Способ секреторной продукции белка

Способ секреторной продукции белка

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к коринеформной бактерии, эффективно продуцирующей гетерологичный белок посредством секреторной продукции, и способу секреторной продукции гетерологичного белка.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Что касается секреторной продукции гетерологичных белков микроорганизмами, к настоящему моменту сообщают о секреторной продукции гетерологичных белков бактериями Bacillus (непатентный документ 1), ассимилирующими метанол дрожжами Pichia pastoris (непатентный документ 2), нитевидными грибами рода Aspergillus (непатентные документы 3 и 4) и т.д.

Также пытались осуществлять секреторную продукцию гетерологичных белков коринеформными бактериями. Что касается секреторной продукции гетерологичных белков коринеформными бактериями, сообщали о секреции нуклеазы и липазы Corynebacterium glutamicum (далее также сокращенно называемой C. glutamicum) (патентный документ 1, непатентный документ 5), секреции протеазы, такой как субтилизин (непатентный документ 6), секреции белка с использованием сигнальных пептидов белков поверхностного слоя клетки PS1 и PS2 (также обозначаемых как CspB) коринеформных бактерий (патентный документ 2), секреции фибронектин-связывающего белка с использованием сигнального пептида PS2 (CspB) (непатентный документ 7), секреции протрансглутаминазы с использованием сигнальных пептидов белков поверхностного слоя клетки PS2 (CspB) и SlpA (также обозначаемого как CspA) коринеформных бактерий (патентный документ 3), секреции белка с использованием систем секреции различных типов (патентный документ 4), секреции протрансглутаминазы вариантным штаммом (патентный документ 5), секреции белка с использованием Tat-зависимого сигнального пептида (патентный документ 6) и т.д.

В качестве белков, подлежащих продукции посредством секреторной продукции, рассматривают различные белки. Однако, что касается секреторной продукции гетерологичных белков коринеформными бактериями, не сообщали о секреторной продукции какого-либо мультимерного белка, состоящего из множества субъединиц, например, родственных антителам молекул.

Пенициллинсвязывающий белок (PBP) - это общее название связывающихся с β-лактамными антибиотиками белков, ферментативная функция которых ингибируется при связывании с β-лактамными антибиотиками. Как правило, PBP являются мембрано-связанными белками, и их считают важными для синтеза клеточной стенки эубактериями. PBP классифицируют на высокомолекулярные PBP (HMW-PBP) и низкомолекулярные PBP (LMW-PBP) согласно их молекулярным массам. Среди них, HMW-PBP дополнительно классифицируют на высокомолекулярные PBP класса A (HMW-PBP класса A), имеющие транспептидазный домен, обладающий транспептидазной активностью для сшивания остатков пептидогликанов, и трансгликозилазный домен, обладающий трансгликозилазной активностью для образования полисахаридной цепи из дисахаридов, и на высокомолекулярные PBP B (HMW-PBP класса B), имеющие только транспептидазный домен.

Данные о PBP C. glutamicum подробно представлены в непатентных документах 8, 9 и т.д. К настоящему моменту у C. glutamicum обнаружили по меньшей мере девять гомологов PBP. Пять из них являются HMW-PBP, включая два HMW-PBP класса A (PBP1a, PBP1b) и три HMW-PBP класса B (FtsI, PBP2a, PBP2b). Известно, что HMW-PBP класса A C. glutamicum являются факторами, ответственными за увеличение размеров клеток, и HMW-PBP класса B являются факторами, ответственными за образование пептидогликана перегородок во время деления клетки.

Белки поверхностного слоя клетки являются белками, составляющими поверхностные слои клеток (S-слои) бактерий и архей. Для коринеформных бактерий в качестве белков поверхностного слоя клетки известны PS1 и PS2 (CspB) C. glutamicum (непатентный документ 10), SlpA (CspA) C. stationis (патентный документ 2) и т.д. Что касается PS2 (CspB), например, сообщают об аминокислотных последовательностях гомологов CspB 28 штаммов C. glutamicum (непатентный документ 11). Как описано выше, сигнальные пептиды белков поверхностного слоя клетки коринеформных бактерий используют в секреторной продукции белков (патентные документы 2, 3 и т.д.).

Однако, взаимосвязь между снижением активности пенициллинсвязывающего белка и/или снижением активности белка поверхностного слоя клетки и секреторной продукцией гетерологичного белка не известна.

Ссылки на предшествующий уровень техники

Патентные документы

Патентный документ 1: патент США №4965197

Патентный документ 2: патентная заявка Японии (Kohyo) №6-502548

Патентный документ 3: патент Японии №4320769

Патентный документ 4: патентная заявка Японии (Kokai) №11-169182

Патентный документ 5: патент Японии №4362651

Патентный документ 6: Патент Японии №4730302

Непатентные документы

Непатентный документ 1: Microbiol, rev., 57, 109-137 (1993)

Непатентный документ 2: Biotechnol., 11, 905-910 (1993)

Непатентный документ 3: Biotechnol., 6, 1419-1422 (1988)

Непатентный документ 4: Biotechnol., 9, 976-981 (1991)

Непатентный документ 5: J. Bacteriol., 174, 1854-1861 (1992)

Непатентный документ 6: Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613 (1995)

Непатентный документ 7: Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400 (1997)

Непатентный документ 8: Mol. Microbiol., 66, 643-57 (2007)

Непатентный документ 9: Antonie Van Leeuwenhoek, 94, 99-109 (2008)

Непатентный документ 10: Mol. Microbiol., 9, 97-109 (1993)

Непатентный документ 11: J Biotechnol., 112, 177-193 (2004)

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Цель изобретения

Целью настоящего изобретения является разработка нового способа улучшения способности коринеформной бактерии продуцировать гетерологичный белок посредством секреторной продукции, и, таким образом, предоставление коринеформной бактерии, продуцирующей гетерологичный белок посредством секреторной продукции, и способа секреторной продукции гетерологичного белка с использованием такой бактерии.

Средства достижения цели

Для достижения указанной выше цели авторы настоящего изобретения осуществляли различные исследования, и в результате они обнаруживали, что в способе продукции гетерологичного белка с использованием коринеформной бактерии в качестве экспрессирующего хозяина можно улучшать способность коринеформной бактерии продуцировать гетерологичный белок посредством секреторной продукции с помощью делеции гена, кодирующего пенициллинсвязывающий белок PBP1a, и гена, кодирующего белок поверхностного слоя клетки CspB коринеформной бактерии, и осуществлять настоящее изобретение.

Таким образом, настоящее изобретение относится к следующему.

[1] Коринеформной бактерии, обладающей способностью продуцировать гетерологичный белок посредством секреторной продукции,

модифицированной таким образом, что снижают активность пенициллинсвязывающего белка, и в которой снижена активность белка поверхностного слоя клетки, и

где пенициллинсвязывающий белок является белком, обладающим таким свойством, что, если его активность в коринеформной бактерии снижена, то количество гетерологичного белка, продуцируемого посредством секреторной продукции, повышается по сравнению с наблюдаемым для немодифицированного штамма.

[2] Указанной выше коринеформной бактерии, модифицированной таким образом, что активность пенициллинсвязывающего белка снижают посредством аттенуации экспрессии гена, кодирующего пенициллинсвязывающий белок, или разрушения гена.

[3] Указанной выше коринеформной бактерии, где пенициллинсвязывающий белок является PBP1a.

[4] Указанной выше коринеформной бактерии, где пенициллинсвязывающий белок является белком, определенным в следующих пп. (A) или (B):

(A) белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82,

(B) белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82, включающую замену, делецию, инсерцию или добавление от 1 до 10 аминокислотных остатков, и обладающий таким свойством, что, если его активность в коринеформной бактерии снижена, то количество гетерологичного белка, продуцируемого посредством секреторной продукции, повышается по сравнению с наблюдаемым для немодифицированного штамма.

[5] Указанной выше коринеформной бактерии, модифицированной таким образом, что активность белка поверхностного слоя клетки снижают посредством аттенуации экспрессии гена, кодирующего белок поверхностного слоя клетки, или разрушения гена.

[6] Указанной выше коринеформной бактерии, где белком поверхностного слоя клетки является CspB.

[7] Указанной выше коринеформной бактерии, где белком поверхностного слоя клетки является белок, определенный в следующих пп. (A) или (B):

(A) белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 98,

(B) белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 98, включающую замену, делецию, инсерцию или добавление от 1 до 10 аминокислотных остатков, и обладающий таким свойством, что, если его активность в коринеформной бактерии снижена, то количество гетерологичного белка, продуцируемого посредством секреторной продукции, повышается по сравнению с наблюдаемым для немодифицированного штамма.

[8] Указанной выше коринеформной бактерии, являющейся бактерией, принадлежащей к роду Corynebacterium или Brevibacterium.

[9] Указанной выше коринеформной бактерии, являющейся Corynebacterium glutamicum.

[10] Указанной выше коринеформной бактерии,

где коринеформная бактерия содержит генетическую конструкцию для секреторной экспрессии гетерологичного белка, и

где генетическая конструкция содержит последовательность промотора, функционирующую в коринеформной бактерии, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид, функционирующий в коринеформной бактерии и лигированный ниже последовательности промотора, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую гетерологичный белок и лигированную ниже последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальный пептид.

[11] Указанной выше коринеформной бактерии, где гетерологичный белок является родственной антителу молекулой.

[12] Указанной выше коринеформной бактерии, где родственная антителу молекула состоит из одного или нескольких белков, выбранных из Fab, F(ab′)₂/Fc-слитного белка и scFv.

[13] Способу продукции гетерологичного белка, включающему культивирование указанной выше коринеформной бактерии и сбор гетерологичного белка, продуцируемого посредством секреторной продукции.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 является фотографией, на которой представлены результаты электрофореза в ПААГ в присутствии SDS в восстанавливающих условиях, осуществляемого в случае, когда область H-цепи Fab-фрагмента трастузумаба экспрессировали в штамме YDK010 (родительском штамме) и штамме YDK010ΔPBP1a.

Фиг. 2 является фотографией, на которой представлены результаты электрофореза в ПААГ в присутствии SDS в восстанавливающих условиях, осуществляемого в случае, когда область H-цепи Fab-фрагмента трастузумаба экспрессировали в штамме YDK010 (родительском штамме), штамме YDK010ΔPBP1a и штамме YDK010ΔPBP1b.

Фиг. 3 является фотографией, на которой представлены результаты электрофореза в ПААГ в присутствии SDS в восстанавливающих условиях, осуществляемого в случае, когда область H-цепи Fab-фрагмента трастузумаба экспрессировали в штамме YDK010 (родительском штамме) и штамме YDK010ΔPBP1a.

Фиг. 4 является фотографией, на которой представлены результаты электрофореза в ПААГ в присутствии SDS в восстанавливающих условиях, осуществляемого в случае, когда область L-цепи Fab-фрагмента трастузумаба экспрессировали в штамме YDK010 (родительском штамме) и штамме YDK010ΔPBP1a.

Фиг. 5 является фотографией, на которой представлены результаты электрофореза в ПААГ в присутствии SDS в невосстанавливающих условиях, осуществляемого в случае, когда область H-цепи и область L-цепи Fab-фрагмента трастузумаба коэкспрессировали в штамме YDK010 (родительском штамме) и штамме YDK010ΔPBP1a.

Фиг. 6 является фотографией, на которой представлены результаты вестерн-блоттинга, осуществляемого в случае, когда F(ab′)₂-фрагмент трастузумаба экспрессировали в штамме YDK010 (родительском штамме) и штамме YDK010ΔPBP1a.

Фиг. 7 является фотографией, на которой представлены результаты вестерн-блоттинга, осуществляемого в случае, когда Fc-фрагмент трастузумаба экспрессировали в штамме YDK010 (родительском штамме) и штамме YDK010ΔPBP1a.

Фиг. 8 является графиком, на котором показано количество протрансглутаминазы, экспрессирующейся в штамме YDK010 (родительском штамме) и штамме YDK010ΔΡBP1a.

Фиг. 9 является фотографией, на которой представлены результаты электрофореза в ПААГ в присутствии SDS в восстанавливающих условиях, осуществляемого в случае, когда одноцепочечное антитело против дигоксина экспрессировали в штамме YDK010 (родительском штамме) и штамме YDK010ΔPBP1a.

Фиг. 10 является фотографией, на которой представлены результаты электрофореза в ПААГ в присутствии SDS в невосстанавливающих условиях, осуществляемого в случае, когда Fab(H&L)-фрагмент адалимумаба экспрессировали в штамме YDK010 (родительском штамме) и штамме YDK010ΔPBP1a.

Фиг. 11 является фотографией, на которой представлены результаты электрофореза в ПААГ в присутствии SDS в невосстанавливающих условиях, осуществляемого в случае, когда Fab(H&L)-фрагмент трастузумаба экспрессировали в штамме ATCC13869 (родительском штамме), штамме ATCC13869ΔCspB, штамме ATCC13869ΔPBP1a, и штамме ATCC13869ΔCspBΔPBP1a.

СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

<1> Коринеформная бактерия по настоящему изобретению

Настоящее изобретение относится к коринеформной бактерии, обладающей способностью продуцировать гетерологичный белок посредством секреторной продукции, модифицированной таким образом, что снижают активность пенициллинсвязывающего белка, и в которой снижена активность белка поверхностного слоя клетки (далее также обозначаемой как "бактерия по настоящему изобретению" или "коринеформная бактерия по настоящему изобретению").

В настоящем изобретении выражение, что белок "секретируется", означает, что белок транспортируется из бактериальной клетки (транспортируется внеклеточно). Выражение, что белок "секретируется", конечно, включает случай, когда все молекулы белка в конечном итоге существуют в среде полностью в свободной форме, а также включает случай, когда все молекулы белка существуют в поверхностном слое клети, и случай, когда часть молекул белка существует в среде, а остальная часть молекул существует в поверхностном слое клетки.

Т.е. в настоящем изобретении "способность продуцировать гетерологичный белок посредством секреторной продукции" относится к способности бактерии по настоящему изобретению секретировать гетерологичный белок в среду или поверхностный слой клетки, и накапливать его в среде или поверхностном слое клетки до такой степени, что гетерологичный белок можно собирать из среды или поверхностного слоя клетки, если бактерию культивируют в среде. Что касается накопленного количества, например, накопленное количество в среде может составлять предпочтительно 10 мкг/л или более, более предпочтительно - 1 мг/л или более, особенно предпочтительно - 100 мг/л или более, еще более предпочтительно - 1 г/л или более. Кроме того, что касается накопленного количества, например, накопленное количество в поверхностном слое клетки может являться таким, что, если гетерологичный белок в поверхностном слое клетки собирают и суспендируют в том же объеме жидкости, что и среда, концентрация гетерологичного белка в суспензии составляет предпочтительно 10 мкг/л или более, более предпочтительно - 1 мг/л или более, особенно предпочтительно - 100 мг/л или более. Кроме того, в настоящем изобретении термин "белок", продуцируемый посредством секреторной продукции, относится к понятию белка, включая пептид или полипептид.

В настоящем изобретении "гетерологичный белок" относится к белку, экзогенному для коринеформной бактерии, экспрессирующей и секретирующей этот белок. Гетерологичный белок, например, может являться белком, полученным из микроорганизма, белком, полученным из растения, белком, полученным из животного, белком, полученным из вируса, или белком, аминокислотную последовательность которого конструируют искусственно. Гетерологичный белок может являться мономерным белком или мультимерным белком. Мультимерный белок относится к белку, который может существовать в виде мультимера, состоящего из двух или более субъединиц. В мультимере субъединицы могут быть связаны ковалентными связями, такими как дисульфидные связи, соединены нековалентными связями, такими как водородные связи и гидрофобные взаимодействия, или соединены комбинацией этих связей. Предпочтительно, мультимер содержит одну или несколько межмолекулярных дисульфидных связей. Мультимер может являться гомомультимером, состоящим из субъединиц одного типа, или может являться гетеромультимером, состоящим из субъединиц двух или более типов. В случае, когда мультимер является гетеромультимером, достаточного того, чтобы по меньшей мере одна субъединица, выбранная из субъединиц, составляющих гетеромультимер, являлась гетерологичным белком. Т.е. все субъединицы могут являться гетерогенными, или только часть субъединиц может являться гетерогенной. Хотя гетерологичный белок в природе может являться секреторным белком или несекреторным белком, предпочтительно, чтобы в природе он являлся секреторным белком. Конкретные примеры "гетерологичного белка" представлены ниже.

Подлежащий продукции гетерологичный белок может состоять из белка одного типа или белков двух или более типов. Кроме того, если гетерологичный белок является гетеромультимером, может продуцироваться субъединица только одного типа, или могут продуцироваться субъединицы двух или более типов. Т.е. "секреторная продукция гетерологичного белка" включает секреторную продукцию всех субъединиц, составляющих целевой гетерологичный белок, а также секреторную продукцию только части субъединиц, составляющих целевой гетерологичный белок.

В настоящем изобретении коринеформные бактерии являются аэробными грамположительными бациллами и включают бактерии Corynebacterium, бактерии Brevibacterium, бактерии Microbacterium и т.д. Коринеформные бактерии включают бактерии, ранее классифицируемые как род Brevibacterium, но в настоящее время объединенные в род Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)). Коринеформные бактерии также включают бактерии, ранее классифицируемые как Corynebacterium ammoniagenes, но в настоящее время переклассифицированные в Corynebacterium stationis в результате анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д. (Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879 (2010)). Преимущества использования коринеформных бактерий включают тот факт, что они от природы секретируют крайне малые количества белка вовне клеток по сравнению с грибами, дрожжами и бактериями Bacillus, общепринято используемыми для секреторной продукции белков, и, таким образом, можно упрощать или исключать способ очистки гетерологичного белка, продуцируемого посредством секреторной продукции, и тот факт, что они хорошо растут в простой среде содержащей сахариды, аммиак, минеральные соли и т.д., и, таким образом, они превосходны с точки зрения стоимости среды, способа культивирования и производительности культивирования и т.д.

Конкретные примеры таких коринеформных бактерий включают следующие виды:

Corynebacterium acetoacidophilum

Corynebacterium acetoglutamicum

Corynebacterium alkanolyticum

Corynebacterium callunae

Corynebacterium glutamicum

Corynebacterium lilium

Corynebacterium melassecola

Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)

Corynebacterium herculis

Brevibacterium divaricatum

Brevibacterium flavum

Brevibacterium immariophilum

Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)

Brevibacterium roseum

Brevibacterium saccharolyticum

Brevibacterium thiogenitalis

Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)

Brevibacterium album

Brevibacterium cerinum

Microbacterium ammoniaphilum

Конкретные примеры таких коринеформных бактерий включают следующие штаммы:

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806

Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511

Corynebacterium callunae ATCC 15991

Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032,ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734

Corynebacterium lilium ATCC 15990

Corynebacterium melassecola ATCC 17965

Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539)

Corynebacterium herculis ATCC 13868

Brevibacterium divaricatum ATCC 14020

Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205)

Brevibacterium immariophilum ATCC 14068

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869

Brevibacterium roseum ATCC 13825

Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066

Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240

Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872

Brevibacterium album ATCC 15111

Brevibacterium cerinum ATCC 15112

Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354

Эти штаммы доступны, например, в American Type Culture Collection (ATCC) (адрес: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America). Т.е. каждому штамму присвоен уникальный регистрационный номер (http://www.atcc.org/), и его можно заказать с использованием этого регистрационного номера. Регистрационный номер каждого штамма приведен в каталоге ATCC.

В частности, предсказано, что штамм AJ12036 C. glutamicum (FERM BP-734), выделенный из штамма дикого типа ATCC 13869 C. glutamicum в качестве устойчивого к стрептомицину (Sm) мутантного штамма, содержит мутацию в функциональном гене, ответственном за секрецию белка, и он демонстрирует крайне высокую способность к секреторной продукции белков, до приблизительно 2-3 раз выше в терминах накопленного количества белка в оптимальных условиях культивирования по сравнению с родительским штаммом (штаммом дикого типа), и, таким образом, является предпочтительным в качестве бактерии-хозяина. Штамм AJ12036 (FERM BP-734) исходно хранили в National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (в настоящее время корпоративное административное учреждение, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, AIST TSukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) на 26 марта 1984 года в качестве международного депозита, и ему присвоен учетный номер FERM BP-734.

Кроме того, штамм, обладающий повышенной способностью продуцировать белок посредством секреторной продукции, можно выбирать из коринеформных бактерий, полученных из таких коринеформных бактерий, как указано выше, в качестве родительского штамма, с использованием способа мутагенеза или способа генетической рекомбинации, и использовать в качестве хозяина. Например, после обработки родительского штамма ультрафиолетовым излучением или химическим мутагеном, таким как N-метил-N′-нитрозогуанидин, можно выбирать штамм, обладающий повышенной способностью продуцировать белок посредством секреторной продукции.

Кроме того, если штамм получали модификацией такого штамма, как указано выше, таким образом, что он не продуцирует белок поверхностного слоя клетки в качестве хозяина, очистка гетерологичного белка, секретируемого в среду, становится легкой, и, таким образом, это является особенно предпочтительным. Такую модификацию можно осуществлять путем встраивания мутации в кодирующую область белка поверхностного слоя клетки или область контроля его экспрессии на хромосоме посредством мутагенеза или генетической рекомбинации. Примеры коринеформной бактерии, модифицированной таким образом, что она не продуцирует белок поверхностного слоя клетки, включают штамм YDK010 C. glutamicum (WO 2004/029254), являющийся дефектной по белку поверхностного слоя клетки PS2 версией штамма AJ12036 C. glutamicum (FERM BP-734).

Коринеформную бактерию, обладающую способностью продуцировать гетерологичный белок посредством секреторной продукции, можно получать встраиванием генетической конструкции для секреторной экспрессии гетерологичного белка в такой коринеформной бактерии, как указано выше, таким образом, что бактерия содержит конструкцию. Т.е. бактерия по настоящему изобретению содержит генетическую конструкцию для секреторной экспрессии гетерологичного белка. Термин "генетическая конструкция для секреторной экспрессии гетерологичного белка" и способ ее встраивания будут приведены ниже.

Бактерию по настоящему изобретению можно получать, модифицируя коринеформную бактерию, обладающую способностью продуцировать гетерологичный белок посредством секреторной продукции таким образом, что снижают активность пенициллинсвязывающего белка и активность белка поверхностного слоя клетки. Альтернативно, бактерию по настоящему изобретению также можно получать, модифицируя коринеформную бактерию таким образом, что снижают активность пенициллинсвязывающего белка и активность белка поверхностного слоя клетки, и затем придавая ей способность продуцировать гетерологичный белок посредством секреторной продукции. Кроме того, бактерию по настоящему изобретению также можно получать, модифицируя коринеформную бактерию, активность белка поверхностного слоя клетки которой от природы снижена таким образом, что бактерия обладает способностью продуцировать гетерологичный белок, а активность пенициллинсвязывающего белка снижена. В настоящем изобретении модификацию бактерии по настоящему изобретению придание ей способности можно осуществлять в произвольном порядке. Бактерия по настоящему изобретению может являться бактерией, получаемой из бактерии, которая может продуцировать гетерологичный белок посредством секреторной продукции до ее модификации таким образом, что снижают активность пенициллинсвязывающего белка и/или активность белка поверхностного слоя клетки. Кроме того, бактерия по настоящему изобретению также может являться бактерией, получаемой из бактерии, которая не может продуцировать гетерологичный белок посредством секреторной продукции, даже если она содержит генетическую конструкцию для секреторной экспрессии гетерологичного белка до ее модификации таким образом, что снижают активность пенициллинсвязывающего белка и/или активность белка поверхностного слоя клетки, которая становится способной продуцировать гетерологичный белок посредством секреторной продукции в результате такой модификации, когда снижают активность пенициллинсвязывающего белка и/или активность белка поверхностного слоя клетки. Кроме того, бактерию по настоящему изобретению можно дополнительно модифицировать таким образом, что повышают экспрессию гена, кодирующего металлопептидазу, или гена, кодирующего белок, имеющий область, гомологичную мотиву металлопептидазы.

Далее описывают пенициллинсвязывающие белки и кодирующие их гены.

В основном, пенициллинсвязывающие белки (PBP) относятся к белкам, связывающимся с β-лактамными антибиотиками, ферментативная функция которых ингибируется при связывании с β-лактамными антибиотиками. Пенициллинсвязывающие белки включают высокомолекулярные PBP (HMW-PBP) и низкомолекулярные PBP (LMW-PBP). Высокомолекулярные PBP включают высокомолекулярные PBP класса A (HMW-PBP класса A) и высокомолекулярные PBP класса B (HMW-PBP класса B). HMW-PBP класса A содержат и транспептидазный домен, обладающий транспептидазной активностью для сшивания остатков пептидогликанов, и трансгликозилазный домен, обладающий трансгликозилазной активностью для образования полисахаридной цепи из дисахаридов. HMW-PBP класса B содержат транспептидазный домен. Например, что касается C. glutamicum, PBP1a и PBP1b можно обозначать как HMW-PBP класса A. Что касается C. glutamicum, FtsI, PBP2a и PBP2b можно обозначать как HMW-PBP класса B.

В настоящем изобретении снижают активность белка, являющегося пенициллинсвязывающим белком и обладающим таким свойством, что, если его активность снижают в коринеформной бактерии, количество гетерологичного белка, подлежащего продукции посредством секреторной продукции, повышается по сравнению с наблюдаемым для немодифицированного штамма. В связи с этим, пенициллинсвязывающий белок, например, один, выбранный из PBP1a, HMW-PBP класса B и LMW-PBP, является предпочтительным, один, выбранный из PBP1a и HMW-PBP класса B, является более предпочтительным, и PBP1a является особенно предпочтительным.

"Такое свойство, что, если снижают активность белка в коринеформной бактерии, количество гетерологичного белка, подлежащего продукции посредством секреторной продукции, повышается по сравнению с наблюдаемым для немодифицированного штамма" относится к такому свойству, что, если снижают активность белка в коринеформной бактерии, коринеформной бактерии придают способность продуцировать гетерологичный белок посредством секреторной продукции в количестве, большем, чем наблюдаемое для немодифицированного штамма, такого как штамм дикого типа или родительский штамм. Хотя степень повышения количества гетерологичного белка, подлежащего продукции посредством секреторной продукции, в частности, не ограничена при условии, что количество гетерологичного белка, продуцируемого посредством секреторной продукции, повышается по сравнению с наблюдаемым для немодифицированного штамма, продукция гетерологичного белка посредством секреторной продукции в количестве, большем, чем наблюдаемое для немодифицированного штамма, может означать, например, продукцию гетерологичного белка посредством секреторной продукции в количестве, большем, чем наблюдаемое для немодифицированного штамма предпочтительно на 10% или более, более предпочтительно - на 20% или более, в частности, предпочтительно - на 30% или более, еще более предпочтительно - на 100% или более в терминах накопленного количества в среде и/или поверхностном слое клетки. Кроме того, продукция гетерологичного белка посредством секреторной продукции в количестве, большем, чем наблюдаемое для немодифицированного штамма, может означать, что, в то время как гетерологичный белок нельзя определять, когда неконцентрированный супернатант культуры немодифицированного штамма подвергают электрофорезу в ПААГ в присутствии SDS и окрашивают с использованием CBB, гетерологичный белок можно определять, когда неконцентрированный супернатант культуры модифицированного штамма подвергают электрофорезу в ПААГ в присутствии SDS и окрашивают с использованием CBB.

Также, "такое свойство, что, если активность белка в коринеформной бактерии снижена, количество гетерологичного белка, подлежащего продукции посредством секреторной продукции, повышается по сравнению с наблюдаемым для немодифицированного штамма" в отношении пенициллинсвязывающего белка включает такое свойство, что, если активность белка снижают в штамме, в котором активность белка поверхностного слоя клетки не снижена, способность штамма продуцировать гетерологичный белок посредством секреторной продукции не повышается, однако если активность белка снижают в штамме, в котором снижена активность белка поверхностного слоя клетки, способность штамма продуцировать гетерологичный белок посредством секреторной продукции повышается.

Наличие у белка такого свойства, что, если активность белка в коринеформной бактерии снижена, количество гетерологичного белка, подлежащего продукции посредством секреторной продукции, повышается по сравнению с наблюдаемым для немодифицированного штамма, можно подтверждать посредством получения штамма из штамма, принадлежащего коринеформным бактериям, посредством такой модификации, которая снижает активность белка, подсчета количества гетерологичного белка, продуцируемого посредством секреторной продукции, наблюдаемого при культивировании штамма в среде, и сравнения этого количества с количеством гетерологичного белка, продуцируемого посредством секреторной продукции, если немодифицированный штамм культивируют в среде.

Ген Cgl0278, кодирующий белок PBP1a C. glutamicum ATCC 13032, соответствует последовательности, комплементарной последовательности положений с 294001 по 296388 в геномной последовательности, зарегистрированной в базе данных NCBI как учетный номер GenBank BA000036 (версия BA000036.3 GI: 42602314). Также, белок PBP1a C. glutamicum ATCC 13032 зарегистрирован как учетный номер GenBank NP_599531 (версия NP_599531,1 GI: 19551529, locus_tag="NCgl0274"). Нуклеотидная последовательность гена Cgl0278 C. glutamicum ATCC 13032 и аминокислотная последовательность белка PBP1a, кодируемого этим геном, представлены как SEQ ID NO: 81 и 82, соответственно.

Т.к. нуклеотидная последовательность гена, кодирующего пенициллинсвязывающий белок, может отличаться в зависимости от вида или штамма, к которому принадлежит коринеформная бактерия, ген, кодирующий пенициллинсвязывающий белок, может являться вариантом указанной выше нуклеотидной последовательности при условии, что ген кодирует белок, обладающий таким свойством, что, если в коринеформной бактерии снижена активность белка, количество гетерологичного белка, подлежащего продукции посредством секреторной продукции, повышается по сравнению с наблюдаемым для немодифицированного штамма. Кроме того, вариант гена Cgl0278 включает гомолог гена. Гомологи гена Cgl0278 легко можно получать из публичных баз данных с помощью поиска BLAST или поиска FASTA с использованием гена Cgl0278 дикого типа указанной выше C. glutamicum в качестве поисковой последовательности, а также их можно получать с помощью ПЦР с использованием хромосомы коринеформной бактерии в качестве матрицы и олигонуклеотидов, полученных на основе известной последовательности ген, такой как указано выше, в качестве праймеров.

Ген, кодирующий пенициллинсвязывающий белок, может являться геном, кодирующим белок, имеющий указанную выше аминокислотную последовательность, включающую замену, делецию, инсерцию или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или нескольких положениях при условии, что ген кодирует белок, обладающий таким свойством, что, если активность белка в коринеформной бактерии снижена, количество гетерологичного белка, подлежащего продукции посредством секреторной продукции, повышается по сравнению с наблюдаемым для немодифицированного штамма. В таком случае, как правило, 70% или более, предпочтительно - 80% или более, более предпочтительно - 90% или более такого свойства, что, если активность белка в коринеформной бактерии снижена, количество гетерологичного белка, подлежащего продукции посредством секреторной продукции, повышается по сравнению с наблюдаемым для немодифицированного штамма, сохраняется благодаря тому, что белок не подвергают замене, делеции, инсерции или добавлению одного или нескольких аминокислотных остатков. Хотя количество "одного или нескольких" аминокислотных остатков может отличаться в зависимости от положения в трехмерной структуре или типов аминокислотных остатков в белке, в частности, оно составляет, предпочтительно, от 1 до 20, более предпочтительно - от 1 до 10, еще более предпочтительно - от 1 до 5.

Указанные выше замена, делеция, инсерция или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков являются консервативными мутациями, поддерживающими нормальное функционирование белка. Типичными примерами консервативной мутации являются консервативные замены. Консервативная замена является мутацией, где замена происходит взаимно между Phe, Trp и Tyr, если участком замены является ароматическая аминокислота; среди Leu, Ile и Val, если им является гидрофобная аминокислота; между Gln и Asn, если им является полярная аминокислота; среди Lys, Arg и His, если им является основная аминокислота; между Asp и Glu, если им является кислая аминокислота; и между Ser и Thr, если им является аминокислота, содержащая гидроксильную группу. Примеры замен, рассматриваемых в качестве консервативных замен, включают, в частности, замену Ser или Thr на Ala, замену Gln, His или Lys на Arg, замену Glu, Gln, Lys, His или Asp на Asn, замену Asn, Glu или Gln на Asp, замену Ser или Ala на Cys, замену Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg на Gln, замену Gly, Asn, Gln, Lys или Asp на Glu, замену Pro на Gly, замену Asn, Lys, Gln, Arg или Tyr на His, замену Leu, Met, Val или Phe на Ile, замену Ile, Met, Val или Phe на Leu, замену Asn, Glu, Gln, His или Arg на Lys, замену Ile, Leu, Val или Phe на Met, замену Trp, Tyr, Met, Ile или Leu на Phe, замену Thr или Ala на Ser, замену Ser или Ala на Thr, замену Phe или Tyr на Trp, замену His, Phe или Trp на Tyr и замену Met, Ile или Leu на Val. Кроме того, такая замена, делеция, инсерция, добавление, инверсия или т.п. аминокислотных остатков, как указано выше, включает природную мутацию в результате индивидуальных отличий или отличий видов бактерий, из которых получают ген (мутант или вариант).

Кроме того, ген, содержащий такую консервативную мутацию, как указано выше, может являться геном, кодирующим белок, демонстрирующий гомологию 80% или более, предпочтительно - 90% или более, более предпочтительно - 95% или более, еще более предпочтительно - 97% или более, особенно предпочтительно 99% или более, с общей кодируемой аминокислотной последовательностью и обладающий таким свойством, что, если активность белка в коринеформной бактерии снижена, количество гетерологичного белка, подлежащего продукции посредством секреторной продукции, повышается по сравнению с наблюдаемым для немодифицированного штамма. Кроме того, в настоящем описании "гомология" может означать "идентичность".

Кроме того, ген, кодирующий пенициллинсвязывающий белок, может являться ДНК, способной гибридизоваться с зондом, который можно получать из известной последо