитела, полученный из анти-FcγRIIb, содержит последовательность легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO:11 и 12, и/или последовательность тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO:9 и 10; и фрагмент антитела, полученный из анти-FcεRIα, содержит последовательность легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO:15 и 16, и/или последовательность тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO:13 и 14.

В дополнительном аспекте представлено мультиспецифическое антитело, синтезированное способом, как описано выше, где первое исходное антитело специфически связывает мишень на T-клетке, и второе исходное антитело специфически связывает мишень на клетке опухоли. В конкретных вариантах осуществления первое исходное антитело представляет собой анти-CD3, и второе исходное антитело выбрано из анти-BLR1, анти-BR3, анти-CD19, анти-CD20, анти-CD22, анти-CD72, анти-CD79A, анти-CD79B, анти-CD180, анти-CR2, анти-FCER2, анти-FcRH1, анти-FcRH2, анти-FcRH5, анти-FCRL4, анти-Her2, анти-HLA-DOB, и анти-NAG14. В одном из вариантов осуществления первое исходное антитело представляет собой анти-CD3 и второе исходное антитело представляет собой анти-CD 19. В одном из вариантов осуществления первое исходное антитело представляет собой анти-CD3 и второе исходное антитело представляет собой анти-CD20. В одном из вариантов осуществления первое исходное антитело представляет собой анти-CD3, и второе исходное антитело представляет собой анти-CD22. В одном варианте осуществления первое исходное антитело представляет собой анти-CD3, и второе исходное антитело представляет собой анти-FcRH5. В одном варианте осуществления первое исходное антитело представляет собой анти-CD3, и второе исходное антитело представляет собой анти-Her2. В конкретных вариантах осуществления мультиспецифическое антитело обладает полиэпитопной специфичностью. В конкретных вариантах осуществления мультиспецифическое антитело обладает одним или несколькими видами биологической активности, неотличимыми от активности каждого из исходных антител. В конкретных вариантах осуществления мультиспецифическое антитело обладает одним или несколькими видами биологической активности, отличными от активности по меньшей мере одного из исходных антител.

В другом аспекте представлен аналог антитела, синтезированный способом, включающим реакцию первого фрагмента антитела, обладающего свободной сульфгидрильной группой, с тио-реактивным кросслинкером для получения группы фрагмент антитела-кросслинкер, и затем реакцию группы фрагмент антитела-кросслинкер со вторым фрагментом антитела, обладающим свободной сульфгидрильной группой, для получения аналога антитела, и где первый фрагмент антитела и второй фрагмент антитела получены из одного исходного антитела. В конкретных вариантах осуществления исходное антитело выбрано из анти-Her1, анти-Her2, анти-FcεRIα и анти-FcγRIIb. В конкретных вариантах осуществления анти-Her2 выбран из Герцептина® (трастузумаба) и 2C4 (пертузумаба). В конкретных вариантах осуществления исходное антитело представляет собой анти-Her2, и первый фрагмент антитела и второй фрагмент антитела содержат одинаковую последовательность легкой цепи, где последовательность легкой цепи выбрана из SEQ ID NO:1, 2, 3, 6 и 7, и/или одинаковую последовательность тяжелой цепи, где последовательность тяжелой цепи выбрана из SEQ ID NO:4, 5 и 8. В конкретных вариантах осуществления анти-Her1 выбран из D1-5 и C3-101. В конкретных вариантах осуществления исходное антитело представляет собой анти-Her1, и первый фрагмент антитела и второй фрагмент антитела содержат одинаковую последовательность легкой цепи, где последовательность легкой цепи выбрана из SEQ ID NO:18, 19, 21 и 22, и/или одинаковую последовательность тяжелой цепи, где последовательность тяжелой цепи выбрана из SEQ ID NO:17 и 20. В конкретных вариантах осуществления анти-FcγRIIb представляет собой 5A6. В конкретных вариантах осуществления исходное антитело представляет собой анти-FcγRIIb, и первый фрагмент антитела и второй фрагмент антитела содержат одинаковую последовательность легкой цепи, где последовательность легкой цепи выбрана из SEQ ID NO:11 и 12, и/или одинаковую последовательность тяжелой цепи, где последовательность тяжелой цепи выбрана из SEQ ID NO:9 и 10. В конкретных вариантах осуществления анти-FcεRIα представляет собой 22E7. В конкретных вариантах осуществления исходное антитело представляет собой анти-FcεRIα, и первый фрагмент антитела и второй фрагмент антитела содержат одинаковую последовательность легкой цепи, где последовательность легкой цепи выбрана из SEQ ID NO:15 и 16, и/или одинаковую последовательность тяжелой цепи, где последовательность тяжелой цепи выбрана из SEQ ID NO:13 и 14. В конкретных вариантах осуществления исходное антитело представляет собой сконструированное антитело с цистеиновыми заменами. В конкретных вариантах осуществления исходное антитело представляет собой нативное антитело. В конкретных вариантах осуществления аналог антитела обладает одним или несколькими видами биологической активности, неотличимыми от активности исходного антитела. В конкретных вариантах осуществления аналог антитела обладает одним или несколькими видами биологической активности, отличными от активности исходного антитела. В конкретных вариантах осуществления биологическая активность представляет собой пролиферацию клеток. В конкретных вариантах осуществления аналог антитела представляет собой антагонист Her2-экспрессирующих клеток, и исходное антитело представляет собой Герцептин® (трастузумаб). В конкретных таких вариантах осуществления аналог антитела выбран из бис-Fab 1324, бис-Fab 1328, и бис-Fab 1329. В конкретных вариантах осуществления биологическая активность аналога антитела является антагонистической, и биологическая активность исходного антитела является агонистическо