Новые пептиды и способы их получения

Новые пептиды и способы их получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к областям биологических наук и питания, кормов или фармацевтической индустрии. В частности, изобретение относится к новым пептидам, белкам, ворсинчатым структурам, полинуклеотидам, а также векторам, клеткам-хозяевам, продуктам и фармацевтическим композициям, содержащим полинуклеотиды, пептиды, белки или ворсинчатые структуры. Изобретение также относится к кластерам генов и антителам. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам получения пептидов, белков или ворсинчатых структур или получения продуктов, содержащих пептиды, белки или ворсинчатые структуры. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам лечения, а также применениям и способам скрининга бактериальных штаммов для снижения или подавления адгезии патогенных бактерий, стимуляции адгезии бактериальных клеток к слизи и/или эпителию и/или для модуляции иммунного ответа у индивидуума. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам выявления пробиотических бактериальных штаммов или патогенных штаммов для идентификации и/или ингибирования.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Инвазивная адгезия к тканям хозяина бактериальных патогенных микроорганизмов часто облегчается удлиненными волосовидными белковыми нитями, называемыми ворсинками или фимбриями, которые выступают наружу от клеточной поверхности микроорганизма. У грамотрицательных патогенных бактерий роль ворсинок в качестве средств колонизации в патогенезе является общепризнанной и общий механизм сборки ворсинок за пятьдесят лет исследований точно определен. Наиболее структурно охарактеризованными ворсинками грамотрицательных бактерий являются форма I типа, выявляемая, например, у энтеропатогенных E. coli, и форма IV типа, выявляемая, например, у видов Neisseria и Pseudomonas, а также in E. coli. Как правило, ворсинки грамотрицательных бактерий являются длинными (от 1 до 4 мкм в длину) и тонкими (от 5 до 8 нм в диаметре), а также демонстрируют структурные свойства гибкости и прочности. Эти ворсинки в основном состоят из ряда нековалентно связанных нескольких белковых субъединиц, сборка которых зависит от специфических белков-шаперонов, но не зависит ни от какой ферментативной активности. Часто на верху ворсинок расположен белок с адгезивными свойствами. В основном полагают, что промежуточная протяженность белковых субъединиц от поверхности микроорганизма обеспечивает беспрепятственный контакт между адгезивным белком на верху и соответствующими рецепторными участками клетки-хозяина, которые потенциально представлены компонентами внеклеточного матрикса (ECM) или конкретными углеводными группами гликопротеинов и гликолипидов (Scott J.R. and Zähner D, 2006, Mol. Microbiol. 62, 320-330; Telford, J.L. et al., 2006, Nat. Rev. Microbiol. 4, 509-519).

Присутствие ворсинкообразных структур у грамположительных бактерий фактически впервые наблюдали в поздние 1960 годы при электронной микроскопии Corynebacterium renale (Yanagawa, R. et al., 1968, Jpn. J. Vet. Res. 16, 31-37), и в последующие годы ворсинки выявлены у нескольких других грамположительных бактериальных видов, включая самое недавнее открытие ворсинок у трех основных вызывающих заболевания у людей стрептококковых патогенных микроорганизмов, т.е. Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae и Streptococcus pneumoniae (Telford, J.L. et al., 2006, Nat. Rev. Microbiol. 4, 509-519). Наиболее подробные характеристические исследования ворсинок грамположительных микроорганизмов проводили на коринебактериальных, стрептококковых и бациллярных патогенных микроорганизмах.

В отличие от грамотрицательных бактерий ворсинки у грамположительных бактерий являются более тонкими в диаметре (от 2 до 3 нм) и более трудно визуально различимы, что также дает возможность предположить, почему у многих видов грамположительных бактерий наличие этих ворсинок могло остаться невыявленным (Kang, H.J. et al., 2007, Science 318, 1625-1628). В настоящее время наиболее полное описание процесса сборки ворсинок, которое также в основном характерно для всех ворсинок грамположительных микроорганизмов, сделано при характеристических исследованиях in vivo биогенеза у Corynebacterium diphtheriae (Ton-That, H. and Schneewind, O. 2004, Trends Microbiol. 12, 228-234). Структурно прототипические ворсинки выглядят как полимеры, состоящие из ковалентно связанных поперечными связями белковых субъединиц (называемых пилинами), которые также ковалентно прикреплены ну основе пептидогликанового компонента клеточной стенки, где оба вида этих ковалентных связей ферментативно зависят от катализа различными мембраносвязанными транспептидазами семейства сортаз, т.е. специфичными к пилинам и конститутивными сортазами, соответственно (Mandlik, A. et al., 2008, Trends Microbiol. 16, 33-40). Ворсинка грамположительной бактерии, как правило, состоит из трех пилиновых субъединиц, и в случае C. diphtheriae белки (или кодирующие их гены) называются SpaA (spaA) (опосредованная сортазой сборка пилина) для основной пилиновой субъединицы, которая целиком формирует ствол или каркас ворсинки, SpaB (spaB) для дополнительной второстепенной пилиновой субъединицы и SpaC (spaC) для другой второстепенной пилиновой субъединицы с адгезивными свойствами, располагающейся на верху ворсинки (фиг.1). Гены, кодирующие эти три пилиновые субъединицы расположены в пределах одних и тех же локусов в виде кластера генов пилинов, наряду по меньшей мере с одним геном, кодирующим специфичную к пилинам сортазу в непосредственной близости. Также гены в пределах пилинового кластера на обоих концах часто фланкированы мобильными генетическими элементами, позволяющими сделать предположение о происхождении посредством горизонтального переноса генов. Транскрипция всех этих генов происходит в одинаковом направление и свидетельствует о регуляторном контроле оперона (Scott J.R. and Zähner D, 2006, Mol. Microbiol. 62, 320-330).

Пересмотренная модель общего процесса сборки ворсинок грамположительных бактерий, который зависит от нескольких различных консервативных мотивов и доменов в первичной последовательности каждой пилиновой субъединицы включает четыре основные стадии (Mandlik, A. et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 14147-14152; Telford, J.L. et al., 2006, Nat. Rev. Microbiol. 4, 509-519) (фиг.1). На первой стадии через мембрану бактериальных клеток посредством зависимого от Sec пути секретируются пилиновые белки, каждый из которых содержит N-концевой сигнальный пептид, а затем они удерживаются в мембране клетки вследствие наличия C-концевого трансмембранного домена, состоящего из гидрофобной области приблизительно из 20 остатков и положительно заряженного хвоста.

На второй стадии процесса сборки для зависимого от сортазы расщепления прикрепленных к клеточной мембране пилиновых белков становится доступным сигнал сортировки клеточной стенки (CWSS), предпочтительно мотив LPXTG, который также непосредственно предшествует трансмембранному домену. Специфичная к пилинам сортаза расщепляет этот мотив из пяти остатков между остатками треонина (T) и глицина (G) и формирует промежуточное соединение ацил-фермент, включающее ковалентную тиоэфирную связь между карбоксильной группой остатка треонина и цистеинилтиолом, находящимся в каталитическом кармане сортазы.

Третья стадия представляет собой полимеризацию пилиновых субъединиц посредством образования изопептидных связей и включает расщепление тиоэфирной связи и высвобождение сортазы из пилиновой субъединицы посредством нуклеофильной атаки ε-аминогруппы боковой цепи остатка лизина (K), консервативной в пилиновом мотиве (WXXXVXVYPKN) второй пилиновой субъединицы. Полагают, что формируется амидная связь между C-концевым карбоксилом треонинового остатка в первой пилиновой субъединице и боковой цепью аминогруппы лизина пилинового мотива из второй пилиновой субъединицы, все еще связанной в виде ковалентного тиоэфира с другой специфичной к пилинам сортазой (Budzik, J.M. et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 10215-10220). В этой модели сборки ворсинок растущая полимерная структура снабжается дополнительными пилиновыми субъединицами у основания ворсинки и общая длина регулируется количеством доступных пилиновых субъединиц, ассоциированных со специфичными к пилинам сортазами. Так как пилиновый мотив является характеристическим признаком основной (SpaA) и дополнительных второстепенных (SpaB) пилиновых субъединиц, но отсутствует в первичной последовательности второстепенных пилиновых субъединиц (SpaC), демонстрирующих адгезивные свойства, вероятно, эта пилиновая субъединица расположена на верху ствола ворсинки и является первой пилиновой субъединицей для инициации полимеризации ворсинки.

Четвертой стадией процесса сборки является прикрепление полимеризованной ворсинки к клеточной стенке. На этой стадии дополнительная второстепенная пилиновая субъединица (SpaB) сигнализирует о прекращении полимеризации ворсинки, но только тогда, когда находится в ассоциации с конститутивной сортазой, ген которой кодируется где-либо в другом месте генома. На этой финальной стадии растущая полимерная структура из основных пилиновых субъединиц (SpaA) переносится из тиоэфирной связи со специфичной к пилинам сортазой с формированием амидной связи с боковой цепью лизина в пилиновом мотиве второстепенной пилиновой субъединицы SpaB, которая связана в виде промежуточного соединения ацил-фермент с конститутивной сортазой. Затем нуклеофильная атака аминогруппой пентапептида пептидогликанового предшественника липида II позволяет конститутивной сортазе катализировать прикрепление полимера связанной с пилином SpaB ворсинки к клеточной стенке. Третьим и менее охарактеризованным консервативным мотивом первичной последовательности (YXLXETXAPXGY), найденным между мотивом LPXTG и пилиновым мотивом в пилиновых субъединицах многих грамположительных бактерий, является E-бокс.

К настоящему времени определение трехмерных (3-D) структур посредством рентгеноструктурной кристаллографии позволило получить понимание структурных особенностей сборки и функции только для двух белков пилиновых субъединиц грамположительных бактерий. Krishnan et al. (2007, Structure 15:893-903) установили кристаллическую структуру для второстепенного пилина GBS52 Streptococcus agalactiae и выявили наличие IgG-подобных доменных укладок, обладающих структурным сходством с коллаген-связывающим белком Cna S. aureus, что также указывает на то, как эта второстепенная пилиновая субъединица может способствовать адгезии ворсинки к конкретной ткани хозяина. Кристаллическая структура основного пилина Spy0128 Streptococcus pyogenes, установленная Kang et al. (2007, Science 318, 1625-1628), продемонстрировала, как спонтанно образующиеся внутримолекулярные изопептидные связи между боковыми цепями лизина и остатками аспарагина в пилиновой субъединице могут также дополнять катализируемые сортазами межмолекулярные изопептидные связи для поддержания общей прочности и стабильности ворсинок.

Большинство пробиотических микроорганизмов являются представителями грамположительных лактобацилл и бифидобактерий, и существует длительная традиция их использования в ферментируемых пищевых продуктах и молочных продуктах (Goldin, B.R. and Gorbach, S.L. 2008, Clin. Infect. Dis. 46, S96-S100; Ljungh, A. and Wadstrom, T. 2006, Curr. Issues Intest. Microbiol. 7, 73-89; Salminen, S. et al., 1998, Br. J. Nutr. 80, S147-S171). Ворсинчатые структуры пробиотических лактобацилл или гены, кодирующие эти ворсинчатые структуры, в литературе не описаны. У Lactobacillus rhamnosus никогда не было показано наличия ворсинкообразных структур или полинуклеотидов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является предоставление новых полипептидов ворсинок, а также кодирующих их полинуклеотидов. Кроме того, целью изобретения является предоставление новых ворсинчатых структур. Кроме того, целью изобретения является предоставление новых способов, применений и продуктов, связанных с указанными выше пептидами, полипептидами, белками, ворсинчатыми структурами и полинуклеотидами.

Настоящее изобретение относится к пептидам, содержащим последовательность, где последовательность по меньшей мере на 94% идентична с SEQ ID NO:1 (GG00441), где последовательность по меньшей мере на 94% идентична с SEQ ID NO:2 (GG00442), где последовательность по меньшей мере на 84% идентична с SEQ ID NO:3 (GG00443), где последовательность по меньшей мере на 91% идентична с SEQ ID NO:4 (GG00444), где последовательность по меньшей мере на 83% идентична с SEQ ID NO:5 (GG02369), где последовательность по меньшей мере на 94% идентична с SEQ ID NO:6 (GG02370), где последовательность по меньшей мере на 93% идентична с SEQ ID NO:7 (GG02371) или где последовательность по меньшей мере на 93% идентична с SEQ ID NO:8 (GG02372), или к их фрагментам или вариантам.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим пептидную последовательность, где последовательность по меньшей мере на 94% идентична с SEQ ID NO:1 (GG00441), где последовательность по меньшей мере на 94% идентична с SEQ ID NO:2 (GG00442), где последовательность по меньшей мере на 84% идентична с SEQ ID NO:3 (GG00443), где последовательность по меньшей мере на 91% идентична с SEQ ID NO:4 (GG00444), где последовательность по меньшей мере на 83% идентична с SEQ ID NO:5 (GG02369), где последовательность по меньшей мере на 94% идентична с SEQ ID NO:6 (GG02370), где последовательность по меньшей мере на 93% идентична с SEQ ID NO:7 (GG02371) или где последовательность по меньшей мере на 93% идентична с SEQ ID NO:8 (GG02372), или с их фрагментами или вариантами.

Настоящее изобретение также относится к ворсинчатой структуре, содержащей по меньшей мере один из пептидов по изобретению, продукту, содержащему по меньшей мере один пептид или одну ворсинчатую структуру по изобретению, и к фармацевтической или пищевой композиции, содержащей по меньшей мере один пептид или одну ворсинчатую структуру по изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение относится к продукту, содержащему по меньшей мере один пептид или одну ворсинчатую структуру по изобретению, для применения в качестве лекарственного средства или для профилактики или лечения диареи, артериальной гипертензии, сосудистых заболеваний, аллергий, злокачественной опухоли, атопических заболеваний, вирусных заболеваний, инфекционных заболеваний, инфекций мочевыводящих путей, респираторных инфекций, зубного кариеса, синдрома раздраженного кишечника (IBS), воспалительного заболевания кишечника (IBD), воспаления слизистой, нарушений проницаемости кишечника, ожирения, метаболического синдрома, окислительного стресса или боли в животе.

Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию по меньшей мере одного пептида или одной ворсинчатой структуры по изобретению в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики диареи, артериальной гипертензии, сосудистых заболеваний, аллергий, злокачественной опухоли, атопических заболеваний, вирусных заболеваний, инфекционных заболеваний, инфекций мочевыводящих путей, респираторных инфекций, зубного кариеса, IBS, IBD, воспаления слизистой, нарушений проницаемости кишечника, ожирения, метаболического синдрома, окислительного стресса или боли в животе.

Кроме того, настоящее изобретение относится по меньшей мере к одному пептиду или к одной ворсинчатой структуре по изобретению для лечения или профилактики диареи, артериальной гипертензии, сосудистых заболеваний, аллергий, злокачественной опухоли, атопических заболеваний, вирусных заболеваний, инфекционных заболеваний, инфекций мочевыводящих путей, респираторных инфекций, зубного кариеса, IBS, IBD, воспаления слизистой, нарушений проницаемости кишечника, ожирения, метаболического синдрома, окислительного стресса или боли в животе.

Кроме того, настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность любого из SEQ ID NO:9-16, или к его вырожденной последовательности, или кодирующему пептид по изобретению, к вектору, содержащему полинуклеотид по изобретению, к клетке-хозяину, содержащей полинуклеотид или пептид по изобретению, и к кластеру генов, содержащему по меньшей мере один полинуклеотид по изобретению.

Также настоящее изобретение относится к антителу/антителам к пептидам по изобретению или их функциональным доменам.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения или профилактики диареи, артериальной гипертензии, сосудистых заболеваний, аллергий, злокачественной опухоли, атопических заболеваний, вирусных заболеваний, инфекционных заболеваний, инфекций мочевыводящих путей, респираторных инфекций, зубного кариеса, IBS, IBD, воспаления слизистой, нарушений проницаемости кишечника, ожирения, метаболического синдрома, окислительного стресса или боли в животе, включающему введение индивидууму по меньшей мере одного пептида или одной ворсинчатой структуры по изобретению.

Настоящее изобретение относится к способу скрининга бактериальных штаммов, содержащих по меньшей мере один полинуклеотид по изобретению или его фрагмент, где способ включает:

i) получение из бактериальных штаммов ДНК или РНК;

ii) гибридизацию праймеров или зондов, специфичных к полинуклеотиду по изобретению или его фрагменту, с ДНК или РНК из стадии i) и, необязательно, амплификацию полинуклеотида или его фрагмента;

iii) детекцию по меньшей мере одного полинуклеотида или его фрагмента, гомологичных полинуклеотиду по изобретению или его фрагменту.

Настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного полинуклеотида по изобретению или его фрагмента или по меньшей мере одного антитела по изобретению для скрининга бактериальных штаммов.

Настоящее изобретение относится к способу скрининга бактериальных штаммов, содержащих по меньшей мере один пептид или одну ворсинчатую структуру по изобретению, с применением по меньшей мере одного антитела по изобретению, где способ включает:

i) получение белков бактериальных штаммов;

ii) детекцию по меньшей мере одного полипептида, одной ворсинчатой структуры или их фрагмента с применением антитела/антител.

Настоящее изобретение относится к способу снижения или подавления адгезии патогенных бактерий к желудочно-кишечному тракту, к эпителию или к слизи индивидуума, где способ включает введение индивидууму по меньшей мере одного пептида и/или одной ворсинчатой структуры по изобретению.

Настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного пептида и/или одной ворсинчатой структуры по изобретению для снижения или подавления адгезии патогенных бактерий к желудочно-кишечному тракту, к эпителию или к слизи индивидуума.

Настоящее изобретение относится по меньшей мере к одному пептиду или к одной ворсинчатой структуре по изобретению для снижения или подавления адгезии патогенных бактерий к желудочно-кишечному тракту, к эпителию или к слизи индивидуума.

Настоящее изобретение относится к способу стимуляции адгезии бактериальной клетки или адгезии любого другого средства к слизи или эпителию, где способ включает:

i) получение по меньшей мере одного пептида или одной ворсинчатой структуры по изобретению или их фрагмента;

ii) экспозицию пептида, ворсинчатой структуры и/или их фрагмента на бактериальной клетке или на любом другом средстве;

iii) приведение бактериальной клетки или любого другого средства в контакт со слизью или эпителием.

Настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного пептида или одной ворсинчатой структуры по изобретению для стимуляции адгезии бактериальных клеток или адгезии любого другого средства к слизи или эпителию.

Настоящее изобретение относится по меньшей мере к одному пептиду или одной ворсинчатой структуре по изобретению для стимуляции адгезии бактериальных клеток или адгезии любого другого средства к слизи или эпителию.

Настоящее изобретение относится к способу модификации иммунного ответа у индивидуума, где способы включают:

i) получение по меньшей мере одного пептида или одной ворсинчатой структуры по изобретению или их фрагмента;

ii) экспозицию пептида, ворсинчатой структуры и/или их фрагмента на клетке-хозяине;

iii) необязательно приведение клетки-хозяина в контакт со слизью или другой клеткой-хозяином.

Настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного пептида или одной ворсинчатой структуры по изобретению для модификации иммунного ответа.

Настоящее изобретение относится по меньшей мере к одному пептиду или одной ворсинчатой структуре по изобретению для модификации иммунного ответа.

Настоящее изобретение относится к способу получения продукта по изобретению, где способ включает стадию получения для продукта по меньшей мере одного пептида или одной ворсинчатой структуры по изобретению.

Настоящее изобретение также относится к способу получения по меньшей мере одного пептида или одной ворсинчатой структуры по изобретению, где способ включает следующие стадии:

i) получение по меньшей мере одного полинуклеотида по изобретению;

ii) трансформация клетки-хозяина полинуклеотидом(ами);

iii) культивирование клетки-хозяина из стадии ii) с получением пептида(ов) или ворсинчатой структуры;

iv) необязательно выделение пептида(ов) или ворсинчатой структуры.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения по меньшей мере одного пептида или одной ворсинчатой структуры по изобретению, где способ включает следующие стадии:

i) разрушение клетки, продуцирующей или содержащей по меньшей мере один пептид или одну ворсинчатую структуру по изобретению;

ii) необязательно, выделение пептида(ов) или ворсинчатой структуры.

Также настоящее изобретение относится к способу получения по меньшей мере одного пептида по изобретению, где способ включает следующие стадии:

i) получение аминокислот;

ii) производство по меньшей мере одного пептида по изобретению из аминокислот из стадии i) с синтезом по меньшей мере одного пептида.

Настоящее изобретение относится к способу детекции потенциальных пробиотических бактериальных штаммов с применением биоинформатических подходов, где способ включает следующие стадии:

i) получение последовательности по меньшей мере одного пептида, полинуклеотида или их фрагментов;

ii) сравнение последовательности из стадии i) с последовательностями из коллекций последовательностей;

iii) детекция последовательностей с биологически подобными фрагментами с последовательностями из стадии i) или высокоидентичными с последовательностью из стадии i).

Настоящее изобретение также относится к способу детекции патогенных штаммов, против которых эффективны пептиды или ворсинчатые структуры по изобретению, с применением биоинформатических подходов, где способ включает:

i) получение последовательности по меньшей мере одного пептида, полинуклеотида или их фрагментов;

ii) сравнение последовательности из стадии i) с последовательностями из коллекций последовательностей;

iii) детекцию последовательностей с биологически подобными фрагментами с последовательностью из стадии I) или высокоидентичными с последовательностью из стадии i).

Пептиды, ворсинчатые структуры и полинуклеотиды по изобретению предоставляют средства для дальнейших разработок в пищевой, кормовой, косметической и фармацевтической индустрии. Настоящее изобретение обеспечивает быстрые и эффективные способы скрининга и надежный и точный качественный или количественный анализ множества бактериальных штаммов. Таким образом, способы и средства по изобретению обеспечивают выявление новых пробиотических бактериальных штаммов, а также открытие новых продуктов (включая ингредиенты, добавки и продукты питания), лекарственных средств и терапевтических способов. Кроме того, благодаря настоящему изобретению становятся доступными более эффективные и специфические способы лечения.

Существует постоянная очевидная необходимость предоставления потребителям новых продуктов с четко выраженным действием на здоровье и получаемым в форме, позволяющей их использование самих по себе или в виде части другого продукта, такого как фармацевтический, или пищевой, или кормовой продукт. По настоящему изобретению продукты также применимы в виде капсул, пилюль или таблеток, которые обеспечивают использование в виде удобной части или добавки, например, для повседневной диеты или лечения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1a и 1b демонстрируют модели сборки и ковалентного прикрепления ворсинок к клеточной стенке у грамположительных Corynebacteria.

На фиг.2 представлены кластеры ворсинок GG Lactobacillus rhamnosus (LGG), включающие гены, кодирующие специфичные к пилинам сортазы, основной белок ствола ворсинки, второстепенный белок ствола ворсинки и кэпирующие белки ворсинки. CWSS означает сигнал формирования клеточной стенки, т.е. консервативный мотив, найденный у множества грамположительных бактерий. Пилиновый мотив и E-бокс также означают консервативные мотивы, найденные у множества грамположительных бактерий.

На фиг.3 представлены примеры поликлональных антител, связывающихся с пептидами GG00442, GG00443, GG00444, GG02370, GG02371 и GG02372 ворсинчатой структуры LGG.

На фиг.4 представлена фазово-контрастная фотография на атомно-силовом микроскопе выступающих ворсинчатых структур LGG.

На фиг.5a и 5b представлено связывание рекомбинантных меченых гистидином белков LGG, т.е. пилиновых белков SpaA, SpaB, SpaC, SpaD и SpaF, со слизью кишечника человека in vitro. В качестве источника слизи на полистироловом планшете для микротитрования использовали удаленную ткань кишечника человека. Связанные белки детектировали посредством твердофазного иммуноферментного анализа.

На фиг.6a и 6b представлен вестерн-блоттинг фракций клеточной стенки LGG, а в качестве отрицательного контроля LC705 L. rhamnosus (LC705), выращенных в среде mTSB или в среде MRS + 0,6% бычья желчь с использованием специфичных к пилиновым белкам SpaA и SpaC поликлональных антител соответственно. Фиг.6a демонстрирует наличие у LGG содержащих SpaA ворсинок и мономеров SpaA, а фиг.6b демонстрирует наличие у LGG содержащих SpaC ворсинок и мономеров SpaC. Дорожка 1: рекомбинантный пилиновый белок SpaA/SpaC; дорожка 2: LGG, выращенный в mTSB; дорожка 3: LGG, выращенный в MRS + 0,6% бычья желчь; дорожка 4: LC705, выращенный в mTSB, дорожка 5: LC705, выращенный в MRS + 0,6% бычья желчь. Используемое антитело указано вверху каждого рисунка. На фиг.6b на панели A: дорожки 1-5 подвергали воздействию в течение 1 секунды; Panel B: дорожки 2-5 раздельно подвергали воздействию в течение 60 секунд. Положения стандартов молекулярных масс указаны слева в виде килодальтон. HMW означает высокомолекулярный лестничный маркер. Фиг.6c демонстрирует наличие содержащих SpaB ворсинок и мономеров SpaB в вестерн-блоттинге фракций клеточной стенки у LGG. Дорожка 1: маркер молекулярной массы; дорожка 2: LGG, выращенный в MRS. Детекцию проводили со специфичными к пилиновому белку SpaB поликлональными антителами, конъюгатом IgG козы к антителам кролика и AP (BioRad) и красителем BCIP/NBT.

На фиг.7a-c представлены результаты скрининга посредством ПЦР новых пробиотических штаммов с ворсинчатыми структурами. Фиг.7a-c демонстрируют продукты амплификации GG Lactobacillus rhamnosus, LC705 Lactobacillus rhamnosus и ATCC 334 Lactobacillus casei соответственно. Дорожки 1: маркер молекулярной массы; дорожки 2: продукт амплификации с праймерами для SpaF; дорожки 3: продукт амплификации с праймерами для SpaE; дорожки 4: продукт амплификации с праймерами для SpaD; дорожки 5: продукт амплификации с праймерами для SpaC; дорожки 6: продукт амплификации с праймерами для SpaB; дорожки 7: продукт амплификации с праймерами для SpaA.

На фиг.8a-d представлены сигналы при гибридизации по Саузерну, означающие наличие spaC, spaB или spaA в ATCC 334 L. casei, LC705 L. rhamnosus и GG L. rhamnosus. На фиг.8a представлены расщепленные геномные ДНК, разделенные посредством электрофореза в агарозном геле, а на фиг.8b, 8c и 8d представлена гибридизация по Саузерну тех же ДНК с использованием в качестве зонда меченных DIG продукта амплификации ПЦР гена spaC GG Lactobacillus rhamnosus длиной 801 п.н., продукта амплификации ПЦР гена spaB GG Lactobacillus rhamnosus длиной 612 п.н. или продукта амплификации ПЦР гена spaA GG Lactobacillus rhamnosus длиной 780 п.н. соответственно. Дорожка 1: маркер молекулярной массы I смесь HindIII-φX174 HaeIII; дорожка 2: меченый DIG маркер молекулярной массы II (Roche); дорожка 3: ATCC 334 Lactobacillus casei, расщепленный HindIII; дорожка 4: LC705 Lactobacillus rhamnosus, расщепленный HindIII; дорожка 5: GG Lactobacillus rhamnosus, расщепленный HindIII; дорожка 6: -; дорожка 7: немеченый зонд.

На фиг.9 представлены уровни TNF-α при стимуляции макрофагов 2×10⁶ КОЭ/мл живого GG Lactobacillus rhamnosus или приблизительно 30 пмоль/мл очищенных меченных меткой His белков SpaA, SpaB и SpaC GG Lactobacillus rhamnosus.

На фиг.10 представлено вытеснение патогенной бактерии Enterococcus faecium из слизи кишечника человека GG Lactobacillus rhamnosus или пилиновыми белками SpaC, SpaB и SpaA. Адгезия (%) представлена как среднее ± S.D. пяти параллельных экспериментов. * относится к значимо сниженной адгезии E. faecium (P<0,05).

На фиг.11a и 11b представлены нуклеотидные последовательности, кодирующие опероны ворсинок, представленные на фиг.2. На фиг.11a представлен оперон, кодирующий гены GG00441-GG00444 (жирным). Предполагаемые консервативные элементы последовательность -35 (подчеркиванием), последовательность -10 (двойным подчеркиванием), участок связывания рибосомы (подчеркнутым курсивом) и терминатор ро (подчеркнутым точками). На фиг.11b представлен оперон, кодирующий гены GG02369-GG02372 (жирным). Предполагаемые консервативные элементы последовательность -35 (подчеркиванием), последовательность -10 (двойным подчеркиванием), участок связывания рибосомы (подчеркнутым курсивом) и терминатор ро (подчеркнутым точками).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Молочнокислые бактерии используют в пищевой индустрии в течение долгого времени и в настоящее время их применяют в различных пищевых продуктах, таких как молочные продукты. Например, известно, что лактобациллы и бифидобактерии обладают пробиотическим действием, но способы, которыми пробиотические бактерии воздействуют на здоровье, понятны не полностью. Таким образом, дополнительные исследования пробиотиков являются оправданными.

Настоящее изобретение основано на открытии того, что грамположительные бактерии также содержат ворсинчатые структуры. Кроме того, изобретение основано на открытии новых пептидов ворсинок и ворсинчатых структур у грамположительных бактерий, в частности у лактобацилл, более конкретно у Lactobacillus rhamnosus.

Пептиды ворсинчатой структуры

В основном ворсинки грамположительных бактерий тянутся от наружной мембраны бактерий, как правило, составляя 1-4 мкм в длину и 2-8 нм в диаметре и находясь в малых количествах. Полагают, что ворсинки способствуют адгезии бактерий к поверхностям-мишеням. Фактически, как применяют в настоящем документе, выражение "ворсинчатая структура" относится к удлиненной волосковой или волосовидной белковой нити, содержащей несколько белковых субъединиц (предпочтительно более одной субъединицы). Сборка этих белков может зависеть от специфических белков, т.е. от сортаз. Белок с адгезивными свойства, как правило, расположен на верху ворсинки. Также адгезивными могут являться другие белки гетеромерной ворсинчатой структуры. Как применяют в настоящем документе, выражение "часть ворсинчатой структуры" относится к любому компоненту ворсинки, предпочтительно любому белку, или любому фрагменту, или любому варианту ворсинки. В предпочтительном варианте осуществления изобретения ворсинчатая структура расположена на поверхности микроорганизма или начинается от него.

Как применяют в настоящем документе, выражение "пептид" относится к любому пептиду, такому как дипептид, полипептид, белок и/или пилиновый белок.

В конкретном варианте осуществления изобретения характеристическими признаками пилина являются основная (SpaA), дополнительная второстепенная (SpaB) и кэпирующая (SpaC) пилиновые субъединицы.

Специфичные к пилину сортазы действуют, перенося в растущей полимерной структуре пилина SpaA на SpaC (фиг.1). В предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид, содержащий последовательность, где последовательность по меньшей мере на 94% идентична с SEQ ID NO:1 (GG00441), или последовательность, где последовательность по меньшей мере на 83% идентична с SEQ ID NO:5 (GG002369), представляет собой специфичную к пилину сортазу (фиг.2, также для обзора нуклеотидных последовательностей, кодирующих опероны ворсинок, представленные на фиг.2, см. фиг.11).

Вероятно, SpaA формирует каркас ворсинчатой структуры. Длина различных ворсинчатых структур зависит от количества SpaA в каркасе (фиг.1). В предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид, содержащий последовательность, где последовательность по меньшей мере на 94% идентична с SEQ ID NO:2 (GG00442), или последовательность, где последовательность по меньшей мере на 94% идентична с SEQ ID NO:6 (GG002370), представляет собой основной белок ствола ворсинки, т.е. основную пилиновую субъединицу (фиг.2, также для обзора нуклеотидных последовательностей, кодирующих опероны ворсинок, представленные на фиг.2, см. фиг.11). GG00442 и GG02370 содержат участок распознавания сортазы, таким образом являясь субстратами сортаз.

Вероятно, SpaB добавляется к ворсинчатой структуре на самой поздней стадии (конечная стадия) формирования ворсинки, и он формирует связь ворсинки с клеточной стенкой (фиг.1). В предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид, содержащий последовательность, где последовательность по меньшей мере на 84% идентична с SEQ ID NO:3 (GG00443), или последовательность, где последовательность по меньшей мере на 93% идентична с SEQ ID NO:7 (GG002371), представляет собой второстепенный белок ствола ворсинки (фиг.2, также для обзора нуклеотидных последовательностей, кодирующих опероны ворсинок, представленные на фиг.2, см. фиг.11). GG00443 и GG002371 содержат участок распознавания сортазы, таким образом являясь субстратами сортаз.

Вероятно, SpaC расположен на верху ствола ворсинки и является первой пилиновой субъединицей для инициации полимеризация ворсинок (фиг.1). В предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид, содержащий последовательность, где последовательность по меньшей мере на 91% идентична с SEQ ID NO:4 (GG00444), или последовательность, где последовательность по меньшей мере на 93% идентична с SEQ ID NO:8 (GG002372), представляет собой связывающий белок ворсинки (фиг.2, также для обзора нуклеотидных последовательностей, кодирующих опероны ворсинок, представленные на фиг.2, см. фиг.11). Белок GG00444 содержит домен фактора фон Виллебранда (vWF), а GG00444 и GG02372 содержат участки распознавания сортазы, таким образом являясь субстратами сортаз.

В конкретном варианте осуществления изобретения пептид или полипептид по изобретению содержит последовательность, по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,8, 99,9 или 100% идентичную с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или с их фрагментами или вариантами.

По конкретному варианту осуществления изобретения пептид по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,8, 99,9 или 100% идентичен с любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или с их фрагментами или вариантами.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения пептид имеет последовательность, представленную в любой из последовательностей SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их фрагментах или вариантах.

Идентичность любой последовательности или ее фрагментов, сравниваемой с последовательностью по настоящему изобретению, относится к идентичности любой последовательности, сравниваемой с целой последовательностью по настоящему изобретению. Идентичность последовательностей можно определять, например, с применением BLAST (Basic Local Alignment Search Tools, средства поиска основного локального выравнивания) или FASTA (FAST-All). При поисках параметры установок "штрафы за пропуск" и "матрица", как правило, выбирают по умолчанию.

Как применяют в настоящем документе, фрагмент или вариант пептида относится к любой части или варианту пептида, который может обладать биологической функцией. Вариант относится к пептиду с небольшими изменениями в последовательности пептид, например небольшие делеции, мутации или вставки. Как применяют в настоящем документе, "функциональный фрагмент или вариант пептида" относится, например, к фрагменту или варианту, способному формировать изопептидные связи между различными пилиновыми субъединицами (например, транспептидазная активность сп