Лечение заболеваний, связанных с альфа-субъединицей потенциалзависимого натриевого канала (scna), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена scna

Лечение заболеваний, связанных с альфа-субъединицей потенциалзависимого натриевого канала (scna), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена scna

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Данная заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США № 61/357774, поданной 23 июня 2010 года, полное содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки.

[0002] Варианты реализации изобретения включают олигонуклеотиды, модулирующие экспрессию и/или функцию гена альфа-субъединицы потенциалзависимого натриевого канала (SCNA) и связанных с ним молекул.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Гибридизация ДНК-РНК и РНК-РНК важна для многих аспектов функционирования нуклеиновых кислот, включая репликацию ДНК, транскрипцию и трансляцию. Процесс гибридизации также является основным во множестве технологий, которые позволяют либо обнаруживать конкретную нуклеиновую кислоту, либо изменять ее экспрессию. Антисмысловые нуклеотиды, например, нарушают экспрессию генов за счет гибридизации с РНК-мишенью, таким образом препятствуя сплайсингу РНК, транскрипции, трансляции и репликации. Антисмысловая ДНК обладает дополнительной особенностью, заключающейся в том, что гибриды ДНК-РНК выступают в качестве субстрата для ферментативного расщепления рибонуклеазой Н, активность которой присутствует в большинстве типов клеток. Антисмысловые молекулы могут быть доставлены в клетки, как в случае для олигодезоксинуклеотидов (ОДН), или они могут представлять собой продукты экспрессии эндогенных генов в виде молекул РНК. Недавно Федеральное агентство по контролю за лекарственными средствами США (FDA) одобрило антисмысловое лекарственное средство, Витравен (VITRAVENE^TM) (для лечения цитомегаловирусного ретинита), что отражает возможность применения антисмысловых соединений для терапевтических целей.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Настоящее Краткое описание предлагает краткое описание настоящего изобретения, предназначенное для того, чтобы в сжатой форме обозначить предмет и сущность изобретения. Краткое описание представляют с пониманием того, что его не следует применять для толкования или ограничения объема или смыслового содержания формулы изобретения.

[0005] В одном варианте реализации согласно изобретению предложены способы для ингибирования действия природного антисмыслового транскрипта путем применения антисмыслового олигонуклеотида (олигонуклеотидов), нацеленного на любую область природного антисмыслового транскрипта, приводящего к увеличению экспрессии соответствующего смыслового гена. Согласно настоящему изобретению также предполагается, что ингибирование природного антисмыслового транскрипта может быть достигнуто с помощью малых интерферирующих РНК (ммРНК), рибозимов и малых молекул, рассматриваемых в рамках настоящего изобретения.

[0006] Согласно одному варианту реализации предложен способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида SCNA в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий осуществление контакта указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом длиной от 5 до 30 нуклеотидов, при этом указанный олигонуклеотид имеет по меньшей мере 50 % идентичность последовательности с последовательностью, которая представляет собой обратный комплемент полинуклеотида, содержащего от 5 до 30 последовательных нуклеотидов в пределах нуклеотидов 1-1123, последовательности SEQ ID NO: 12, и 1-2352, последовательности SEQ ID NO:13, 1-267, последовательности SEQ ID NO: 14, 1-1080, последовательности SEQ ID NO: 15, 1-173, последовательности SEQ ID NO: 16, 1-618, последовательности SEQ ID NO: 17, 1-871, последовательности SEQ ID NO: 18, 1-304, последовательности SEQ ID NO: 19, 1-293, последовательности SEQ ID NO: 20, 1-892, последовательности SEQ ID NO: 21, 1-260, последовательности SEQ ID NO: 22, 1-982, последовательности SEQ ID NO: 23, 1-906, последовательности SEQ ID NO: 24, 1-476, последовательности SEQ ID NO: 25, 1-285, последовательности SEQ ID NO: 26, 1-162, последовательности SEQ ID NO: 27, и 1-94, последовательности SEQ ID NO: 28, что приводит к модулированию функции и/или экспрессии полинуклеотида SCNA в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

[0007] В одном варианте реализации олигонуклеотид нацелен на природную антисмысловую последовательность для полинуклеотидов SCNA, например, на нуклеотиды, указанные в последовательностях, соответствующих SEQ ID NOS: 12-28, и любые их варианты, аллели, гомологи, мутанты, производные, фрагменты и последовательности, которые представляют собой их комплемент. Примеры антисмысловых олигонуклеотидов указаны в виде последовательностей, соответствующих SEQ ID NOS: 29-94.

[0008] Согласно другому варианту реализации предложен способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида SCNA в клетках или тканях пациента т vivo или in vitro, включающий осуществление контакта указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом длиной от 5 до 30 нуклеотидов, при этом указанный олигонуклеотид имеет по меньшей мере 50% идентичность последовательности с последовательностью, которая представляет собой обратный комплемент антисмысловой последовательности для полинуклеотида SCNA; что приводит к модулированию функции и/или экспрессии полинуклеотида SCNA в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

[0009] Согласно другому варианту реализации предложен способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида SCNA в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий осуществление контакта указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом длиной от 5 до 30 нуклеотидов, при этом указанный олигонуклеотид имеет по меньшей мере 50% идентичность последовательности с антисмысловым олигонуклеотидом для антисмыслового полинуклеотида гена SCNA; что приводит к модулированию функции и/или экспрессии полинуклеотида SCNA в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

[0010] В одном варианте реализации композиция содержит один или более антисмысловых олигонуклеотидов, которые связываются со смысловыми и/или антисмысловыми полинуклеотидами гена SCNA, при этом указанные полинуклеотиды выбраны из группы, состоящей из SCNA-SCN12A и их вариантов. В предпочтительном варианте реализации полинуклеотид-мишень выбран из SCNA.

[0011] В одном варианте реализации указанные олигонуклеотиды содержат один или более модифицированных или замещенных нуклеотидов.

[0012] В другом предпочтительном варианте реализации указанные олигонуклеотиды содержат одну или более модифицированных связей.

[0013] В еще одном варианте реализации указанные модифицированные нуклеотиды содержат модифицированные основания, включая молекулы фосфотиоатных, метилфосфонатных производных нуклеиновых кислот, пептидо-нуклеиновых кислот, 2'-О-метил-, фтор- или углерод-, метилен- или других закрытых нуклеиновых кислот (ЗНК; locked nucleic acids, LNA). Предпочтительно, указанные модифицированные нуклеотиды представляют собой молекулы закрытых нуклеиновых кислот, включая ЗНК с α-L-рибо-конфигурацией (α-L-ЗНК).

[0014] В другом предпочтительном варианте реализации указанные олигонуклеотиды вводят пациенту подкожно, внутримышечно, внутривенно или внутрибрюшинно.

[0015] В другом предпочтительном варианте реализации указанные олигонуклеотиды вводят в составе фармацевтической композиции. Схема лечения включает по меньшей мере однократное введение указанных антисмысловых соединений пациенту; однако, это лечение может быть модифицировано до введения многократных доз в течение некоторого периода времени. Указанное лечение может быть объединено с одним или более другими типами терапии.

[0016] В другом предпочтительном варианте реализации указанные олигонуклеотиды инкапсулируют в липосому или присоединяют к молекуле-носителю (например, холестерину, ТАТ-пептиду).

[0017] Другие аспекты описаны ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0018] Фигура 1 представляет собой графическое изображение результатов полимеразной цепной реакции (ПНР) в режиме реального времени, иллюстрирующее кратность изменения ± стандартное отклонение числа копий мРНК гена SCN1A после обработки клеток HepG2 фосфотиоатными олигонуклеотидами, вводимыми с применением агента для трансфекции Липофектамин 2000 (Lipofectamine 2000), по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в режиме реального времени свидетельствуют о том, что уровни мРНК гена SCN1A в клетках HepG2 достоверно повышаются через 48 ч после обработки одним из антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленным на антисмысловую последовательность BG724147 для гена SCN1A. Столбцы диаграммы, обозначенные как CUR-1624 - CUR-1627, соответствуют образцам, обработанным олигонуклеотидами SEQ ID NOS: 30-33, соответственно.

[0019] Фигура 2 представляет собой графическое изображение результатов ПЦР в режиме реального времени, иллюстрирующее кратность изменения ± стандартное отклонение числа копий мРНК гена SCN1A после обработки клеток HepG2 фосфотиоатными олигонуклеотидами, вводимыми с применением Липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Столбцы диаграммы, обозначенные как CUR-1628 - CUR-1631, соответствуют образцам, обработанным олигонуклеотидами SEQ ID NOS: 34-37, соответственно.

[0020] Фигура 3 представляет собой графическое изображение результатов ПЦР в режиме реального времени, иллюстрирующее кратность изменения ± стандартное отклонение числа копий мРНК гена SCN1A после обработки клеток HepG2 фосфотиоатными олигонуклеотидами, вводимыми с применением Липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Столбцы диаграммы, обозначенные как CUR-1632 - CUR-1636, соответствуют образцам, обработанным олигонуклеотидами, соответствующими SEQ ID NOS: 38-42, соответственно.

[0021] Фигура 4 иллюстрирует дозозависимое увеличение экспрессии мРНК гена SCN1A в первичных фибробластах кожи человека, несущих мутацию, ассоциированную с синдромом Драве. Обозначения CUR-1916, CUR-1740, CUR-1764 и CUR-1770 соответствуют образцам, обработанным олигонуклеотидами, соответствующими SEQ ID NOS: 70, 45, 52 и 57, соответственно.

[0022] Фигура 5 иллюстрирует дозозависимое увеличение экспрессии мРНК гена SCN1A в клетках SK-N-AS. Обозначения CUR-1916, CUR-1740, CUR-1764 и CUR-1770 соответствуют образцам, обработанным олигонуклеотидами, соответствующими SEQ ID NOS: 70, 45, 52 и 57, соответственно.

[0023] Фигура 6 иллюстрирует дозозависимое увеличение экспрессии мРНК гена SCN1A в клетках Vero 76. Обозначения CUR-1916, CUR-1740, CUR-1764 и CUR-1770 соответствуют образцам, обработанным олигонуклеотидами, соответствующими SEQ ID NOS: 70, 45, 52 и 57, соответственно.

[0024] Фигура 7 иллюстрирует, что увеличение экспрессии мРНК гена SCN1A не вызвано неспецифической токсичностью антисмысловых олигонуклеотидов. А - увеличение экспрессии при обработке олигонуклеотидом CUR-1916; В - увеличение экспрессии при обработке олигонуклеотидом CUR-1770. Олигонуклеотид CUR-1462 представляет собой неактивный контрольный олигонуклеотид, характеризующийся сходной химической структурой.

[0025] Фигура 8 иллюстрирует, что обработка антисмысловыми олигонуклеотидами, нацеленными на природный антисмысловой транскрипт гена SCN1A, не оказывает существенного влияния на экспрессию каналов SCN8A и SCN9A в фибробластах человека, несущих мутацию, ассоциированную с синдромом Драве. А - обработка олигонуклеотидом CUR-1770; В - обработка олигонуклеотидом CUR-1916.

[0026] Фигура 9 иллюстрирует стабильность антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на SCN1A-специфичный природный антисмысловой транскрипт. Клетки Vero 76 обрабатывали в соответствии с описанием, приведенным в Примере 2, двумя разными партиями олигонуклеотида CUR-1916, синтезированного в августе 2010 года и марте 2011 года. Олигонуклеотид, синтезированный в августе 2010 года, хранили в виде водного раствора с концентрацией 1 мМ при температуре 4°С. Олигонуклеотид, синтезированный в марте 2011 года, был отправлен в лиофилизированной форме и проверен сразу после доставки.

[0027] Фигура 10 иллюстрирует увеличение экспрессии белка SCN1A в фибробластах, несущих мутацию, ассоциированную с синдромом Драве, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами, комплементарными природной антисмысловой последовательности для гена SCN1A. Фибробласты выращивали в 24-луночных планшетах и обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами, комплементарными природной антисмысловой последовательности для гена SCN1A, в концентрации 20 нМ (панель с: CUR-1740; d: CUR-1770; e: CUR-1916) и 0 нМ (b). Клетки окрашивали на белок SCN1A (b-е) посредством непрямого иммуногистохимического метода с применением антител к белку SCN1A (Abeam cat#ab24820) и окрашивания/усиления сигнала вторичными антителами, основанного на взаимодействии авидин/биотин (Vector Laboratories cat#SP-2001; Vector Laboratories cat#PK-6101; Vector Laboratories cat#SK-4105); панель а - отрицательный контроль, кроличьи антимышиные антитела применяли в качестве первичных антител с той же последующей процедурой окрашивания, как и на панелях b-е.

[0028] Фигура 11 иллюстрирует увеличение экспрессии белка SCN1A в клетках SK-N-AS, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами, комплементарными природной антисмысловой последовательности для гена SCN1A. Клетки SK-N-AS выращивали в 24-луночных планшетах и обрабатывали олигонуклеотидами в концентрации 20 нМ (с: CUR-1740; d: CUR-1764; e: CUR-1770; f: CUR-1916) и (b: 0 нМ). Клетки SK-N-AS окрашивали на белок SCN1A (b-f) посредством непрямого иммуногистохимического метода с применением антител к белку SCN1A (Abeam cat#ab24820) и окрашивания/усиления сигнала вторичными антителами, основанного на взаимодействии авидин/биотин (Vector Laboratories cat#SP-2001; Vector Laboratories cat#PK-6101; Vector Laboratories cat#SK-4105); в качестве отрицательного контроля применяли кроличьи антимышиные антитела в качестве первичных антител с той же последующей процедурой окрашивания, как и на панелях b-f (панель а).

[0029] Фигура 12 иллюстрирует увеличение экспрессии белка SCN1A в клетках Vero 76, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами, комплементарными природной антисмысловой последовательности для гена SCN1A. Клетки Vero 76 выращивали в 24-луночных планшетах и обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами, комплементарными природной антисмысловой последовательности для гена SCN1A, в концентрации 20 нМ (с: CUR-1740; d: CUR-1945; e: CUR-1770; f: CUR-1916; g: CUR-1924) и 0 нМ (b). Клетки Vero 76 окрашивали на белок SCN1A (b-g) посредством непрямого иммуногистохимического метода с применением антител к белку SCN1A (Abeam cat#ab24820) и окрашивания/усиления сигнала вторичными антителами, основанного на взаимодействии авидин/биотин (Vector Laboratories cat#SP-2001; Vector Laboratories cat# РК-6101; Vector Laboratories cat#SK-4105); панель а - в качестве отрицательного контроля применяли кроличьи антимышиные антитела в качестве первичных антител с той же последующей процедурой окрашивания, как и на панелях b-g.

[0030] Фигура 13 иллюстрирует, что олигонуклеотиды, нацеленные на SCN1A-специфичный природный антисмысловой транскрипт, увеличивающие экспрессию мРНК гена SCN1A, не увеличивают экспрессию гена актина в клетках Vero 76. Те же самые антисмысловые олигонуклеотиды (CUR-1740, CUR-1838, CUR-1924), нацеленные на SCN1A-специфичный природный антисмысловой транскрипт, которые, как было показано в Примерах 5 и 12, увеличивают экспрессию мРНК и белка SCN1A, исследовали на их влияние на экспрессию мРНК гена бета-актина в клетках Vero 76. Данные эксперимента подтверждают, что олигонуклеотиды, нацеленные на SCN1A-специфичный природный антисмысловой транскрипт, не увеличивают экспрессию неродственного гена, такого как ген актина. Столбцы диаграммы, обозначенные как CUR-1740, CUR-1838 и CUR-1924, соответствуют образцам, обработанным олигонуклеотидами, соответствующими SEQ ID NOS: 45, 62 и 78, соответственно.

[0031] Фигура 14 иллюстрирует, что олигонуклеотиды, нацеленные на SCN1A-специфичный природный антисмысловой транскрипт, которые, как было показано, увеличивают экспрессию мРНК и белка SCN1A, не увеличивают экспрессию гена актина в фибробластах, несущих мутацию, ассоциированную с синдромом Драве. Олигонуклеотиды (CUR-1916, CUR-1945), нацеленные на SCN1A-специфичный природный антисмысловой транскрипт, которые, как было показано в Примерах 2 и 7, увеличивают экспрессию мРНК и белка SCN1A, исследовали на их влияние на экспрессию мРНК гена актина в фибробластах, несущих мутацию, ассоциированную с синдромом Драве. Приведенные ниже данные подтверждают, что олигонуклеотиды, нацеленные на SCN1A-специфичный природный антисмысловой транскрипт, не увеличивают экспрессию неродственного гена, такого как ген актина. Столбцы диаграммы, обозначенные как CUR-1916 и CUR-1945, соответствуют образцам, обработанным олигонуклеотидами, соответствующими SEQ ID NOS: 70 и 93, соответственно.

[0032] Фигура 15 иллюстрирует, что олигонуклеотиды, нацеленные на SCN1A-специфичный природный антисмысловой транскрипт, которые, как было показано, увеличивают экспрессию мРНК и белка SCN1A, не увеличивают экспрессию гена актина в клетках SK-N-AS. Те же самые антисмысловые олигонуклеотиды (CUR-1740, CUR-1770, CUR-1916, CUR-1764, CUR-1838), которые, как было показано в Примерах, увеличивают экспрессию мРНК и белка SCN1A, исследовали на их влияние на экспрессию мРНК гена актина в клетках SK-N-AS. Данные эксперимента подтверждают, что олигонуклеотиды, нацеленные на SCN1A-специфичный природный антисмысловой транскрипт, не увеличивают экспрессию неродственного гена, такого как ген актина. Столбцы диаграммы, обозначенные как CUR-1740, CUR-1770, CUR-1916, CUR-1764, CUR-1838, соответствуют образцам, обработанным олигонуклеотидами, соответствующими SEQ ID NOS: 45, 57, 70, 52 и 62, соответственно.

[0033] Фигура 16 иллюстрирует окрашивание белка актина в клетках SK-N-AS, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами, комплементарными природной антисмысловой последовательности для гена SCN1A. Клетки SK-N-AS выращивали в 24-луночных планшетах и обрабатывали олигонуклеотидами в концентрации 20 нМ (b: CUR-1740; с: CUR-1764; d: CUR-1770; e: CUR-1916) и 0 нМ (а). Клетки SK-N-AS окрашивали на актин (a-е) посредством непрямого иммуногистохимического метода с применением антител к актину (Abeam cat#ab1801) и окрашивания/усиления сигнала вторичными антителами, основанного на взаимодействии авидин/биотин (Vector Laboratories cat#SP-2001; Vector Laboratories cat#PK-6101; Vector Laboratories cat#SK-4105).

[0034] Фигура 17 иллюстрирует окрашивание белка актина в клетках Vero 76, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами, комплементарными природной антисмысловой последовательности для гена SCN1A. Клетки Vero 76 выращивали в 24-луночных планшетах и обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами, комплементарными природной антисмысловой последовательности для гена SCN1A, в концентрации 20 нМ (b: CUR-1740; с: CUR-1770; d: CUR-1916; e: CUR-1924; f: CUR-1945) и 0 нМ (а). Клетки Vero 76 окрашивали на актин (b-f) посредством непрямого иммуногистохимического метода с применением антител к актину (Abeam cat#abl801) и окрашивания/усиления сигнала вторичными антителами, основанного на взаимодействии авидин/биотин (Vector Laboratories cat#SP-2001; Vector Laboratories cat# PK-6101; Vector Laboratories cat#SK-4105); панель а - отрицательный контроль, кроличьи антимышиные антитела применяли в качестве первичных антител с той же последующей процедурой окрашивания, как и на панелях b-g.

[0035] Фигура 18 иллюстрирует увеличение экспрессии белка актина в фибробластах, несущих мутацию, ассоциированную с синдромом Драве, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами, комплементарными природной антисмысловой последовательности для гена SCN1A. Фибробласты выращивали в 24-луночных планшетах и обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами, комплементарными природной антисмысловой последовательности для гена SCN1A, в концентрации 20 нМ (панель b: CUR-1740; с: CUR-1764; d: CUR-1770; e: CUR-1838 и f: CUR-1916) и 0 нМ (а). Клетки окрашивали на актин (a-f) посредством непрямого иммуногистохимического метода с применением антител к актину (Abeam cat#ab1801) и окрашивания/усиления сигнала вторичными антителами, основанного на взаимодействии авидин/биотин (Vector Laboratories cat#SP-2001; Vector Laboratories cat#PK-6101; Vector Laboratories cat#SK-4105).

[0036] Фигура 19 иллюстрирует увеличение экспрессии белка SCN1A в фибробластах, несущих мутацию, ассоциированную с синдромом Драве, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами, комплементарными природной антисмысловой последовательности для гена SCN1A, количественно определенное с применением иммуноферментного анализа (ИФА; enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA). Фибробласты обрабатывали олигонуклеотидами, комплементарными природной антисмысловой последовательности для гена SCN1A, в концентрациях 0 или 80 нМ. Через 48 ч клетки переносили в 96-луночный планшет на 24 ч перед фиксацией и исследованием с помощью ИФА-систем для определения белка SCN1A и актина. Показания оптической плотности (ОП) для сигнала белка SCN1A нормализовывали к сигналу актина для одних и тех же условий проведения эксперимента. Нормализованный сигнал белка SCN1A в клетках, обработанных олигонуклеотидами в концентрации 0 нМ, применяли в качестве точки отсчета (100%). Столбцы диаграммы, обозначенные как CUR-1740, CUR-1770 и CUR-1916, соответствуют образцам, обработанным олигонуклеотидами, соответствующими SEQ ID NOS: 45, 57 и 70, соответственно.

[0037] Фигура 20 иллюстрирует увеличение экспрессии белка SCN1A в клетках Vero 76, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами, комплементарными природной антисмысловой последовательности для гена SCN1A, количественно определенное с применением ИФА. Клетки Vero 76 обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами, комплементарными природной антисмысловой последовательности для гена SCN1A, в концентрациях 0 или 80 нМ. Через 48 ч клетки переносили в 96-луночный планшет на 24 ч перед фиксацией и исследованием с помощью ИФА-систем для определения белка SCN1A и актина. Показания ОП для сигнала белка SCN1A нормализовывали к сигналу актина для одних и тех же условий проведения эксперимента. Нормализованный сигнал белка SCN1A в клетках, обработанных олигонуклеотидами в концентрации 0 нМ, применяли в качестве точки отсчета (100 %). Столбцы диаграммы, обозначенные как CUR-1740, CUR-1770, CUR-1916, CUR-1924, CUR-1945, соответствуют образцам, обработанным олигонуклеотидами, соответствующими SEQ ID NOS: 45, 57, 70, 78 и 93, соответственно.

[0038] Фигура 21 иллюстрирует увеличение экспрессии белка SCN1A в клетках SK-N-AS, обработанных олигонуклеотидами, комплементарными природной антисмысловой последовательности для гена SCN1A, количественно определенное с применением ИФА. Клетки SK-N-AS обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами, комплементарными природной антисмысловой последовательности для гена SCN1A, в концентрациях 0 или 20 нМ. Через 48 ч клетки переносили в 96-луночный планшет на 24 ч перед фиксацией и исследованием с помощью ИФА-систем для определения белка SCN1A и актина. Показания ОП для сигнала белка SCN1A нормализовывали к сигналу актина для одних и тех же условий проведения эксперимента. Нормализованный сигнал белка SCN1A в клетках, обработанных олигонуклеотидами в концентрации 0 нМ, применяли в качестве точки отсчета (100 %). Столбцы диаграммы, обозначенные как CUR-1740, CUR-1770, CUR-1924, CUR-1945, соответствуют образцам, обработанным олигонуклеотидами, соответствующими SEQ ID NOS: 45, 57, 78 и 93, соответственно.

[0039] На Фигуре 22 показаны продукты после второго раунда ПЦР с быстрой амплификацией 3'-концевого фрагмента кДНК (3'-rapid amplification of cDNA ends, 3'-RACE) природного антисмыслового транскрипта BG724147 гена SCN1A. 3'-RACE была проведена с применением: а) тотальной РНК из клеток HepG2 с добавлением аденозина; b - РНК, содержащей поли(А)-последовательность, выделенной из клеток HepG2; с - с применением тотальной РНК из первичных фибробластов человека, несущих мутацию, ассоциированную с синдромом Драве, с добавлением аденозина; d - с применением РНК, содержащей поли(А)-последовательность, выделенной из первичных фибробластов человека, несущих мутацию, ассоциированную с синдромом Драве. Фигура представляет собой негатив электрофореграммы, полученной в результате проведения электрофореза в 1% агарозном геле/lx буфере ТАЕ (смесь трис/уксусная кислота/ЭДТА) с окрашиванием геля красителем GelRed (GenScript, cat#M00120). Стрелки указывают на зоны, общие для клеток HepG2 и первичных фибробластов человека, несущих мутацию, ассоциированную с синдромом Драве, что свидетельствует о наличии природного антисмыслового транскрипта BG724147 в этих клетках.

[0040] Описание Перечня последовательностей - SEQ ID NO: 1: Альфа-субъединица потенциалзависимого натриевого канала типа I (SCN1A) человека, транскриптный вариант 1, мРНК (номер последовательности в базе данных NCBI (Национального центра биотехнологической информации США): NM_001165963); SEQ ID NO: 2: Альфа-субъединица потенциалзависимого натриевого канала типа II (SCN2A) человека, транскриптный вариант 1, мРНК (номер последовательности в базе данных NCBI: NM_021007); SEQ ID NO: 3: Альфа-субъединица потенциалзависимого натриевого канала типа III (SCN3A) человека, транскриптный вариант 1, мРНК (номер последовательности в базе данных NCBI: NM_006922); SEQ ID NO: 4: Альфа-субъединица потенциалзависимого натриевого канала типа IV (SCN4A) человека, мРНК (номер последовательности в базе данных NCBI: NM_000334); SEQ ID NO: 5: Альфа-субъединица потенциалзависимого натриевого канала типа V (SCN5A) человека, транскриптный вариант 1, мРНК (номер последовательности в базе данных NCBI: NM_198056); SEQ ID NO: 6: Альфа-субъединица потенциалзависимого натриевого канала типа VII (SCN7A) человека, мРНК (номер последовательности в базе данных NCBI: NM_002976); SEQ ID NO: 7: Альфа-субъединица потенциалзависимого натриевого канала типа VIII (SCN8A) человека, транскриптный вариант 1, мРНК (номер последовательности в базе данных NCBI: NM_014191); SEQ ID NO: 8: Альфа-субъединица потенциалзависимого натриевого канала типа IX (SCN9A) человека, мРНК (номер последовательности в базе данных NCBI: NM_002977); SEQ ID NO: 9: Альфа-субъединица потенциалзависимого натриевого канала типа Х (SCN10A) человека, мРНК (номер последовательности в базе данных NCBI: NM_006514); SEQ ID NO: 10: Альфа-субъединица потенциалзависимого натриевого канала типа XI (SCN11A) человека, мРНК (номер последовательности в базе данных NCBI: NM_014139); SEQ ID NO: 11: Альфа-субъединица потенциалзависимого натриевого канала SCN12A (SCN12A) человека, мРНК, полная кодирующая последовательность (номер последовательности в базе данных NCBI: AF109737); SEQ ID NO: 12: Природная антисмысловая последовательность для гена SCN1A (BG724147 расширенная); SEQ ID NO: 13: Природная антисмысловая последовательность для гена SCN1A (Hs.662210); SEQ ID NO: 14: Природная антисмысловая последовательность для гена SCN1A (АА383040); SEQ ID NO: 15: Природная антисмысловая последовательность для гена SCN1A (ВС029452); SEQ ID NO: 16: Природная антисмысловая последовательность для гена SCN1A (АА630035); SEQ ID NO: 17: Природная антисмысловая последовательность для гена SCN1A (ВЕ566126); SEQ ID NO: 18: Природная антисмысловая последовательность для гена SCN1A (BF673100); SEQ ID NO: 19: Природная антисмысловая последовательность для гена SCN1A (BG181807); SEQ ID NO: 20: Природная антисмысловая последовательность для гена SCN1A (BG183871); SEQ ID NO: 21: Природная антисмысловая последовательность для гена SCN1A (BG215777); SEQ ID NO:22: Природная антисмысловая последовательность для гена SCN1A (BG227970); SEQ ID NO: 23: Природная антисмысловая последовательность для гена SCN1A (ВМ905527); SEQ ID NO: 24: Природная антисмысловая последовательность для гена SCN1A (BU180772); SEQ ID NO: 25: Природная антисмысловая последовательность для гена SCN1A мыши (BG724147 ExtMouse); SEQ ID NO: 26: Природная антисмысловая последовательность для гена SCN1A мыши (Hs.662210mouseAS1); SEQ ID NO: 27: Природная антисмысловая последовательность для гена SCN1A мыши (Hs.662210mouseAS2); SEQ ID NO: 28: Природная антисмысловая последовательность для гена SCN1A мыши (Hs.662210mouseAS3); SEQ ID NOS: 29-94: Антисмысловые олигонуклеотиды. SEQ ID NO: 95 и 96 являются последовательностями, представляющими собой обратные комплементы антисмысловых олигонуклеотидов, соответствующих SEQ ID N0:58 и 59, соответственно. Символ "*" обозначает фосфотиоатную связь, "+" обозначает ЗНК, "r" обозначает РНК, а "m" указывает на наличие метильной группы на 2'-атоме кислорода в обозначенном сахарном остатке олигонуклеотида.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0041] Некоторые аспекты изобретения описаны ниже со ссылкой на примеры применения для иллюстрации. Следует понимать, что многочисленные конкретные детали, связи и способы приведены с целью обеспечения полного понимания изобретения. Однако для специалиста в данной области техники будет очевидно, что изобретение может быть применено на практике без одной или более конкретных деталей или с применением других способов. Настоящее изобретение не ограничивается указанным порядком действий или процессов, так как некоторые действия могут быть осуществлены в разных порядках и/или одновременно с другими действиями или процессами. Кроме того, не все представленные в качестве примеров действия или процессы необходимы для реализации методологии в соответствии с настоящим изобретением.

[0042] Все гены, названия генов и продукты генов, описанные в настоящей заявке, соответствуют гомологам из организмов любых видов, для которых применимы композиции и способы, предложенные в настоящей заявке. Таким образом, данные термины включают, но не ограничиваются перечисленными, гены и генные продукты из организмов людей и мышей. Следует понимать, что, когда предложен ген или продукт гена из организма конкретного вида, этот элемент изобретения представлен исключительно в качестве примера, и его не следует истолковывать как ограничение, если контекст, в котором он появляется, ясно не предписывает иное. Соответственно, например, гены, описанные в настоящей заявке, которые в некоторых вариантах реализации относятся к нуклеотидным и аминокислотным последовательностям млекопитающих, охватывают гомологичные и/или ортологичные гены и продукты генов из организмов других животных, включая, но не ограничиваясь перечисленными, других млекопитающих, рыб, земноводных, пресмыкающихся и птиц. В предпочтительных вариантах реализации гены или нуклеотидные последовательности представляют собой гены или последовательности человека.

Определения

[0043] Терминология, применяемая в настоящей заявке, служит исключительно для описания конкретных вариантов реализации и не ограничивает изобретение. В настоящей заявке неопределенная и определенная формы единственного числа также включают множественные формы, если контекст ясно не предписывает иное. Кроме того, в той мере, в какой термины "включающий", "включает", "имеющий", "имеет", "с" или их варианты применяют в подробном описании и/или формуле изобретения, такие термины подразумевают включение в себя подобно термину "содержащий".

[0044] Термин "примерно" или "приблизительно" обозначает нахождение внутри диапазона приемлемой погрешности для конкретной величины, определенного специалистом в данной области техники, который будет зависеть отчасти от того, каким образом величину измеряют или определяют, т.е. от ограничений измерительной системы. Например, термин "примерно" может означать, что величина находится в пределах 1 или более чем 1 стандартного отклонения, как показывает практика в данной области техники. Альтернативно, термин "примерно" может означать диапазон погрешности, составляющий вплоть до 20%, предпочтительно вплоть до 10%, более предпочтительно вплоть до 5% и еще более предпочтительно вплоть до 1% от заданной величины. Альтернативно, применительно к биологическим системам или процессам, термин может означать нахождение в пределах порядка величины, предпочтительно в пределах пятикратного значения и более предпочтительно в пределах двукратного значения величины. В тех случаях, когда в заявке и формуле изобретения приведены конкретные значения, то, если не указано иное, следует считать, что термин "примерно" обозначает нахождение внутри диапазона приемлемой погрешности для конкретной величины.

[0045] В настоящей заявке термин "мРНК" обозначает известный на настоящий момент мРНК-транскрипт(ы) гена-мишени и любые дополнительные транскрипты, происхождение которых может быть объяснено.

[0046] С помощью терминов "антисмысловые олигонуклеотиды" или "антисмысловое соединение" обозначают молекулу РНК или ДНК, которая связывается с другой РНК или ДНК (РНК-, ДНК-мишенью). Например, если антисмысловое соединение представляет собой олигорибонуклеотид, оно связывается с другой РНК-мишенью за счет РНК-РНК-взаимодействий и изменяет активность РНК-мишени. Антисмысловой олигонуклеотид может увеличивать или подавлять экспрессию и/или функцию конкретного полинуклеотида. Определение включает любую чужеродную молекулу ДНК или РНК, подходящую с терапевтической, диагностической или другой точки зрения. Такие молекулы включают, например, молекулы антисмысловых ДНК или РНК, молекулы интерферирующих РНК (РНКи), микроРНК, ложных РНК, ммРНК, ферментативные РНК, РНК, применяемые в исправляющей терапии, и РНК, имеющие свойства агонистов и антагонистов, антисмысловые олигомерные соединения, антисмысловые олигонуклеотиды, олигонуклеотиды внешней направляющей последовательности (external guide sequence, EGS), сплайс-варианты, праймеры, зонды и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются с по меньшей мере частью нуклеиновой кислоты-мишени. В связи с этим данные соединения могут быть введены в форме одноцепочечных, двухцепочечных, частично одноцепочечных или кольцевых олигомерных соединений.

[0047] В контексте настоящего изобретения термин "олигонуклеотид" относится к олигомеру или полимеру рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или их миметикам. Термин "олигонуклеотид" также включает линейные или кольцевые олигомеры природных и/или модифицированных мономеров или связей, включая дезоксирибонуклеозиды, рибонуклеозиды, их замещенные и альфа-аномерные формы, пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК), закрытые нуклеиновые кислоты (ЗНК; locked nucleic acids, LNA), фосфотиоатные, метилфосфонатные производные и т.п. Олигонуклеотиды способны к специфическому связыванию с полинуклеотидом-мишенью за счет регулярных взаимодействий между мономерными звеньями, такими как Уотсон-Криковский тип спаривания оснований, Хугстиновский или обратный Хугстиновский типы спаривания оснований и т.п.

[0048] Олигонуклеотид может быть "химерным", то есть составленным из разных областей. В контексте настоящего изобретения "химерные" соединения представляют собой олигонуклеотиды, которые содержат две или более химически отличные области, например, область (области) ДНК, область (области) РНК, область (области) ПНК и т.д. Каждая химически отличная область состоит из по меньшей мере одной мономерной единицы, т.е. нуклеотида в случае олигонуклеотидного соединения. Эти олигонуклеотиды, как правило, содержат по меньшей мере одну область, в которой олигонуклеотид модифицирован с целью проявления одного или более желаемых свойств. Желаемые свойства олигонуклеотида включают, но не ограничиваются перечисленными, например, повышенную устойчивость к деградации нуклеазами, повышенное клеточное поглощение и/или повышенную способность к связыванию с нуклеиновой кислотой-мишенью. Разные области олигонуклеотида могут, таким образом, обладать разными свойствами. Химерные олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению могут быть образованы в виде смешанных структур из двух или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеозидов и/или аналогов олигонуклеотидов, описанных выше.

[0049] Олигонуклеотид может быть составлен из областей, которые могут быть соединены в "ряд", то есть когда мономеры соединены последовательно, как в нативной ДНК, или соединены посредством спейсеров. Спейсеры формируют ковалентный "мостик" между областями и имеют в предпочтительных случаях длину, не превышающую примерно 100 углеродных атомов. Спейсеры могут иметь разные функциональные характеристики, например, нести положительный или отрицательный заряд, обладать свойствами специфичного связывания нуклеиновых кислот (интеркаляторы, вещества, связывающиеся с бороздками, токсины, флуорофоры и т.д.), быть липофильными, индуцировать образование специфических вторичных структур, как, например, аланинсодержащие пептиды, которые индуцируют образование альфа-спиралей.

[0050] В настоящей заявке термины "ген SCN1A" и "альфа-субъединица потенциалзависимото натриевого канала типа I" включают все члены семейства, мутанты, аллели, фрагменты, виды, кодирующие и некодирующие последовательности, смысловые и антисмысловые полинуклеотидные цепи и т.д. Аналогично, гены SCN2A-SCN12A включают все мутанты, аллели, фрагменты и т.д.

[0051] В настоящем описании слова "альфа-субъединица потенциалзависимого натриевого канала типа I", SCN1A, FEB3, FEB3A, GEFSP2, HBSCI, NaCl, Nav1.1, SCN1, SMEI, альфа-субъединица белка натриевого канала мозга I, альфа-субъединица белка натриевого канала типа 1, альфа-субъединица белка натриевого канала типа I и альфа-субъединица потенциалзависимого натриевого канала Nav1.1 рассматривают как имеющие одно и то же значение в литературе и применяют взаимозаменяемо в настоящей заявке.

[0052] В настоящей заявке термин "олигонуклеотид, специфичный к" или "олигонуклеотид, нацеленный на" относится к олигонуклеотиду, содержащему последовательность, (i) способную образовывать стабильный комплекс с частью гена-мишени или (ii) способную образовывать стабильный дуплекс с частью мРНК-транскрипта гена-мишени. Стабильность комплексов и дуплексов может бы