Антитела, связывающие il-4 и/или il-13, и их применение

Антитела, связывающие il-4 и/или il-13, и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым антителам анти-IL-4, антителам анти-IL-13 и биспецифическим антителам анти-IL-4/анти-IL-13 и к их применению для улучшения состояния, лечения или профилактики заболеваний или расстройств у млекопитающих, включая человека, вызванных аномальной активностью или аномальным метаболизмом IL-4 и (или) IL-13. Рассматриваемое антитело может блокировать связывание и (или) передачу сигнала лиганда, например IL-4 или IL-13, с рецептором или комплексом рецептора, например IL-4Rα, IL-13Rα1 и IL-13Rα2. Раскрывается информация о профилактических, иммунотерапевтических и диагностических препаратах, содержащих рассматриваемые антитела, и их применение в рамках методов профилактики или лечения таких заболеваний млекопитающих, включая человека, которые вызваны аномальным метаболизмом и (или) активностью лимфоидных и нелимфоидных клеток, включая моноциты, фибробласты и эндотелиальные клетки. К таким заболеваниям относятся аутоиммунные болезни, а также болезни, вызванные или характеризующиеся воспалительными процессами, например аллергическая астма и дерматит.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Интерлейкин-4 (IL-4) является плейотропным цитокином, который обладает широким спектром биологических воздействий на лимфоидные В- и Т-клетки, а также многие нелимфоидные клетки, в том числе моноциты, эндотелиальные клетки и фибробласты. Например, IL-4 стимулирует пролиферацию нескольких линий клеток, зависимых от IL-2 и IL-3, индуцирует экспрессию молекул II класса главного комплекса гистосовместимости в дремлющих В-клетках и усиливает секрецию IgG4 и IgE В-клетками человека. IL-4 связан с иммунным ответом Th2-типа и продуцируется Th2-клетками, а также стимулирует их дифференциацию. Предполагается, что IL-4 проявляется в ряде таких заболеваний, как аллергия и астма.

Недавно был идентифицирован цитокин IL-13 (Minty, A. et al., Nature, 1993, 362, 248-250, и McKenzie, A. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1993, 90, 3735-3739), содержащий 112 аминокислот, который выделяется активированными Т-лимфоцитами, В-лимфоцитами, а также мастоцитами, после их активации.

На основании своих разнообразных биологических свойств, сходных с IL-4, IL-13 был отнесен к IL-4-подобным цитокинам. Его функции, действительно, похожи на функции IL-4 в отношении В-клеток (Defrance, T. et al., J. Exp. Med., 1994, 179, 135-143, Punnonen, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1993, 90, 3730-3734, Fior, R. et al., Eur. Cytokine Network, 1994, 5, 593-600), моноцитов (Muzio, M. R. F. et al., Blood, 1994, 83, 1738-1743, De Waal Malefyt, R. et al., J. Immunol, 1993, 151, 6370-6381, Doyle, A. et al., Eur. J. Immunol. 1994, 24, 1441-1445, Montaner, L. J. et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 743-747, Sozzani, P. et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 5084-5088) и других негематопоэтических клеток (Herbert, J. M. et al., Febs Lett., 1993, 328, 268-270, и Derocq, J. M. et al., Febs Lett. 1994, 343, 32-36). С другой стороны, в отличие от IL-4 он не оказывает специфического воздействия на дремлющие или активированные Т-клетки (Zurawuki, G. et al., Immunol. Today, 1994, 15, 19-26).

Различные проявления биологической активности IL-13 в отношении моноцитов/макрофагов, В-лимфоцитов и определенных гематопоэтических предшественников подробно описаны в работах A. J. Minty, а также в обзорах по IL-13. Кроме того, ряд данных свидетельствует о том, что данный цитокин оказывает плейотропный эффект на клетки других типов. К таким негематопоэтическим клеткам, на которые IL-13 оказывает прямое воздействие, относятся эндотелиальные и микроглиальные клетки, кератиноциты, а также клетки карциномы почек и толстой кишки.

Один из этапов анализа сигнала, передаваемого биологической молекулой внутри клетки, предусматривает идентификацию ее мембранного рецептора. Исследования, проведенные в этих целях для рецептора IL-13, показали, что IL-13 и IL-4 имеют общий рецептор или по крайней мере некоторые из компонентов общего рецепторного комплекса, а также общие элементы цепи передачи сигнала (Zurawski S. M. et al., Embo Journal, 1993, 12, 2663-2670, Aversa, G. et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 2213-2218, Vita, N. et al., Biol. Chem., 1995, 270, 3512-3517, Lefort, S. et al., Febs Lett., 1995, 366, 122-126). Данный рецептор присутствует на поверхности различных видов клеток в различных количествах в зависимости от рассматриваемого типа клетки. Сравнительное распределение рецепторов IL-13 и IL-4 рассматривалось в работах A. J. Minty (Interleukin-13 for Cytokines in Health and Disease. Eds D. G. Remick and J. S. Frie, Marcel Decker, N.Y. 1996).

Рецепторы клеточной поверхности и рецепторные комплексы связывают IL-4 и/или IL- 13 с различной аффинностью. К основным компонентам рецепторов и рецепторных комплексов, которые связывают IL-4 и/или IL-13, относятся IL-4Rα, IL-13Rα1 и IL-13Rα2. Эти цепи экспрессируются на поверхности клеток как мономеры или гетеродимеры IL-4Rα/IL-13Rα1 (II тип IL-4R) или IL-4Rα/γc (I тип IL-4R). Мономер IL-4Rα и гетеродимер IL-4Rα/γc связывают IL-4, но не связывают IL-13. Мономеры IL-13Rα1 и IL-13Rα2 связывают IL-13, но не связывают IL-4. Гетеродимер IL-4Rα/IL-13Rα1 связывает и IL-4, и IL-13 (Murata et al., Int. J. Hematol., 1999, 69, 13-20).

Иммунные ответы Th2-типа стимулируют продукцию антител и гуморальный иммунитет и развиваются для противодействия внеклеточным патогенам. Клетки Th2 являются медиаторами продукции Ig (гуморальный иммунитет) и продуцируют IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 и IL-13 (Tanaka, et, al., Cytokine Regulation of Humoral Immunity, 251- 272, Snapper, ed., John Wiley and Sons, New York (1996)). Иммунные ответы Th2-типа характеризуются генерацией определенных цитокинов (например IL-4, IL-13) и специфичных типов антител (IgE, IgG4) и типичны для аллергических реакций, результатом которых могут стать слезящиеся глаза и астматические симптомы, например воспаление дыхательных путей и сокращение мышечных клеток дыхательных путей в легких.

И IL-4, и IL-13 являются терапевтически важными цитокинами, что определяется их биологическими функциями, и играют важную роль во многих заболеваниях, в том числе при астме (Curr Opin Allergy Clin Immunol 2005, Vo. 5, 161-166). Было показано, что IL-4 в состоянии ингибировать аутоиммунные заболевания, и продемонстрировано, что IL-4 и IL-13 обладают потенциалом усиливать противоопухолевый иммунный ответ. Поскольку оба цитокина задействованы в патогенезе аллергических заболеваний, ингибиторы таких цитокинов могут обладать положительным терапевтическим эффектом.

Поэтому существует потребность в усовершенствованных агентах, которые ингибируют IL-4, ингибируют IL-13, а также агентах, которые ингибируют и IL-4, и IL-13.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предлагаются новые гуманизированные моноклональные и биспецифические антитела, а также их фрагменты и производные, которые специфическим образом связываются с IL-4 и (или) IL-13. Некоторые из моно- или биспецифических антител анти-IL-4 и (или) IL-13 и их фрагменты могут быть изменены, с тем чтобы воспрепятствовать образованию внутрицепьевой дисульфидной связи, что приводит к образованию молекулы, которая сохраняет стабильность в процессе получения и использования in vivo. Антитела по настоящему изобретению нейтрализуют активность IL-4 и (или) IL-13 в биологических анализах, которые описаны в настоящем документе.

Изобретение включает аминокислотные последовательности вариабельной тяжелой и легкой цепи антител и соответствующие им последовательности нуклеиновых кислот.

Другой пример осуществления настоящего изобретения включает клеточные линии и векторы, содержащие последовательности антител настоящего изобретения.

Еще один пример осуществления настоящего изобретения предполагает использование антител для приготовления фармацевтического препарата для лечения заболеваний и нарушений, связанных с функцией и метаболизмом IL-4 и (или) IL-13. В частности, настоящее изобретение относится к лечению рака, аутоиммунных заболеваний и болезней, вызванных или характеризующихся воспалительными процессами, например аллергической астмы и дерматита.

Дополнительные особенности и преимущества описаны в настоящем документе и будут очевидны из приведенного ниже полного описания изобретения и фигур.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг. 1 представлено схематическое изображение молекулы биспецифического антитела анти-IL-4/IL-13, содержащей четыре полипептидные цепи. Две более легкие цепи содержат N-VL_hB-B13-линкер-VL_h8D4-8-CL-C (CL, константная область легкой цепи), две более тяжелые цепи содержат N-VH_hB-B13-линкер-VH_h8D4-8-CH1-CH2-CH3-C. Линкерная последовательность (G4S)₂ представлена GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:6).

На фиг. 2 приводятся аминокислотные последовательности гуманизированных вариабельных доменов антитела B-B13 анти-IL-13 (SEQ ID NO:1 и 2) и гуманизированных вариабельных доменов антитела 8D4-8 анти-IL-4 (SEQ ID NO:3, 4 и 5). Подчеркиванием выделены внесенные изменения в аминокислотную последовательность. Полужирным шрифтом выделена CDR.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение не ограничивается конкретной методологией, протоколами, клеточными линиями, векторами или реагентами, описанными в настоящем документе, поскольку их можно менять, не затрагивая при этом основной идеи и охвата изобретения. Далее, используемая в настоящем документе терминология предназначена исключительно для описания конкретных осуществлений и не подразумевает ограничения сферы охвата настоящего изобретения. Если не указано иное, все технические и научные термины и сокращения, используемые в настоящем документе, имеют такое же значение, которое общеизвестно рядовым специалистам в данной области, к которой относится настоящее изобретение. Любые методы и материалы, аналогичные или идентичные описанным в настоящем документе, могут использоваться в практическом применении настоящего изобретения, и ниже приводится описание только примеров методов, устройств и материалов.

Все публикации и патенты, упоминаемые в настоящем документе, включаются в настоящий документ в силу ссылки на них для целей описания и раскрытия приводимых в нем белков, ферментов, векторов, клеток-хозяев и методологий, которые могут использоваться в сочетании с настоящим изобретением и в нем. Вместе с тем, никакие положения настоящего документа не следует толковать как признание того, что настоящее изобретение не имеет права на более ранний приоритет на основании предшествующего изобретения.

Перед описанием формулировок и приложений способов, связанных с IL-4 и (или) IL-13, и рассматриваемых продуктов для сведения специалистов ниже приводятся определения некоторых терминов и словосочетаний.

Термин «интерлейкин-4» (IL-4) относится к существующим в природе или эндогенным белкам млекопитающих IL-4, а также к белкам, имеющим аминокислотную последовательность, которая совпадает с существующим в природе или соответствующим эндогенным белком млекопитающих IL-4 (например рекомбинантные белки, синтетические белки (то есть полученные с использованием методов синтетической органической химии)). Соответственно, как указано в настоящем документе, термин включает зрелый белок IL-4, полиморфные или аллельные варианты, а также другие изоформы IL-4 и модифицированные или немодицифированные формы упомянутого выше (например липидные, гликозилированные). Существующие в природе или эндогенные IL-4 включают зрелые белки, например нативный IL-4, полиморфные или аллельные варианты, а также другие изоформы и мутантные формы, которые присутствуют в естественных условиях в организме млекопитающих (например, человек, нечеловекообразные приматы). Такие белки могут извлекаться или выделяться из источника, который в естественных условиях продуцирует, например, IL-4. Такие белки и белки, имеющие аминокислотную последовательность, которая совпадает с существующим в природе или соответствующим эндогенным IL-4, определяют по названию соответствующего млекопитающего. Например, если соответствующим млекопитающим является человек, белок обозначают как IL-4 человека. Специалистам в данной области известны несколько мутантных белков IL-4, например, описанных в заявке WO 03/038041.

Термин «интерлейкин-13» (IL-13) относится к существующим в природе или эндогенным белкам млекопитающих IL-13, а также к белкам, имеющим аминокислотную последовательность, которая совпадает с существующим в природе или соответствующим эндогенным белком млекопитающих IL13 (например, рекомбинантные белки, синтетические белки (то есть полученные с использованием методов синтетической органической химии)). Соответственно, как определено в настоящем документе, термин включает зрелый белок IL-13, полиморфные или аллельные варианты, а также другие изоформы IL-13 (например, полученные методом альтернативного сплайсинга или при помощи других клеточных процессов) и модифицированные или немодицифированные формы упомянутого выше (например, липидные, гликозилированные). Существующие в природе или эндогенные IL-13 включают зрелые белки, например зрелый IL-13, полиморфные или аллельные варианты, а также другие изоформы и мутантные формы, которые присутствуют в естественных условиях в организме млекопитающих (например человек, нечеловекообразные приматы). Например, используемый здесь IL-13 включает вариант IL-13 человека, в котором Arg в позиции 110 зрелого IL-13 человека замещается на Gin (позиция 110 зрелого IL-13 соответствует позиции 130 белка предшественника), который ассоциируется с астмой (атопической и неатопической астмой) и другими вариантами IL-13. (Heinzmann el al, Hum MoI Genet. 9:549-559 (2000).) Такие белки могут извлекаться или выделяться из источника, который в естественных условиях продуцирует, например, IL-13. Такие белки и белки, имеющие аминокислотную последовательность, которая совпадает с существующим в природе или соответствующим эндогенным IL-13, определяют по названию соответствующего млекопитающего. Например, если соответствующим млекопитающим является человек, белок обозначают как IL-13 человека. Специалистам в данной области известны несколько мутантных белков IL-13, например, описанных в заявке WO 03/035847.

Термин «по существу идентичны» по отношению к последовательности полипептидной цепи антитела может интерпретироваться как идентичность по крайней мере на 70%, 80%, 90%, 95% или больше последовательности цепи антитела и сопоставляемой полипептидной последовательности. Тот же термин в отношении последовательности нуклеиновой кислоты может интерпретироваться как последовательность нуклеотидов, проявляющая идентичность по крайней мере на 85%, 90%, 95%, 97% или больше последовательности по отношению к сопоставляемой последовательности нуклеиновой кислоты.

Термины «идентичность» или «гомология» могут означать процент оснований нуклеотидов или аминокислотных остатков в последовательности кандидата, которые идентичны остатку соответствующей последовательности, с которой она сравнивается, после сопоставления последовательностей и введения пропусков, если необходимо, для обеспечения максимального процента идентичности по всей последовательности и без учета любых консервативных замещений в рамках идентичности последовательности. Ни N-концевые или C-концевые удлиняющие сегменты, ни вставки не следует рассматривать как уменьшающие идентичность или гомологию. Методы и компьютерные программы для сопоставления доступны и известны специалистам в данной области. Идентичность последовательности может оцениваться с помощью программного обеспечения для анализа последовательностей.

Словосочетания и термины «функциональный фрагмент, вариант, производное или аналог» и им подобные, а также их формы, применяемые в отношении антитела или антигена, описывают соединение или молекулу, обладающую качественной биологической активностью, присущей рассматриваемому антителу или полноразмерному антигену. Например, функциональный фрагмент или аналог антитела анти-IL-4 может связываться с молекулой IL-4 или с молекулой, которая может препятствовать или существенно снижать способность лиганда или агониста или антагонистического антитела, связываться с IL-4.

«Субституционными» вариантами называют такие, где по крайней мере один аминокислотный остаток в нативной последовательности удален и заменен другой аминокислотой, введенной на его место в том же положении. Замещения могут быть одиночными, при которых заменяется только одна аминокислота в молекуле, или множественными, если в одной и той же молекуле замещаются две или более аминокислоты. Множественные замещения могут производиться в последовательных сайтах. Кроме того, одна аминокислота может замещаться несколькими остатками, такой вариант содержит как замещения, так и вставки. «Инсерционными» вариантами называют такие, где одна или несколько аминокислот были введены таким образом, что оказались непосредственно соседствующими с той или иной аминокислотой в конкретном положении нативной последовательности. Под непосредственно соседствующей с той или иной аминокислотой понимается аминокислота, связанная с α-карбоксильной или α-аминной функциональной группой аминокислоты. «Делеционными» вариантами называют такие, где удалена одна или несколько аминокислот из нативной аминокислотной последовательности. Обычно в делеционных вариантах удаляют одну или две аминокислоты в конкретной области молекулы.

Термин «антитело» используется в наиболее широком смысле и, в частности, включает моноклональные антитела (включая полноразмерное моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), фрагменты антител или синтетические полипептиды, содержащие одну или более последовательностей CDR или производных от CDR, при условии, что полипептиды проявляют желательную биологическую активность. Антитела (Ab) и иммуноглобулины (Ig) относятся к гликопротеинам, обладающим одинаковыми структурными особенностями. Как правило, антитела рассматривают как Ig с определенной или распознаваемой специфичностью. Таким образом, антитела проявляют специфичность связывания с конкретной мишенью, тогда как к иммуноглобулинам относятся и антитела, и другие подобные антителам молекулы, которые не обладают специфичностью к мишени. Антитела по настоящему изобретению могут относиться к любому классу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и т.п.) или подклассу (например, IgG₁, IgG₂, IgG_2a, IgG₃, IgG₄, IgA₁, IgA₂ и т.п.) (термины «тип» и «класс», а также «подтип» и «подкласс» равнозначно используются в настоящем документе). Нативные или немутантные, то есть полученные от представителя популяции без искусственных манипуляций антитела и иммуноглобулины обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярным весом примерно 150000 дальтон, состоящие из двух одинаковых легких цепей (L) и двух одинаковых тяжелых цепей (H). Каждая тяжелая цепь имеет на конце вариабельный домен (V_H), за которым следует несколько константных доменов. Каждая легкая цепь имеет на конце вариабельный домен (V_L), а на другом конце - константный домен. Под выражением «без искусственных манипуляций» понимают отсутствие обработки, после которой элементы содержат или экспрессируют чужеродную антиген-связывающую молекулу. Определение «нативный» может относиться к наиболее преобладающей аллели или видам, регистрируемым в популяции, или к антителу, полученному от животного без манипуляций, в сопоставлении с аллелью или полиморфизмом, или вариантом, или производным, полученным за счет той или иной формы манипуляций, например мутагенеза, применения рекомбинантных методик и т.п. для изменения аминокислоты антиген-связывающей молекулы.

Используемый в настоящем документе термин «антитело анти-IL-4» означает антитело или полипептид, полученный от него (производное), которые специфически связываются с IL-4 в соответствии с определением настоящего документа, в том числе, среди прочих, молекулы, которые ингибируют или существенно снижают уровень связывания IL-4 с его рецептором или ингибируют активность IL-4.

Используемый в настоящем документе термин «антитело анти-IL-13» означает антитело или полипептид, полученный от него (производное), которые специфически связываются с IL-13 в соответствии с определением настоящего документа, в том числе, среди прочих, молекулы, которые ингибируют или существенно снижают уровень связывания IL-13 с его рецептором или ингибируют активность IL-13.

Термин «вариабельный» в контексте вариабельного домена антител относится к определенным частям соответствующей молекулы, которые в значительной мере отличаются своей последовательностью от антител и используются для специфического распознавания и связывания конкретного антитела с его определенной мишенью. При этом вариабельность неравномерно распределяется по вариабельным доменам антител. Вариабельность сосредоточивается в трех сегментах, называемых определяющими комплементарность областями (CDR; то есть CDR1, CDR2 и CDR3), также известными как гипервариабельные участки, которые находятся в вариабельных доменах как легкой, так и тяжелой цепи. Области вариабельных доменов с более высокими уровнями сохранения называют остовными областями (FR) или последовательностями. Вариабельные домены нативных тяжелых и легких цепей содержат по четыре области FR, в значительной мере имеют конформацию β-листа и связаны тремя CDR, которые образуют петли, соединяющие, а в некоторых случаях и образующие, часть структуры β-листа. CDR в каждой цепи часто удерживаются поблизости друг от друга областями FR, и вместе с CDR другой цепи способствуют формированию искомого (эпитопа или детерминанта) сайта связывания антител (см., Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD (1987)). Если не указано иначе, используемая в настоящем документе нумерация аминокислотных остатков иммуноглобулина производится в соответствии с системой нумерации аминокислотных остатков иммуноглобулина из работы Kabat et al. Одна CDR может обладать способностью специфически связывать когнатный эпитоп.

Термин «шарнир», или «шарнирная область», используемый в настоящем изобретении, относится к гибкому полипептиду, содержащему аминокислоты между первым и вторым константными доменами антитела.

Определение «фрагмент антитела» относится к части интактной или полной цепи или антитела, как правило, области связывания мишени или вариабельной области. К примерам фрагментов антитела, среди прочих, относятся фрагменты F_ab, F_ab', F_(ab')2 и F_v. «Функциональным фрагментом» или «аналогом антитела анти-IL-4 и (или) IL-13» называют такой фрагмент, который может препятствовать способности рецептора, или существенно снижать такую способность, связываться с лигандом или инициировать сигнал. Используемый в настоящем документе термин «функциональный фрагмент» является синонимом термина «фрагмент антитела» и при употреблении в отношении антител может касаться таких фрагментов, как F_v, F_ab, F_(ab')2 и т.п., которые в состоянии препятствовать способности рецептора, или существенно снижать такую способность, связываться с лигандом или инициировать сигнал. Фрагмент «F_v» состоит из димера вариабельного домена с одной тяжелой и одной легкой цепью, образованного посредством нековалентной ассоциации (димер V_H-V_L). В такой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют, формируя искомый сайт связывания на поверхности димера V_H-V_L, так же как в интактном антителе. В совокупности такие шесть CDR обеспечивают специфичность связывания мишени на интактном антителе. При этом даже единичный вариабельный домен (или половина F_v, содержащая всего три CDR, специфичных к мишени) может обладать способностью распознавать и связывать мишень.

«Одноцепочечные F_v», фрагменты антител «sF_v» или «scAb» включают домены антитела V_H и V_L, причем эти домены присутствуют в единой полипептидной цепи. Как правило, полипептид F_v дополнительно содержит полипептидный линкер, часто гибкую молекулу, между доменами V_H и V_L, что позволяет sFv образовать нужную структуру для связывания мишени.

Термин «диатела» относится к фрагментам антител с двумя антиген-связывающими сайтами, каковые фрагменты могут включать вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) в той же полипептидной цепи. За счет использования линкера, который слишком короткий, чтобы обеспечивать объединение двух вариабельных доменов одной и той же цепи, домены диател вынуждены объединяться с доменами связывания другой цепи для формирования двух антиген-связывающих сайтов.

Фрагмент F_ab содержит вариабельные и константные домены легкой цепи и вариабельный и первый константный домен (C_H1) тяжелой цепи. Фрагменты F_ab' отличаются от фрагментов F_ab добавлением нескольких остатков в карбоксильном концевом окончании домена C_H1, так чтобы он содержал один или несколько цистеинов из шарнирной области антитела. Фрагменты F_ab' могут быть получены расщеплением дисульфидной связи в цистеинах шарнирной области продукта разрушения пепсином F_(ab')2. Дополнительная ферментативная и химическая обработка антител может приводить к образованию других представляющих интерес функциональных фрагментов.

Термин «линейный Fab» относится к четырехвалентному антителу, согласно описанию в Miller et al. (2003), J Immunol. 170: 4854-4861. «Линейный Fab» состоит из тандема одинаковых доменов CH1-VH, соединенных одинаковой легкой цепью в каждом положении CH1-VH. Подобные молекулы создавались с тем, чтобы повысить валентность антитела с целью улучшения его функциональной аффинности за счет эффекта авидности, но они являются моноспецифическими.

Термин «биспецифические антитела (BsAb)» относится к молекулам, которые объединяют антиген-связывающие сайты двух антител в одной молекуле. Так, биспецифическое антитело в состоянии связывать два различных антигена одновременно. Кроме диагностических приложений, BsAb открывают дорогу новым терапевтическим применениям за счет переориентации мощной эффекторной системы на пораженные болезнью области или за счет повышения нейтрализующей или стимулирующей функции антител.

В ходе первых попыток сочетания специфичности связывания двух полных антител против различных антигенов-мишеней в лечебных целях использовались химически слитые гетероконъюгированные молекулы (Staerz et al.(1985), Nature 314: 628-631).

Биспецифические антитела продуцировались из исходных гибридом с помощью гетерогибридомных методик, и in vitro были продемонстрированы свойства, подобные наблюдаемым для гетероконъюгатов (Milstein & Cuello (1983) Nature 305:537-540).

Несмотря на многообещающие результаты, полученные с помощью гетероконъюгатов или биспецифических антител, продуцируемых в результате, как упоминалось выше, слияния клеток, ряд факторов делает их неприменимыми для широкомасштабных терапевтических приложений. К таким факторам относятся: быстрое выведение гетероконъюгатов in vivo, трудоемкие методики, необходимые для получения любой из форм молекулы, потребность в тщательной очистке гетероконъюгатов от гомоконъюгатов или моноспецифических антител и характерные низкие выходы.

Генная инженерия все чаще использовалась для конструирования, модификации и продукции антител или производных антител с желательным набором свойств связывания и эффекторных функций.

Было разработано множество рекомбинантных методик для эффективной продукции BsAb, в обоих случаях как фрагментов антитела (Carter et al. (1995), J. Hematotherapy 4:463-470; Pluckthun et al. (1997) Immunotechology 3:83-105; Todorovska et al. (2001) J. Immunol. Methods 248:47-66) и полноразмерные форматы IgG (Carter (2001) J. Immunol. Methods 248: 7-15).

Объединение двух различных scFv приводит к форматам BsAb с минимальной молекулярной массой, которые называют sc-BsAb или Ta-scFv (Mack et al. (1995), Proc. Acad. Sci.USA. 92:7021-7025; Mallender et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:199-206). BsAb конструировались посредством генетического слияния двух scFv за счет обеспечивающей димеризацию функциональности, например лейциновой застежки (Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-53; de Kruif et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:7630-4).

Как упоминалось выше, диателами называют небольшие фрагменты бивалентных и биспецифических антител. Фрагменты включают VH, связанный с VL одной и той же полипептидной цепи за счет линкера, который имеет слишком малую длину (менее 12 аминокислот), чтобы обеспечивать возможность связывания между двумя доменами на одной и той же цепи. Домены вынуждены межмолекулярно объединяться с комплементарными доменами другой цепи для формирования двух антиген-связывающих сайтов. Такие димерные фрагменты антител, или «диатела», являются бивалентными и биспецифическими. (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 6444-6448). Диатела имеют размер, близкий к фрагменту Fab. Полипептидные цепи доменов VH и VL, связанные линкером между 3 и 12 аминокислотами, образуют в основном димеры (диатела), тогда как в случае линкера между 0 и 2 аминокислотными остатками предпочтительными оказываются тримеры (триатела) и тетрамеры (тетратела). Кроме длины линкера, точная модель олигомеризации очевидно зависит от состава, а также от ориентации V-доменов (Hudson et al. (1999), J Immunol Methods 231: 177-189). Предсказуемость конечной структуры молекул диател исключительно низкая.

Несмотря на то что sc-BsAb и конструкции на основе диател обладают интересным клиническим потенциалом, было показано, что такие нековалентно ассоциированные молекулы недостаточно стабильны в физиологических условиях. Общая стабильность фрагмента scFv зависит от внутренней стабильности доменов VL и VH, а также от стабильности доменного интерфейса. Недостаточная стабильность интерфейса VH-VL фрагментов scFv часто указывалась среди основных причин необратимой инактивации scFv, поскольку промежуточное раскрытие интерфейса, которое допускает пептидный линкер, открывает доступ к гидрофобным участкам, способствующим агрегированию, а потому определяющим нестабильность и низкий выход продукции (Wörn and Plückthun (2001), J. Mol. Biol. 305: 989-1010).

Альтернативный метод приготовления биспецифических бивалентных антиген-связывающих белков из доменов VH и VL приводится в патенте US 5989830. Такие фрагменты антитела с двумя головками получают экспрессией двухцистронного вектора, кодирующего две полипептидные цепи, причем одна полипептидная цепь дважды содержит VH в последовательности с пептидным линкером (VH1-линкер-VH2), а другая полипептидная цепь содержит комплементарные домены VL, соединенные в последовательность пептидным линкером (VL1-линкер-VL2). В патенте US 5989830 было показано, что линкер должен состоять по крайней мере из 10 аминокислотных остатков.

Поливалентные белковые комплексы (PPC) с возрастающей валентностью описаны в патенте US 2005/0003403 A1. PPC содержат две полипептидные цепи, которые обычно располагаются латерально по отношению друг к другу. Каждая полипептидная цепь обычно включает 3 или 4 «v-области», содержащие аминокислотные последовательности, которые в состоянии образовать сайт связывания антигена при сопоставлении с соответствующей v-областью на противолежащей полипептидной цепи. На каждой полипептидной цепи может быть задействовано до примерно 6 «v-областей». V-области каждой полипептидной цепи связаны линейно друг с другом и могут соединяться перемежаемыми линкерными областями. При организации в форме PPC v-области на каждой полипептидной цепи образуют индивидуальные сайты связывания антигена. Комплекс может содержать одну или несколько связывающих специфичностей.

Вместе с тем при использовании таких молекул была продемонстрирована склонность к агрегированию, нестабильность и низкий выход экспрессии (Wu et al. (2001) Prot. Eng. 14: 1025-1033). Все это характерные проблемы стабильности, которые могут наблюдаться при экспрессии одноцепочечных антител. (Wörn and Plückthun (2001), J. Mol. Biol. 305: 989-1010).

Поэтому целью настоящего изобретения является получение биспецифического поливалентного антитела, с помощью которого можно избежать образования агрегатов. Кроме того, оно должно обладать стабильностью, которая определяет его пригодность для использования в лечебных целях.

Используемый в настоящем документе термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции в значительной мере однородных антител, то есть отдельные антитела, образующие популяцию, идентичны, если не учитывать возможные природные мутации, которые могут присутствовать в незначительных количествах.

В данном случае к моноклональным антителам, в частности, относятся «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и (или) легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от конкретных видов или принадлежащих к определенному классу или подклассу (типу или подтипу) антител, при этом остальная цепь (цепи) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от других видов или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии что они проявляют желаемую биологическую активность при связывании с IL-4 и (или) IL-13 или воздействии на активность или метаболизм IL-4 и (или) IL-13 (патент США № 4816567; и Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984)). Поэтому CDR одного класса антител могут быть введены в FR антитела другого класса или подкласса.

Моноклональные антитела обладают высокой специфичностью, они ориентированы на единственный сайт-мишень, эпитоп или детерминант. Кроме того, в отличие от обычных (поликлональных) препаратов антител, которые, как правило, содержат различные антитела, ориентированные против различных детерминантов (эпитопов) антигена, каждое моноклональное антитело направлено против единственного детерминанта в мишени. В дополнение к специфичности, преимущество моноклональных антител состоит в том, что они продуцируются клеткой-хозяином без примесей других иммуноглобулинов, что обеспечивает клонирование соответствующего гена и мРНК, кодирующей антитело его цепей. Модификатор «моноклональное» указывает на характеристику антитела, которое было получено из в значительной мере однородной популяции антител, и не должен интерпретироваться как требующий продукции антитела любым конкретным методом. Например, моноклональные антитела для использования в настоящем изобретении могут быть выделены из фаг-библиотеки антител с помощью хорошо известных методик или же могут выделяться из поликлонального препарата. Исходные моноклональные антитела для использования в соответствии с настоящим изобретением могут быть приготовлены с помощью гибридомного метода, описанного в Kohler et al., Nature 256:495 (1975), или могут быть получены рекомбинантными методами, которые хорошо известны специалистам в данной области.

Термин «поливалентное антитело», используемый в настоящем изобретении, относится к антителу, содержащему два и более сайтов связывания антигена, и поэтому способному одновременно связывать два или более антигена, обладающих одинаковой или различной структурой. Термин «бивалентное» означает, что антитело содержит два антиген-связывающих сайта. Термин «тетравалентное» означает, что антитело содержит четыре антиген-связывающих сайта.

Термин «антиген-связывающий сайт», который используется в настоящем изобретении, относится к части антитела, содержащей область, специфически связывающую часть антигена или полный антиген и комплементарную части антигена или полному антигену. В случае большого по величине антигена антитело может связываться лишь с определенной его частью, и такую часть называют эпитопом. Антиген-связывающий домен может обеспечиваться одним или несколькими вариабельными доменами антитела. Предпочтительно, чтобы антиген-связывающий домен был образован за счет связывания вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH).

Используемый в настоящем изобретении термин «антиген» относится к молекуле или части молекулы, которая в состоянии связываться с антителами настоящего изоберетения. Антиген может содержать один или несколько эпитопов. К примерам антигенов, распознаваемых антителами настоящего изобретения, среди прочих, относятся белки сыворотки, например цитокины, такие как IL-4, IL5, IL9 и IL-13, биологически активные пептиды, молекулы клеточной поверхности, например рецепторы, переносчики, ионные каналы, вирусные и бактериальные белки.

Используемый в настоящем изобретении термин «моноспецифический» означает, что поливалентное антитело настоящего изобретения распознает только один антиген, причем все антиген-связывающие сайты являются идентичными.

Используемый в настоящем изобретении термин «биспецифический» означает, что поливалентное антитело настоящего изобретения распознает два различных эпитопа на одном и том же антигене или двух различных антигенах.

Используемый в настоящем изобретении термин «мультиспецифический» означает, что поливалентное антитело настоящег