Улучшенные способы очистки векторов на основе рекомбинантного aav

Улучшенные способы очистки векторов на основе рекомбинантного aav

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на выдачу патента США № 61/187601, поданной 16 июня 2009 года, включенной в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение, в основном, относится к области очистки векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), которые можно использовать для переноса генов и, конкретно, для генотерапии или вакцинации. Более конкретно, оно относится к способам очистки векторов на основе рекомбинантного rAAV, которые, по существу, не содержат компонентов, сопутствующих способу продукции, таких как клеточные нуклеиновые кислоты, клеточные белки, хелперный вирус и компоненты среды.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Аденоассоциированные вирусы (AAV) характеризуются уникальными чертами, которые придают им привлекательности в качестве векторов для генотерапии и генных вакцин. Инфицирование AAV клеток в культуре не приводит к цитопатологии, а происходящая в природе инфекция людей и других животных является молчащей, бессимптомной и не вовлечена в этиологию какого-либо заболевания человека. Кроме того, AAV инфицирует разнообразные типы клеток, включая многие клетки млекопитающих, что предоставляет возможность направленного действия на многие различные ткани in vivo. AAV инфицирует медленно делящиеся и неделящиеся клетки и может персистировать, по сути, в течение всей жизни этих клеток в качестве транскрипционно активной ядерной эписомы (внехромосомного элемента). Интегрированные копии вектора rAAV в таких органах, как печень или мышца, крайне редки. Сообщалось об эффективном долгосрочном переносе генов в ряд клеточных типов, включая клетки глаза, ЦНС, и мышцы. См., например, X. Xiao et al., J. Virol. 70(11):8098-8108 (1996); R.R. Ali et al., Hum. Mol. Genet. 5(5):591-94 (1996). Текущие клинические исследования, главным образом, сфокусированы на применении векторов на основе rAAV серотипа 2, но некоторые сообщения демонстрируют, что другие серотипы AAV, включая rAAV-1, rAAV-4, rAAV-5 и rAAV-8, характеризуются уникальным био-распределением in vivo, что делает их привлекательными вирусными серотипами с точки зрения тестирования в клинических испытаниях.

Аденоассоциированный вирус (AAV) является парвовирусом с дефицитом репликации, геном которого из одноцепочечной ДНК составляет приблизительно 4,7 тыс. н. длиной, и включает в себя инвертированный концевой повтор (ITR) длиной 145 нуклеотидов. Нуклеотидная последовательность AAV серотипа 2 (AAV2) представлена в Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983), с поправками в Ruffing et al., J. Gen. Virol., 75: 3385-3392 (1994). Действующие в цис-положении последовательности, направляющие репликацию вирусной ДНК (rep), заключение в капсид/упаковку и интеграцию в хромосому клетки-хозяина содержатся внутри ITR. Три промотора AAV p5, p19 и p40 (названные по их относительному положению на карте) управляют экспрессией двух внутренних открытых рамок считывания AAV, кодирующих гены rep и cap. Два промотора rep (p5 и p19), сопряженные с дифференциальным сплайсингом единственного интрона AAV в нуклеотидах 2107 и 2227, приводят к продукции четырех белков rep (rep78, rep68, rep52 и rep40) с гена rep. Белки rep обладают множественными ферментативными свойствами, которые, в конечном счете, отвечают за репликацию вирусного генома. Ген cap экспрессируется с промотора p40, и он кодирует три белка капсида VP1, VP2, и VP3. Участки альтернативного сплайсинга и неконсенсусного старта трансляции отвечают за продукцию трех родственных белков капсида. Единственный консенсусный участок полиаденилирования расположен в положении 95 карты генома AAV. Обзор жизненного цикла и генетики AAV осуществлен в Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).

Частицы AAV содержат белковый капсид, включающий в себя три белка капсида VP1, VP2 и VP3, внутри которого помещается геном из линейной одноцепочечной ДНК ~4,6 т.н. Индивидуальные частицы служат упаковкой только одной молекулярной цепи ДНК, но это может быть плюс- или минус-цепь. Частицы, содержащие любую из цепей, являются инфицирующими, и репликация происходит путем преобразования родительской единичной цепи в форму дуплекса и путем последующей амплификации, в результате которой единичные дочерние цепи вытесняются и упаковываются в капсиды. Дуплексные или одноцепочечные геномы AAV (иногда обозначаемые как «провирусная ДНК» или «провирус») могут встраиваться в бактериальные плазмиды или фагемиды и трансфицироваться в инфицированные аденовирусом клетки. См. Carter, Handbook of Parvoviruses, Vol. I, pp. 169-228 (1989), и Berns, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (1990) для общего обзора по AAV.

Продукция вектора на основе rAAV, в основном, требует четырех обычных элементов: 1) пермиссивной клетки-хозяина для репликации; 2) функции хелперного вируса, которая может быть предоставлена подходящими хелперными вирусами, такими как аденовирус или вирус герпеса, или, альтернативно, плазмидными конструкциями, содержащими минимальные аденовирусные хелперные функции; 3) транс-упаковывающей конструкции rep-cap; и 4) подходящей среды для продукции.

Частицы рекомбинантного AAV можно получать из лизатов упаковывающих клеток. См., например, Chirico и Trempe (1998) J. Virol. Methods 76:31-41. Однако, лизат клеток содержит различные клеточные компоненты, такие как ДНК клетки-хозяина, белки клетки-хозяина, компоненты сред и хелперный вирус или плазмидную ДНК хелперного вируса, которые следует отделить от вектора на основе rAAV до того, как он станет подходящим для применения in vivo. Недавние успехи продукции rAAV включают в себя применение процессов с суспензией неадгезивных клеток в биореакторах с механическим перемешиванием и условий продукции, при которых векторы на основе rAAV высвобождаются в среду или супернатант, со снижением концентрации компонентов клеток-хозяев, присутствующих в материале продукции, но данная среда все же содержит заметные количества образующихся в ходе процесса примесей. См. патент США № 6566118 и PCT WO 99/11764. Таким образом, частицы rAAV могут собираться из среды и/или лизата клеток и дополнительно очищаться.

Способы, включающие центрифугирование в градиенте плотности, используемое для очистки векторов на основе rAAV и, в частности, rAAV-2, не поддаются масштабированию. Недавние сообщения о векторах на основе rAAV-2 описывают способы очистки, в которых используется ионообменная хроматография, включая противоположную ионообменную хроматографию (включая катионную и анионную хроматографию). См., например, патент США № 6566118 и PCT WO 99/11764, в которых описаны способы применения комбинации противоположной ионообменной хроматографии для очистки векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса из культурального супернатанта и/или клеточного лизата. Дополнительные улучшения в получении концентрированного раствора rAAV включают применение обработки клеточного лизата дезоксихолатом, разделение в градиенте йодиксинола перед аффинной хроматографией, что приводит к получению высокого титра rAAV2 (Clark et al., Hum. Mol. Genet. 10(6):1031-39 (1999); Zolotukhin et al., Gene Therapy 6(6):973-985 (1999)). O'Riordan et al. (O'Riordan et al., J. Gene Med. 2:444-454 (2000); патент США № 7015026) также сообщают о масштабируемом способе хроматографической очистки векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса и, как, в частности, показано на примерах, векторов на основе rAAV-2, с использованием ионообменной хроматографии, хроматографии на гидроксиапатите, аффинной хроматографии на сульфате Cellufine и металлохелатной хроматографии с использованием цинка.

Недавно полученные данные указывают на то, что серотипы капсида rAAV, такие как rAAV-1, 4, 5 и 8, слабо связываются с анионными смолами, в виде очищенного исходного раствора вируса или в присутствии примесей, полученных в процессе продукции, таких как ДНК клетки-хозяина, белки клетки-хозяина, сывороточный альбумин, компоненты среды и компоненты хелперного вируса. Таким образом, очистка данных серотипов капсида, как правило, включает анионообменную хроматографию в комбинации с другими способами очистки, такими как центрифугирование в градиенте плотности йодоксинола. См., например, Zolotukhin et al., Methods 28(2): 158-167 (2002) и Kaludov et al., Hum. Gene Therapy 13:1235-1243 (2002); и патентную публикацию США № 2004/0110266 A1. Однако, данные способы не могут легко масштабироваться до процессов промышленного масштаба.

Таким образом, при разработке векторов на основе рекомбинантного AAV, таких как те, которые применяются в генотерапии и генных вакцинах, существует необходимость в способах очистки векторов на основе rAAV от компонентов, образующихся в процессе продукции, включая хелперный вирус, а также белки хелперного вируса, клеточные белки, ДНК клетки-хозяина и компоненты среды, присутствующие в исходном растворе продукции rAAV. Такие способы должны эффективно использоваться в масштабе, который подходит для практического применения способов генотерапии. Кроме того, существует необходимость для разработки способов очистки векторов rAAV, которые масштабируются с получением высокоочищенных коммерческих исходных растворов с высоким титром, которые могут использоваться для генотерапии и генных вакцин с участием rAAV. Более конкретно, существует необходимость для разработки способов очистки векторов на основе rAAV, которые слабо связываются с хроматографическими смолами и, в частности, с анионными смолами.

Описания всех публикаций, патентных заявок и патентов, цитируемых в данной спецификации, включены в настоящий документ в качестве ссылки, как если бы по каждой индивидуальной публикации, патентной заявке, или патенту было бы конкретно и отдельно указано, что они включены в качестве ссылки. В частности, все публикации, цитируемые в настоящем документе, определенно включены в настоящий документ в качестве ссылки для цели описания и раскрытия композиций и способов, которые могут использоваться согласно изобретению. Хотя изобретение, предоставленное в настоящем документе, описано в некоторых подробностях путем иллюстрации и примера для цели ясности понимания, специалисты в данной области легко поймут в свете изложения настоящего изобретения, что определенные изменения и модификации могут осуществляться в отношении него без уклонения от сущности и объема прилагаемой формулы изобретения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способам отделения популяции частиц рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) любого серотипа капсида от образующихся в процессе продукции примесей путем захвата частиц rAAV на среду для хроматографии на апатите в присутствии полиэтиленгликоля (PEG). Способы по изобретению содержат предшествующую обработку (такую как, например, центрифугирование, обработку Benzonase®, анионообменную фильтрацию и/или фильтрование тангенциальным потоком), а также последующую обработку (такую как, например, инактивацию нагреванием, фильтрацию, хроматографию на основе гидрофобных взаимодействий, гель-фильтрацию и/или анионообменную хроматографию). Предшествующие и последующие способы можно использовать отдельно или в различных сочетаниях.

Изобретение относится к способам отделения популяции частиц рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) от образующихся в ходе процесса примесей в потоке исходных материалов, включающий стадии: (a) приведения потока исходных материалов, содержащего частицы rAAV, в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии полиэтиленгликоля (PEG), где частицы rAAV связываются со средой хроматографии на апатите; и (b) элюирования частиц rAAV, связанных со средой хроматографии на апатите, с помощью буфера для элюирования, содержащего менее 3% (масс./об.) PEG. В определенных вариантах осуществления среда хроматографии на апатите представляет собой керамический гидроксиапатит (CHT) или керамический фторапатит (CFT). В определенных вариантах осуществления частицы rAAV, связанные со средой хроматографии на апатите, элюируют буфером элюции, содержащим менее чем 3% (масс./об.) PEG. В определенных вариантах осуществления частицы rAAV, связанные со средой хроматографии на апатите, элюируют буфером элюции в отсутствие PEG.

В некоторых вариантах осуществления специфическое связывание среды хроматографии на апатите составляет от 10⁶ до 10¹⁶ устойчивых к ДНКазе частиц (DRP) на миллилитр. В некоторых вариантах осуществления специфическое связывание среды хроматографии на апатите составляет от 10⁸ до 10¹⁶ устойчивых к ДНКазе частиц (DRP) на миллилитр. В некоторых вариантах осуществления специфическое связывание среды хроматографии на апатите составляет от 10¹⁰ до 10¹⁶ устойчивых к ДНКазе частиц (DRP) на миллилитр. В некоторых вариантах осуществления специфическое связывание среды хроматографии на апатите составляет от 10¹² до 10¹⁶ устойчивых к ДНКазе частиц (DRP) на миллилитр. В некоторых вариантах осуществления специфическое связывание среды хроматографии на апатите составляет от 10¹⁴ до 10¹⁶ устойчивых к ДНКазе частиц (DRP) на миллилитр.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает до стадии хроматографии на апатите стадию анионообменной фильтрации, где частицы rAAV находятся в фильтрате анионообменной фильтрации. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает концентрирование частиц rAAV из фильтрата анионообменной фильтрации путем тангенциальной потоковой фильтрации перед стадией хроматографии на апатите. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию связывания частиц rAAV в потоке исходных материалов, элюированных со среды хроматографии на апатите, с анионной средой хроматографии. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно содержит стадию инактивации нагреванием для инактивации хелперного вируса. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно содержит стадию связывания частиц rAAV в потоке исходных материалов со средой хроматографии на основе гидрофобных взаимодействий после хроматографии на апатите.

В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии полиэтиленгликоля (PEG) и основного буфера. В некоторых вариантах осуществления основный буфер характеризуется pH между 7,2 и 10, pH между 7,4 и 10, pH между 7,6 и 10, pH между 7,8 и 10, pH между 8,0 и 10,0, pH между 8,2 и 10,0, pH между 8,4 и 10,0, pH между 8,6 и 10,0, pH между 8,8 и 10, pH между 9,0 и 10,0, pH между 9,2 и 10, pH между 9,4 и 10,0, pH между 9,6 и 10,0, или pH между 9,8 и 10,0. В некоторых вариантах осуществления основный буфер характеризуется значением pH, приблизительно равным любому из 7,2, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4, 8,6, 8,8, 9,0, 9,2, 9,4, 9,6, 9,8, и 10,0. Можно использовать любой основный буфер, известный в данной области. В некоторых вариантах осуществления основный буфер содержит борат. В некоторых вариантах осуществления основный буфер представляет собой борат.

В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии полиэтиленгликоля (PEG). Например, можно использовать от приблизительно 3% (масс./об.) до приблизительно 10% (масс./об.) PEG. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 3% (масс./об.), приблизительно 3,5% (масс./об.), приблизительно 4% (масс./об.), приблизительно 4,5% (масс./об.), приблизительно 5% (масс./об.), приблизительно 5,5% (масс./об.), приблизительно 6% (масс./об.), приблизительно 6,5% (масс./об.), приблизительно 7% (масс./об.), приблизительно 7,5% (масс./об.), приблизительно 8% (масс./об.), приблизительно 8,5% (масс./об.), приблизительно 9% (масс./об.), приблизительно 9,5% (масс./об.), или приблизительно 10% (масс./об.) PEG.

В некоторых вариантах осуществления PEG характеризуется средней молекулярной массой между приблизительно 5000 (PEG5000) граммов на моль и приблизительно 15000 (PEG15000) граммов на моль, например, приблизительно 5000 граммов на моль (PEG5000), приблизительно 6000 (PEG6000) граммов на моль, приблизительно 7000 (PEG7000) граммов на моль, приблизительно 8000 (PEG8000) граммов на моль, приблизительно 9000 (PEG9000) граммов на моль, приблизительно 10000 (PEG10000) граммов на моль, приблизительно 11000 (PEG 11000) граммов на моль, приблизительно 12000 (PEG12000) граммов на моль, приблизительно 13000 (PEG 13000) граммов на моль, приблизительно 14000 (PEG14000) граммов на моль и приблизительно 15000 (PEG15000) граммов на моль. В определенных вариантах осуществления PEG характеризуется средней молекулярной массой, равной приблизительно 5000 (PEG5000) граммов на моль. В определенных вариантах осуществления PEG характеризуется средней молекулярной массой, равной приблизительно 6000 (PEG6000) граммов на моль. В определенных вариантах осуществления PEG характеризуется средней молекулярной массой, равной приблизительно 8000 (PEG8000) граммов на моль. В определенных вариантах осуществления PEG характеризуется средней молекулярной массой, равной приблизительно 10000 (PEG 10000) граммов на моль. В определенных вариантах осуществления PEG характеризуется средней молекулярной массой, равной приблизительно 15000 (PEG15000) граммов на моль.

В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии от приблизительно 3% (масс./об.) до приблизительно 10% (масс./об.) PEG6000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 3% (масс./об.) PEG6000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 4% (масс./об.) PEG6000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 5% (масс./об.) PEG6000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 6% (масс./об.) PEG6000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 7% (масс./об.) PEG6000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 8% (масс./об.) PEG6000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 9% (масс./об.) PEG6000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 10% (масс./об.) PEG6000.

В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии между приблизительно 3% (масс./об.) и приблизительно 10% (масс./об.) PEG8000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 3% (масс./об.) PEG8000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 4% (масс./об.) PEG8000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 5% (масс./об.) PEG8000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 6% (масс./об.) PEG8000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 7% (масс./об.) PEG8000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 8% (масс./об.) PEG8000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 9% (масс./об.) PEG8000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 10% (масс./об.) PEG8000.

В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии между приблизительно 3% (масс./об.) и приблизительно 10% (масс./об.) PEG10000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 3% (масс./об.) PEG10000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 4% (масс./об.) PEG 10000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 5% (масс./об.) PEG 10000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 6% (масс./об.) PEG 10000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 7% (масс./об.) PEG 10000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 8% (масс./об.) PEG 10000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 9% (масс./об.) PEG 10000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 10% (масс./об.) PEG 10000.

В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии между приблизительно 3% (масс./об.) и приблизительно 10% (масс./об.) PEG15000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 3% (масс./об.) PEG15000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 4% (масс./об.) PEG 15000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 5% (масс./об.) PEG 15000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 6% (масс./об.) PEG 15000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 7% (масс./об.) PEG 15000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 8% (масс./об.) PEG 15000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 9% (масс./об.) PEG 15000. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 10% (масс./об.) PEG15000.

В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в буфере, содержащем приблизительно 20 мМ борат с pH 9,0 и приблизительно 5% PEG (такого как PEG6000). В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов смешивают поточным путем с равным объемом буфера, содержащего приблизительно 40 мМ бората при pH 9,0 и приблизительно 10% PEG с получением конечной концентрации приблизительно 20 мМ бората при pH 9,0 и приблизительно 5% PEG.

В некоторых вариантах осуществления среду хроматографии на апатите со связанными с этой средой частицами rAAV отмывают для удаления полученных в процессе продукции примесей перед тем, как элюировать частицы rAAV. В некоторых вариантах осуществления среду хроматографии на апатите отмывают один или более раз промывочным буфером, содержащим снижающиеся концентрации PEG, для удаления полученных в процессе продукции примесей. В некоторых вариантах осуществления среду хроматографии на апатите отмывают один или более раз промывочным буфером, содержащим между приблизительно 3% (масс./об.) и приблизительно 10% (масс./об.) PEG. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер содержит приблизительно любую концентрацию из 10% (масс./об.), 9,5% (масс./об.), 9% (масс./об.), 8,5% (масс./об.), 8% (масс./об.), 7,5% (масс./об.), 7% (масс./об.), 6,5% (масс./об.), 6% (масс./об.), 5,5% (масс./об.), 5% (масс./об.), 4,5% (масс./об.), 4% (масс./об.), 3,5% (масс./об.), и 3% (масс./об.) PEG. В некоторых вариантах осуществления среду хроматографии на апатите отмывают один или более раз промывочным буфером, содержащим 7,5% (масс./об.) PEG6000. В некоторых вариантах осуществления среду хроматографии на апатите отмывают один или более раз промывочным буфером, содержащим 7,5% (масс./об.) PEG8000. В некоторых вариантах осуществления среду хроматографии на апатите отмывают один или более раз промывочным буфером, содержащим 7,5% (масс./об.) PEG10000. В некоторых вариантах осуществления среду хроматографии на апатите отмывают один или более раз промывочным буфером, содержащим 7,5% (масс./об.) PEG15000. В некоторых вариантах осуществления среду хроматографии на апатите отмывают один или более раз промывочным буфером, содержащим 5% (масс./об.) PEG6000. В некоторых вариантах осуществления среду хроматографии на апатите отмывают один или более раз промывочным буфером, содержащим приблизительно 5% (масс./об.) PEG8000. В некоторых вариантах осуществления среду хроматографии на апатите отмывают один или более раз промывочным буфером, содержащим приблизительно 5% (масс./об.) PEG 10000. В некоторых вариантах осуществления среду хроматографии на апатите отмывают один или более раз промывочным буфером, содержащим приблизительно 5% (масс./об.) PEG15000. В некоторых вариантах осуществления среду хроматографии на апатите отмывают один или более раз промывочным буфером, содержащим менее чем приблизительно 3% (масс./об.) PEG6000. В некоторых вариантах осуществления среду хроматографии на апатите отмывают один или более раз промывочным буфером, содержащим менее чем приблизительно 3% (масс./об.) PEG8000. В некоторых вариантах осуществления среду хроматографии на апатите отмывают один или более раз промывочным буфером, содержащим менее чем приблизительно 3% (масс./об.) PEG 10000. В некоторых вариантах осуществления среду хроматографии на апатите отмывают один или более раз промывочным буфером, содержащим менее чем приблизительно 3% (масс./об.) PEG15000. В некоторых вариантах осуществления среду хроматографии на апатите отмывают один или более раз промывочным буфером, не содержащим PEG.

В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер содержит буферы, известные в данной области. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер содержит буфер, выбранный из группы, состоящей из бората, N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты (HEPES) и Tris-HCl. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер содержит борат или является им. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер содержит HEPES или является ей. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер содержит Tris-HCl или является им. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер существует при основном pH. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер имеет pH между pH 7,0 и pH 10,0, между pH 7,2 и pH 10,0, между pH 7,4 и pH 10,0, между pH 7,6 и pH 10,0, между pH 7,8 и pH 10,0, между pH 8,0 и pH 10,0, между pH 8,2 и pH 10,0, между pH 8,4 и pH 10,0, между pH 8,6 и pH 10,0, между pH 8,8 и pH 10,0, между pH 9,0 и pH 10,0, между pH 9,2 и pH 10,0, между pH 9,4 и pH 10,0, между pH 9,6 и pH 10,0, или между pH 9,8 и pH 10,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер имеет pH, равный 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4, 8,6, 8,8, 9,0, 9,2, 9,4, 9,6, 9,8 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер содержит борат или является им при pH между 8,0 и 10,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер содержит борат или является им при pH 8,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер содержит борат или является им при pH 9,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер содержит борат или является им при pH 10,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер содержит HEPES или является ей при pH между 7,0 и 10,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер содержит HEPES или является ей при pH 7,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер содержит HEPES или является ей при pH 8,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер содержит HEPES или является ей при pH 9,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер содержит HEPES или является ей при pH 10,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер содержит Tris-HCl или является им при pH между 7,0 и 10,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер содержит Tris-HCl или является им при pH 7,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер содержит Tris-HCl или является им при pH 8,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер содержит Tris-HCl или является им при pH 9,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер содержит Tris-HCl или является им при pH 10,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер дополнительно содержит между 100 и 500 мМ фосфата. В некоторых вариантах осуществления промывочный буфер дополнительно содержит между 50 и 250 мМ NaCl.

В некоторых вариантах осуществления стадия промывки включает первую промывку промывочным буфером, содержащим приблизительно 30 мМ бората при pH приблизительно 9,0 и приблизительно 7,5% PEG; вторую промывку промывочным буфером, содержащим приблизительно 150 фосфата калия, приблизительно 20 мМ бората при pH приблизительно 9,0, и приблизительно 5% PEG; третью промывку промывочным буфером, содержащим приблизительно 20 мМ бората при pH приблизительно 9,0 и приблизительно 5% PEG; и четвертую промывку промывочным буфером, содержащим приблизительно 20 мМ HEPES при pH приблизительно 7,0 и 150 мМ NaCl.

В некоторых вариантах осуществления частицы rAAV, связанные со средой хроматографии на апатите, элюируют буфером для элюции, содержащим низкие концентрации PEG или не содержащим PEG. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюции содержит менее чем приблизительно 3% (масс./об.) PEG, менее чем приблизительно 2% (масс./об.) PEG, или менее чем приблизительно 1% (масс./об.) PEG. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюции содержит приблизительно 2,5% (масс./об.), приблизительно 2% (масс./об.), приблизительно 1,5% (масс./об.), приблизительно 1% (масс./об.) или приблизительно 0,5% (масс./об.) PEG, или не содержит PEG. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюции содержит менее чем приблизительно 3% (масс./об.) PEG6000. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюции содержит менее чем приблизительно 3% (масс./об.) PEG8000. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюции менее чем приблизительно 3% (масс./об.) PEG10000. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюции содержит менее чем приблизительно 3% (масс./об.) PEG15000. В некоторых вариантах осуществления частицы rAAV, связанные со средой хроматографии на апатите элюируют буфером для элюции в отсутствие PEG. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюции содержит буфер, выбранный из группы, состоящей из бората, N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты (HEPES) и Tris-HCl. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюции содержит борат или является им. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюции содержит HEPES или является ей. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюции содержит Tris-HCl или является им. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюции существует при нейтральном pH. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюции содержит HEPES или является ей при нейтральном pH. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюции содержит Tris-HCl или является им при нейтральном pH. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюции дополнительно содержит менее чем 100 мМ фосфата. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюции дополнительно содержит менее чем 50 мМ фосфата. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюции дополнительно содержит между 50 и 250 мМ NaCl. В некоторых вариантах осуществления частицы rAAV, связанные со средой для хроматографии на апатите, элюируют буфером для элюции, содержащим приблизительно 50 мМ фосфата калия, приблизительно 20 мМ HEPES при pH, равном приблизительно 7,0, и приблизительно 150 мМ NaCl.

В некоторых вариантах осуществления способ отделения частиц rAAV от полученных в процессе продукции примесей в потоке исходных материалов включает стадии: (a) приведения потока исходных материалов, содержащего частицы rAAV, в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 5% (масс./об.) PEG в основном буфере при pH, приблизительно равном 9,0, где частицы rAAV связываются со средой хроматографии на апатите; (b) промывки среды хроматографии на апатите первым промывочным буфером, содержащим приблизительно 30 мМ бората при pH, приблизительно равном 9,0, и приблизительно 7,5% PEG; (c) промывки среды хроматографии на апатите вторым промывочным буфером, содержащим приблизительно 150 фосфата калия, приблизительно 20 мМ бората при pH, приблизительно равном 9,0, и приблизительно 5% PEG; (d) промывки среды хроматографии на апатите третьим промывочным буфером, содержащим приблизительно 20 мМ бората при pH, приблизительно равном 9,0, и приблизительно 5% PEG; (e) промывки среды хроматографии на апатите четвертым промывочным буфером, содержащим приблизительно 20 мМ HEPES при pH, приблизительно равном 7,0, и 150 мМ NaCl; и (f) элюирования частиц rAAV, связанных со средой хроматографии на апатите, буфером для элюции, содержащим приблизительно 50 мМ фосфата калия, приблизительно 20 мМ HEPES при pH, приблизительно равном 7,0, и приблизительно 150 мМ NaCl.

Также в настоящем документе предоставлены способы отделения популяции частиц рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) от полученных в процессе продукции примесей в потоке исходных материалов, включающие стадии: (a) приведения потока исходных материалов, содержащих частицы rAAV, в контакт со средой хроматографии на основе гидрофобных взаимодействий (HIC) в буфере с высокой концентрацией солей, где частицы rAAV и примеси, полученные в процессе продукции, связываются со средой HIC; и (b) элюирования частиц rAAV, связанных со средой HIC, с помощью буфера со средней концентрацией солей. В некоторых вариантах осуществления среда HIC выбрана из группы, состоящей из смолы Tosoh Butyl 650M, Tosoh SuperButyl 650C, Tosoh Phenyl 650C, EMD Fractogel Phenyl и Tosoh Has(butyl). В некоторых вариантах осуществления буфер с высокой концентрацией солей содержит или представляет собой 0,5 M и 2,0 M цитрат (например, цитрат натрия). В некоторых вариантах осуществления буфер с высокой концентрацией солей содержит приблизительно любую концентрацию цитрата из 0,5 M, 0,75 M, 1,0 M, 1,25 M, 1,5 M, 1,75 M и 2,0 M. В некоторых вариантах осуществления буфер со средней концентрацией солей содержит менее чем 0,5 M цитрата (например, цитрата натрия) или представляет собой буфер с такой концентрацией. В некоторых вариантах осуществления буфер со средней концентрацией солей содержит от 0,5 M до приблизительно 0,3 M цитрата. В некоторых вариантах осуществления буфер со средней концентрацией солей содержит приблизительно любую концентрацию цитрата из 0,45 M, 0,4 M, 0,35 M, 0,3 M и 0,25 M. В некоторых вариантах осуществления буфер с высокой концентрацией солей дополнительно содержит от 1 до 100 мМ фосфата. В некоторых вариантах осуществления буфер со средней концентрацией солей дополни