Полипептиды, обладающие эндопептидазной активностью, и кодирующие их полинуклеотиды

Полипептиды, обладающие эндопептидазной активностью, и кодирующие их полинуклеотиды

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Ссылка на список последовательностей

Данная заявка содержит список последовательностей в машиночитаемой форме, который включен в данное описание посредством ссылки.

Ссылка на депонирование биологического материала

Данная заявка содержит ссылку на депонирование биологического материала, который включен в данное описание посредством ссылки.

Уровень техники

Область техники, к которой относится изобретения

Настоящее изобретение относится к полипептидам, обладающим эндопептидазной активностью, а также к способам получения и применения таких полипептидов. Изобретение также относится к способам получения гидролизата белка, такого как гидролизат пищевого белка.

Описание уровня техники

Трипсин (EC 3.4.21.4) представляет собой сериновую протеазу, встречающуюся в пищеварительной системе многих позвоночных, где она гидролизует белки. Трипсин расщепляет пептидные цепи в основном на карбоксильном конце аминокислот лизина и аргинина. Трипсин присутствует в большом количестве в поджелудочной железе и может быть очищен довольно легко. Поэтому он широко используется в различных биотехнологических процессах. Трипсин используют в детском питании для его предварительного расщепления. Он способен разрушать белковые молекулы, что помогает ребенку переваривать белок, поскольку детский желудок не развит в достаточной степени для переваривания крупных белковых молекул. Трипсин можно использовать для разрушения белков молока с получением частичного гидролизата молочных белков для детского питания. Например, в WO 93/04593 и US 5039532 описано применение препаратов трипсина поджелудочной железы для получения гипоаллергенных гидролизатов белков молочной сыворотки.

По ряду причин, при производстве пищевых продуктов и, в частности, при производстве детских продуктов или питания для грудных детей использование протеолитических ферментов, полученных из микроорганизмов, таких как бактерии, может обеспечивать преимущества. Например, производство бактериальных ферментов можно легко оптимизировать, чтобы оно было эффективным и легко контролируемым. Вследствие этого, такие ферменты можно получать в больших количествах и с высокой степенью чистоты. Кроме того, использование микробных ферментов поможет преодолеть возрастающие трудности, связанные с системой обеспечения качества, которые возникают в случае экстрагирования ферментов из животных источников.

Одной из целей настоящего изобретения является предложение новых микробных протеаз для потенциального использования, например, в пищевой промышленности.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что некоторые бактериальные пептидазы обладают специфичностью расщепления, очень сходной с расщеплением трипсина поджелудочной железы. Кроме того, такие бактериальные эндопептидазы можно использовать для получения гидролизатов пищевых белков, имеющих сходные свойства, например, сходную степень гидролиза и/или сходный пептидный спектр, как у гидролизатов пищевых белков, полученных при помощи трипсина поджелудочной железы.

Кроме того, авторы настоящего изобретения идентифицировали новую бактериальную эндопептидазу, обладающую трипсиноподобной активностью.

Таким образом, настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам, обладающим эндопептидазной активностью, выбранным из группы, состоящей из:

(a) полипептида, имеющего по меньшей мере 70% идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO:2;

(b) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизуется в нестрогих условиях с (i) кодирующей зрелый полипептид последовательностью SEQ ID NO:1, (ii) последовательностью геномной ДНК, содержащей кодирующую зрелый полипептид последовательность SEQ ID NO:1, или (iii) полноразмерной комплементарной цепью для (i) или (ii);

(c) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, имеющим по меньшей мере 70% идентичность последовательности с кодирующей зрелый полипептид последовательностью SEQ ID NO:1;

(d) варианта, содержащего замену, делецию и/или вставку одной или более (нескольких) аминокислот, зрелого полипептида SEQ ID NO:2; и

(e) фрагмента полипептида по пунктам (a), (b), (c) или (d), обладающего эндопептидазной активностью.

Настоящее изобретение также относится к способам получения данных полипептидов.

Настоящее изобретение также относится к способам применения полипептидов для получения гидролизата белка.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения гидролизата пищевого белка, включающему:

(a) обеспечение раствора, содержащего пищевой белок, подлежащий гидролизу;

(b) добавление к указанному раствору трипсиноподобной эндопептидазы, полученной из бактерии; и

(c) получение гидролизата пищевого белка.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлена карта плазмиды ExpVec8 с геном, кодирующим трипсиноподобную эндопептидазу из Kutzneria albida.

На фиг.2 представлены УФ-хроматограммы бычьего альфа-лактальбумина, гидролизованного трипсиноподобной эндопептидазой из Kutzneria albida (верхняя кривая) или свиным трипсином (нижняя кривая).

Определения

Эндопептидазная активность: Термин «эндопептидазная активность» означает протеолитическую активность, способную приводить к гидролизу любой пептидной связи в пептиде. Однако, поскольку эндопептидазы часто имеют каталитические центры, в которых происходит связывание с несколькими аминокислотами и часто по обе стороны от точки расщепления, эндопептидазы в целом демонстрируют предпочтение в отношении не-концевых пептидных связей, в отличие от экзопептидаз, которые гидролизуют пептидные связи с любого конца пептида. Эндопептидазы, как правило, классифицируются как EC 3.4.21-25. Для целей настоящего изобретения эндопептидазную активность можно определять, используя анализ с Protazyme AK, как описано в примере 2.

Полипептиды по настоящему изобретению могут обладать по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 100% эндопептидазной активностью зрелого полипептида SEQ ID NO:2.

Трипсиноподобная эндопептидаза: Термин «трипсиноподобная эндопептидаза» или «эндопептидаза, обладающая трипсиноподобной активностью» в данном описании означает эндопептидазу, которая преимущественно расщепляет пептиды или белки в С-концевой части L-изомера аргинина и/или лизина. В предпочтительном варианте осуществления трипсиноподобная эндопептидаза преимущественно расщепляет пептиды или белки в С-концевой части аргинина и лизина. Это означает, что эндопептидаза имеет более высокую специфичность в отношении расщепления после как аргинина, так и лизина, чем она имеет в отношении расщепления после любой другой аминокислоты. В другом предпочтительном варианте осуществления трипсиноподобная эндопептидаза преимущественно расщепляет пептиды или белки в С-концевой части аргинина или лизина. Это означает, что эндопептидаза имеет более высокую специфичность в отношении расщепления после любого из аргинина или лизина, чем она имеет в отношении расщепления после любой другой аминокислоты. В другом предпочтительном варианте осуществления трипсиноподобная эндопептидаза преимущественно расщепляет пептиды или белки в С-концевой части аргинина. Это означает, что эндопептидаза имеет более высокую специфичность в отношении расщепления после аргинина, чем она имеет в отношении расщепления после любой другой аминокислоты. В другом предпочтительном варианте осуществления трипсиноподобная эндопептидаза преимущественно расщепляет пептиды или белки в С-концевой части лизина. Это означает, что эндопептидаза имеет более высокую специфичность в отношении расщепления после лизина, чем она имеет в отношении расщепления после любой другой аминокислоты.

Трипсиновое отношение: «Трипсиновое отношение» определяют как активность фермента при расщеплении после Arg или Lys (в зависимости от того, что больше), деленную на активность фермента при расщеплении после любого из Ala, Asp, Glu, Ile, Leu, Met, Phe или Val (в зависимости от того, что больше). В предпочтительном варианте осуществления трипсиноподобная эндопептидаза по изобретению имеет трипсиновое отношение более 100. То есть, в предпочтительном варианте осуществления трипсиноподобная эндопептидаза по изобретению имеет специфичность в отношении расщепления после Arg или Lys (в зависимости от того, что больше), которая по меньшей мере в 100 раз выше, чем ее специфичность в отношении расщепления после любого из Ala, Asp, Glu, Ile, Leu, Met, Phe или Val (в зависимости от того, что больше). Подобные измерения активности для определения трипсинового отношения следует проводить при pH, при котором активность эндопептидазы составляет по меньшей мере половину активности эндопептидазы при оптимальном для нее pH. Трипсиновое отношение можно определять, как описано в примере 2 настоящего описания.

Выделенный полипептид: Термин «выделенный полипептид» означает полипептид, который модифицирован рукой человека относительно полипептида, который встречается в природе. В одном варианте осуществления полипептид является по меньшей мере на 1% чистым, например, по меньшей мере на 5% чистым, по меньшей мере на 10% чистым, по меньшей мере на 20% чистым, по меньшей мере на 40% чистым, по меньшей мере на 60% чистым, по меньшей мере на 80% чистым или по меньшей мере на 90% чистым, что определяют методом SDS-ПААГ.

По существу чистый полипептид: Термин «по существу чистый полипептид» означает препарат, который содержит не более 10%, не более 8%, не более 6%, не более 5%, не более 4%, не более 3%, не более 2%, не более 1%, или предпочтительно не более 0,5% масс. другого полипептидного материала, с которым он природно или рекомбинантно связан. Предпочтительно, полипептид является по меньшей мере на 92% чистым, например, по меньшей мере на 94% чистым, по меньшей мере на 95% чистым, по меньшей мере на 96% чистым, по меньшей мере на 97% чистым, по меньшей мере на 98% чистым, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% чистым или, наиболее предпочтительно, на 100% чистым из расчета на массу общего полипептидного материала, присутствующего в препарате. Полипептиды по настоящему изобретению предпочтительно находятся по существу в чистом виде. Этого можно достичь, например, получая полипептид хорошо известными рекомбинантными способами или классическими методами очистки.

Зрелый полипептид: Термин «зрелый полипептид» означает полипептид в его конечной форме после трансляции и любых посттрансляционных модификаций, таких как N-концевой процессинг, C-концевое усечение, гликозилирование, фосфорилирование и т.д. В одном варианте осуществления зрелый полипептид представляет собой аминокислоты 1-225 SEQ ID NO:2, на основании N-концевого секвенирования и определения молекулярной массы, как описано в примере 2.

Кодирующая зрелый полипептид последовательность: Термин «кодирующая зрелый полипептид последовательность» означает полинуклеотид, который кодирует зрелый полипептид, обладающий эндопептидазной активностью. В одном варианте осуществления кодирующая зрелый полипептид последовательность может представлять собой нуклеотиды 1-675 SEQ ID NO:1, на основании аминокислотной последовательности зрелого полипептида. В другом варианте осуществления кодирующая зрелый полипептид последовательность может представлять собой нуклеотиды 82-756 SEQ ID NO:3.

Идентичность последовательностей: Родство между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями описывается параметром «идентичность последовательностей».

Для целей настоящего изобретения степень идентичности последовательностей между двумя аминокислотными последовательностями определяют при помощи алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman-Wunsch) (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), реализованного в программе Needle пакета программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), предпочтительно версии 2.8.0 или более поздней. Дополнительными используемыми параметрами являются: штраф за внесение делеции 10, штраф за продолжение делеции 0,5 и матрица замен EBLOSUM62 (EMBOSS версия BLOSUM62). Результат в программе Needle, помеченный «идентичность наибольшей длины» (полученный при помощи параметра -nobrief) используют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:

(Идентичные остатки×100)/(длина выравнивания-общее число делеций в выравнивании)

Для целей настоящего изобретения степень идентичности последовательностей между двумя дезоксирибонуклеотидными последовательностями определяют при помощи алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, выше), реализованного в программе Needle пакета программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, выше), предпочтительно версии 3.0.0 или более поздней. Дополнительными используемыми параметрами являются: штраф за внесение делеции 10, штраф за продолжение делеции 0,5 и матрица замен EDNAFULL (EMBOSS версия NCBI NUC4.4). Результат в программе Needle, помеченный «идентичность наибольшей длины» (полученный при помощи параметра -nobrief) используют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:

(Идентичные дезоксирибонуклеотиды×100)/(длина выравнивания-общее число делеций в выравнивании)

Фрагмент: Термин «фрагмент» означает полипептид, у которого одна или более (несколько) аминокислот делетированы с амино и/или карбоксильного конца зрелого полипептида; при этом фрагмент обладает эндопептидазной активностью. В одном варианте осуществления фрагмент содержит по меньшей мере 100 аминокислотных остатков, по меньшей мере 150 аминокислотных остатков или по меньшей мере 200 аминокислотных остатков.

Подпоследовательность: Термин «подпоследовательность» означает полинуклеотид, у которого один или более (несколько) нуклеотидов делетированы с 5' и/или 3'-конца кодирующей зрелый полипептид последовательности; при этом подпоследовательность кодирует фрагмент, обладающий эндопептидазной активностью. В одном варианте осуществления подпоследовательность содержит по меньшей мере 300 нуклеотидов, например, по меньшей мере 400 нуклеотидов, по меньшей мере 500 нуклеотидов или по меньшей мере 600 нуклеотидов.

Аллельный вариант: Термин «аллельный вариант» означает любую из двух или более альтернативных форм гена, занимающую один и тот же хромосомный локус. Аллельные вариации естественным образом возникают в результате мутации и могут приводить к полиморфизму в популяциях. Генные мутации могут быть «молчащими» (без изменений в кодируемом полипептиде) или могут приводить к кодированию полипептидов, имеющих измененные аминокислотные последовательности. Аллельный вариант полипептида представляет собой полипептид, кодируемый аллельным вариантом гена.

Выделенный полинуклеотид: Термин «выделенный полинуклеотид» означает полинуклеотид, который модифицирован рукой человека относительно полинуклеотида, встречающегося в природе. В одном варианте осуществления выделенный полинуклеотид является по меньшей мере на 1% чистым, например, по меньшей мере на 5% чистым, предпочтительно по меньшей мере на 10% чистым, по меньшей мере на 20% чистым, по меньшей мере на 40% чистым, по меньшей мере на 60% чистым, по меньшей мере на 80% чистым, по меньшей мере на 90% чистым или, более предпочтительно, по меньшей мере на 95% чистым, как определяют электрофорезом в агарозе. Полинуклеотиды могут иметь геномное, кДНК, РНК, полусинтетическое, синтетическое происхождение, либо представлять собой любую их комбинацию.

По существу чистый полинуклеотид: Термин «по существу чистый полинуклеотид» означает препарат полинуклеотида, свободный от других посторонних или нежелательных нуклеотидов и находящийся в форме, подходящей для использования в генно-инженерных системах производства полипептидов. Таким образом, по существу чистый полинуклеотид содержит не более 10%, не более 8%, не более 6%, не более 5%, не более 4%, не более 3%, не более 2%, не более 1% или не более 0,5% масс. другого полинуклеотидного материала, с которым он природно или рекомбинантно связан. По существу чистый полинуклеотид может, однако, содержать 5' и 3'-нетранслируемые области природного происхождения, такие как промоторы и терминаторы. Предпочтительно, полинуклеотид является по меньшей мере на 90% чистым, например, по меньшей мере на 92% чистым, по меньшей мере на 94% чистым, по меньшей мере на 95% чистым, по меньшей мере на 96% чистым, по меньшей мере на 97% чистым, по меньшей мере на 98% чистым, по меньшей мере на 99% чистым или по меньшей мере на 99,5% чистым по массе. Полинуклеотиды по настоящему изобретению предпочтительно находятся по существу в чистом виде.

Кодирующая последовательность: Термин «кодирующая последовательность» означает полинуклеотид, который непосредственно определяет аминокислотную последовательность полипептида. Границы кодирующей последовательности, как правило, определяются открытой рамкой считывания, которая обычно начинается со стартового кодона ATG или альтернативных стартовых кодонов, таких как GTG и TTG, и заканчивается стоп-кодоном, таким как TAA, TAG и TGA. Кодирующая последовательность может представлять собой ДНК, кДНК, синтетический или рекомбинантный полинуклеотид.

кДНК: Термин «кДНК» означает молекулу ДНК, которую можно получать путем обратной транскрипции со зрелой, сплайсированной молекулы мРНК, полученной из эукариотической клетки. У кДНК отсутствуют интронные последовательности, которые могут присутствовать в соответствующей геномной ДНК. Исходный первичный РНК-транскрипт является предшественником мРНК, который процессируется в несколько стадий, включая сплайсинг, перед тем, как стать зрелой сплайсированной мРНК.

Конструкт нуклеиновой кислоты: Термин «конструкт нуклеиновой кислоты» означает молекулу нуклеиновой кислоты, либо одно- либо двухцепочечную, которая выделена из природного гена или модифицирована для содержания сегментов нуклеиновых кислот таким образом, что без этого не могла бы существовать в природе, либо является синтетической. Термин «конструкт нуклеиновой кислоты» является синонимом термину «экспрессионная кассета», когда конструкт нуклеиновой кислоты содержит контрольные последовательности, необходимые для экспрессии кодирующей последовательности по настоящему изобретению.

Контрольные последовательности: Термин «контрольные последовательности» означает все компоненты, необходимые для экспрессии полинуклеотида, кодирующего полипептид по настоящему изобретению. Каждая контрольная последовательность может быть нативной или чужеродной для полинуклеотида, кодирующего полипептид, либо они могут нативными или чужеродными друг для друга. Такие контрольные последовательности включают, но не ограничиваются ими, лидерную последовательность, последовательность полиаденилирования, пропептидную последовательность, промотор, сигнальную пептидную последовательность и последовательность терминации транскрипции. Как минимум, контрольные последовательности включают промотор, а также транскрипционный и трансляционный стоп-сигналы. Контрольные последовательности могут быть снабжены линкерами с целью введения конкретных сайтов рестрикции, облегчающих лигирование контрольных последовательностей с кодирующей областью полинуклеотида, кодирующего полипептид.

Функционально связанные: Термин «функционально связанные» означает конфигурацию, в которой контрольная последовательность помещена в соответствующее положение относительно кодирующей последовательности полинуклеотида таким образом, что контрольная последовательность направляет экспрессию кодирующей последовательности.

Экспрессия: Термин «экспрессия» охватывает любую стадию процесса создания полипептида, включая, но, не ограничиваясь ими, транскрипцию, посттранскрипционные модификации, трансляцию, посттрансляционные модификации, а также секрецию.

Экспрессионный вектор: Термин «экспрессионный вектор» означает линейную или кольцевую молекулу ДНК, содержащую полинуклеотид, который кодирует полипептид и функционально связан с дополнительными нуклеотидами, обеспечивающими его экспрессию.

Клетка-хозяин: Термин «клетка-хозяин» означает любой тип клеток, подверженных трансформации, трансфекции, трансдукции и подобному, при помощи конструкта нуклеиновой кислоты или экспрессионного вектора, содержащего полинуклеотид по настоящему изобретению. Термин «клетка-хозяин» охватывает любое потомство родительской клетки, которое не идентично родительской клетке вследствие мутаций, происходящих в процессе репликации.

Вариант: Термин «вариант» означает полипептид, обладающий эндопептидазной активностью, который содержит изменение, то есть, замену, вставку и/или делецию одного или более (нескольких) аминокислотных остатков в одном или более (нескольких) положениях. Замена означает замену аминокислоты, занимающей некое положение, другой аминокислотой; делеция означает удаление аминокислоты, занимающей некое положение; и вставка означает добавление 1-3 аминокислот рядом с аминокислотой, занимающей некое положение.

Подробное описание изобретения

Полипептиды, обладающие эндопептидазной активностью

Полипептиды

Настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам, обладающим эндопептидазной активностью, выбранным из группы, состоящей из:

a) полипептида, имеющего по меньшей мере 70% идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO:2;

(b) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизуется в нестрогих условиях с (i) кодирующей зрелый полипептид последовательностью SEQ ID NO:1, (ii) последовательностью геномной ДНК, содержащей кодирующую зрелый полипептид последовательность SEQ ID NO:1, или (iii) полноразмерной комплементарной цепью для (i) или (ii);

(c) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, имеющим по меньшей мере 70% идентичность последовательности с кодирующей зрелый полипептид последовательностью SEQ ID NO:1;

(d) варианта, содержащего замену, делецию и/или вставку одной или более (нескольких) аминокислот, зрелого полипептида SEQ ID NO:2; и

(e) фрагмента полипептида по пунктам (a), (b), (c) или (d), обладающего эндопептидазной активностью.

Настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам, имеющим идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO:2 по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которые обладают эндопептидазной активностью. В одном варианте осуществления полипептиды отличаются не более чем десятью аминокислотами, например, пятью аминокислотами, четырьмя аминокислотами, тремя аминокислотами, двумя аминокислотами или одной аминокислотой, от зрелого полипептида SEQ ID NO:2.

Полипептид по настоящему изобретению предпочтительно содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 или ее аллельного варианта; или представляет собой ее фрагмент, обладающий эндопептидазной активностью. В другом варианте осуществления полипептид содержит или состоит из зрелого полипептида SEQ ID NO:2. В другом предпочтительном варианте осуществления полипептид содержит или состоит из аминокислот 1-225 SEQ ID NO:2.

Настоящее изобретение также относится к выделенным полипептидам, обладающим эндопептидазной активностью, которые кодируются полинуклеотидами, гибридизующимися в очень нестрогих условиях, нестрогих условиях, условиях средней строгости, условиях от средней до высокой степени строгости, строгих условиях или очень строгих условиях с (i) кодирующей зрелый полипептид последовательностью SEQ ID NO:1, (ii) последовательностью геномной ДНК, содержащей кодирующую зрелый полипептид последовательность SEQ ID NO:1, или (iii) полноразмерной комплементарной цепью для (i) или (ii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York).

Полинуклеотид SEQ ID NO:1 или его подпоследовательность, а также аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или ее фрагмент можно использовать для конструирования нуклеиновокислотных зондов с целью идентификации и клонирования ДНК, кодирующей полипептиды, обладающие эндопептидазной активностью, из штаммов различных родов или видов способами, хорошо известными в данной области. В частности, такие зонды можно использовать для гибридизации с геномной или кДНК представляющего интерес рода или вида, с последующими стандартными процедурами саузерн-блоттинга, с целью идентификации и выделения соответствующего им гена. Такие зонды могут быть значительно короче, чем вся последовательность, однако должны иметь по меньшей мере 14, например, по меньшей мере 25, по меньшей мере 35 или по меньшей мере 70 нуклеотидов в длину. Предпочтительно, нуклеиновокислотный зонд имеет по меньшей мере 100 нуклеотидов в длину, например, по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов, по меньшей мере 500 нуклеотидов или по меньшей мере 600 нуклеотидов в длину. Можно использовать как ДНК-, так и РНК-зонды. Как правило, зонды метят для обнаружения соответствующего гена (например, при помощи ³²P, ³H, ³⁵S, биотина или авидина). Такие зонды охвачены настоящим изобретением.

Библиотеку геномной ДНК или кДНК, полученную из других таких штаммов, можно подвергать скринингу на ДНК, которая гибридизуется с зондами, описанными выше, и кодирует полипептид, обладающий эндопептидазной активностью. Геномную или другую ДНК из таких других штаммов можно выделять электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле, либо другими методами разделения. ДНК из библиотек или выделенную ДНК можно переносить и иммобилизовать на нитроцеллюлозе или другом подходящем материале-носителе. Для идентификации клона или ДНК, которая гомологична с SEQ ID NO:1 или ее подпоследовательностью, материал-носитель предпочтительно используют в саузерн-блоттинге.

Для целей настоящего изобретения, гибридизация указывает на то, что полинуклеотид гибридизуется с меченым нуклеиновокислотным зондом, соответствующим кодирующей зрелый полипептид последовательности SEQ ID NO:1; последовательности геномной ДНК, содержащей кодирующую зрелый полипептид последовательность SEQ ID NO:1; ее полноразмерной комплементарной цепи; или ее подпоследовательности; в условиях от очень нестрогих до очень строгих. Молекулы, с которыми нуклеиновокислотный зонд гибридизуется в таких условиях, можно обнаруживать, используя, например, рентгеновскую пленку.

В одном варианте осуществления нуклеиновокислотный зонд представляет собой кодирующую зрелый полипептид последовательность SEQ ID NO:1. В другом варианте осуществления нуклеиновокислотный зонд представляет собой нуклеотиды 1-200, нуклеотиды 201-400, нуклеотиды 401-600 или нуклеотиды 401-625 SEQ ID NO:1. В другом варианте осуществления нуклеиновокислотный зонд представляет собой полинуклеотид, который кодирует полипептид SEQ ID NO:2 или его фрагмент. В другом предпочтительном варианте осуществления нуклеиновокислотный зонд представляет собой SEQ ID NO:1. В другом варианте осуществления нуклеиновокислотный зонд представляет собой полинуклеотид, содержащийся в плазмиде ExpVec8, которая содержится в E. coli DSM 23706, при этом полинуклеотид кодирует полипептид, обладающий эндопептидазной активностью. В другом варианте осуществления нуклеиновокислотный зонд представляет собой кодирующую зрелый полипептид область, содержащуюся в плазмиде ExpVec8, которая содержится в E. coli DSM 23706.

Для длинных зондов, имеющих по меньшей мере 100 нуклеотидов в длину, условия от очень нестрогих до очень строгих соответствуют предгибридизации и гибридизации при 42°C в смеси 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограмм/мл фрагментированной и денатурированной ДНК спермы лосося и либо 25% формамида для очень нестрогих и нестрогих условий, 35% формамида для условий средней строгости и от средней до высокой степени строгости, либо 50% формамида для строгих и очень строгих условий, после стандартных процедур саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов оптимально. В конечном итоге, материал-носитель промывают три раза по 15 минут буфером 2X SSC, 0,2% SDS при 45°C (очень нестрогие условия), при 50°C (нестрогие условия), при 55°C (условия средней строгости), при 60°C (условия от средней до высокой степени строгости), при 65°C (строгие условия) и при 70°C (очень строгие условия).

Для коротких зондов, имеющих примерно от 15 нуклеотидов до примерно 70 нуклеотидов в длину, строгие условия соответствуют предгибридизации и гибридизации при температуре примерно от 5°C до примерно 10°C ниже рассчитанного значения T_m, которое рассчитано согласно Bolton and McCarthy (1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 1390), в смеси 0,9 M NaCl, 0,09 M Трис-HCl pH 7,6, 6 мМ EDTA, 0,5% NP-40, 1X раствора Денхардта, 1 мМ пирофосфата натрия, 1 мМ одноосновного фосфата натрия, 0,1 мМ АТФ и 0,2 мг дрожжевой РНК на мл после стандартных процедур саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов оптимально. В конечном итоге, материал-носитель промывают один раз в 6X SCC плюс 0,1% SDS в течение 15 минут и два раза по 15 минут, используя 6X SSC при температуре от 5°C до 10°C ниже рассчитанного значения T_m.

Настоящее изобретение также относится к выделенным полипептидам, обладающим эндопептидазной активностью, кодируемым полинуклеотидами, имеющими идентичность последовательности с кодирующей зрелый полипептид последовательностью SEQ ID NO:1 по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%.

Настоящее изобретение также относится к вариантам, содержащим замену, делецию и/или вставку одной или более (или нескольких) аминокислот, зрелого полипептида SEQ ID NO:2, либо его гомологичной последовательности. Предпочтительно, изменения аминокислот носят незначительный характер, то есть консервативные аминокислотные замены или вставки, которые существенно не влияют на сворачивание и/или активность белка; небольшие делеции, как правило, от одной до примерно 30 аминокислот; небольшие удлинения с амино- или карбоксильного конца, такие как амино-концевой остаток метионина; небольшой линкерный пептид длиной примерно до 20-25 остатков; или небольшое удлинение, которое облегчает очистку вследствие изменения суммарного заряда или другой функции, такое как полигистидиновая область, антигенный эпитоп или связывающий домен.

Примеры консервативных замен существуют в группе основных аминокислот (аргинин, лизин и гистидин), кислых аминокислот (глютаминовая кислота и аспарагиновая кислота), полярных аминокислот (глютамин и аспарагин), гидрофобных аминокислот (лейцин, изолейцин и валин), ароматических аминокислот (фенилаланин, триптофан и тирозин) и небольших аминокислот (глицин, аланин, серин, треонин и метионин). Аминокислотные замены, которые, как правило, не изменяют специфическую активность, известны в данной области и описаны, например, H. Neurath and R.L. Hill, 1979, в: The Proteins, Academic Press, New York. Наиболее часто встречающимися заменами являются Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly.

Альтернативно, существуют аминокислотные замены такой природы, что изменяются физико-химические свойства полипептидов. Например, аминокислотные замены могут улучшать термостабильность полипептида, изменять субстратную специфичность, изменять рН-оптимум и тому подобное.

Незаменимые аминокислоты в родительском полипептиде можно определять методами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). В последнем методе проводят одиночные мутации на аланин каждого остатка в молекуле, и полученные мутантные молекулы тестируют на эндопептидазную активность, предпочтительно, трипсиноподобную эндопептидазную активность, для определения аминокислотных остатков, которые критичны для активности молекулы. См. также, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. Активный центр фермента или другие биологические взаимодействия можно также определять путем физического анализа структуры, который осуществляют такими методами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное мечение, в сочетании с мутацией аминокислот предполагаемого контактного центра. См., например, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. Конкретные незаменимые аминокислоты также можно определять на основании анализа идентичности с полипептидами, родственными родительскому полипептиду.

Одиночные или множественные аминокислотные замены, делеции и/или вставки можно создавать и тестировать, применяя известные методы мутагенеза, рекомбинации и/или перетасовки, сопровождаемых соответствующей процедурой скрининга, таких как описано в статьях Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413 или WO 95/22625. Другие методы, которые могут быть использованы, включают ПЦР пониженной точности, фаговый дисплей (например, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; патент США 5223409; WO 92/06204) и сегмент-направленный мутагенез (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

Методы мутагенеза/перетасовки можно комбинировать с высокопроизводительными автоматизированными методами скрининга для определения активности клонированных мутагенизированных полипептидов, экспрессируемых клетками-хозяевами (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Мутагенизированные молекулы ДНК, которые кодируют активные полипептиды, можно выделять из клеток-хозяев и быстро секвенировать стандартными методами в данной области. Эти методы позволяют быстро определять важность отдельных аминокислотных остатков в полипептиде.

Общее число аминокислотных замен, делеций и/или вставок в зрелом полипептиде SEQ ID NO:2 составляет не более чем 10, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9.

Полипептид может представлять собой гибридный полипептид, в котором часть одного полипептида слита с N-концом или C-концом части другого полипептида.

Полипептид может представлять собой слитый полипептид или расщепляемый слитый полипептид, в котором другой полипептид слит с N-концом или C-концом полипептида по настоящему изобретению. Слитый полипептид получают слиянием полинуклеотида, кодирующего другой полипептид, с полинуклеотидом по настоящему изобретению. Способы получения слитых полипептидов известны в данной области и включают лигирование кодирующих последовательностей, кодирующих полипептиды, таким образом, что они находятся внутри рамки считывания, и экспрессия слитого полипептида находится под контролем одного и того же промотора(ов) и терминатора. Слитые белки можно также конструировать, используя технологию интеинов, в которой слияния создаются посттрансляционно (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

Слитый полипептид может дополнительно содержать сайт расщепления между двумя полипептидами. После секреции слитого белка происходит расщепление по сайту, и высвобождаются два полипептида. Примеры сайтов расщепления включают, но не ограничиваются ими, сайты, описанные в статьях Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503 и Contreras et al., 1991, Biotechnology 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; и Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

Предпочтительно, полипептиды по настоящему изобретению являются трипсиноподобными эндопептидазами.

Источники полипептидов, обладающих эндопептидазной активностью

Полипептид, обладающий эндопептидазной активностью, по настоящему изобретению можно получать из микроорганизмов любого рода. Для целей настоящего изобретения используемый в данном описании термин «полученный из» в связи с данным источником должен означать, что полипептид, кодируемый полинуклеотидом, произведен при помощи источника или при помощи штамма, в который полинуклеотид из источника был встроен. В одном варианте осуществления полипептид, полученный из данного источника, секретируется внеклеточно.

Полипептид может быть бактериальным полипептидом. Например, полипептид может быть полипептидом из грамположительных бактерий, таким как полипептид из Actinocynnema, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Kribbella, Kutz