Экстракт, обогащенный нмп

Экстракт, обогащенный нмп

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к обогащенному N-метилпиридинием (NMP) экстракту депарафинированного тригонеллин-содержащего органического материала со значительно сниженным содержанием С5НТ, способу его получения, использованию указанного обогащенного NMP экстракта депарафинированного тригонеллин-содержащего органического материала в качестве пищевой добавки и к пищевому продукту, содержащему указанный экстракт.

Экстракты тригонеллин-содержащего органического материала, такие как, например, кофейные напитки, представляют собой сложные растворы, содержащие биологически активные соединения, которые взаимодействуют со своим микроокружением в желудке человека. Предполагается, что благодаря такому взаимодействию усиливается секреция кислоты желудочного сока. Поэтому несколько раз сообщалось о желудочном раздражении после употребления кофе. В сложном процессе секреции кислоты желудочного сока, ключевым игроком является желудочная H+,K+-АТФаза. Благодаря активации париетальных клеток гормонами и трансмиттерами она транспортирует водород в полость желудка в обмен на калий и подкисляет желудок. Параллельно, в полость желудка секретируется хлорид. Процесс в целом регулируется благодаря рецепторам клеточной поверхности. Стимуляция секреции кислоты желудочного сока медиируется H2-гистаминовым рецептором, М3-ацетилхолиновым рецептором и холецистокининовым бета-рецептором. Обратная регуляция происходит путем активации рецептора соматостатина. Таким образом, гормоны гистамин, гастрин и соматостатин, а также ацетилхолин, играют критическую роль в регуляции секреции кислоты. Активация рецепторов клеточной поверхности прямо связана с внутриклеточной трансдукцией сигнала. Было показано, что MAPK-киназы и рецепторные тирозинкиназы принимают участие в регуляции секреции кислоты желудочного сока. До этого момента, активация рецептора фактора роста эпителия (EGFr) связана с повышенным секреторным статусом париетальных клеток. Последующая передача сигналов активирует Akt1 и ERK1/2 MAPK-киназы. Передача сигналов Akt1 активирует транскрипцию H+,K+-АТФазы, а также усиливает секреторную активность париетальных клеток. ERK1/2 проявляет острый ингибирующий эффект на секреторную активность, но предполагается, что его хроническая стимуляция является просекреторной. Однако, считается, что ERK1/2 также активирует экспрессию гена H+,K+-АТФазы. Помимо этих сигнальных путей, после активации связанного с GS-белком Н2-гистаминового рецептора образуется циклический АМФ. Циклический АМФ может активировать протеинкиназу А, которая в свою очередь может активировать фактор транскрипции в ядре. Фактор транскрипции ATF-2 может принимать участие в экспрессии H+,K+-АТФазы и рецептора соматостатина 2, поскольку оба гена содержат циклический АМФ-чувствительный элемент.

До обжаривания, необработанные кофейные зерна содержат от примерно 1000 до 1400 мкг/г N-алканоил-5-гидрокситриптамида (С5НТ), а жареные кофейные зерна содержат от примерно 500 до 800 мкг/г С5НТ. Кроме того, жареные кофейные зерна, подвергнутые декофеинизации, содержат примерно 50 мкг/л С5НТ. Дополнительно, кофе с кофеином содержит от примерно 200 до 500 мкг/л С5НТ, тогда как декофеинированный кофе содержит примерно 50 мкг/л С5НТ.

Соответственно, часто сообщалось, что употребление кофе ассоциировано с изжогой или раздражением желудка, которые оба могут быть индуцированы повышенной секрецией желудочной кислоты. Эффект кофейных напитков на желудочное раздражение и внутрижелудочный pH у людей впервые был исследован Ehrlich et al. (Ehrlich A, Basse H, Henkel-Ernst J, Hey B, Menthe J and Lücker PW. Effect of differently processed coffee on gastric activity difference and intraastric pH in healthy volunteers. ethods Find Exp Clin Pharmacol 20: 155-161, 2006). После приема перорально 150 мл кофейного напитка, приготовленного из обычного или обработанного паром кофе, последний индуцировал значительно меньшее раздражение слизистой у здоровых добровольцев, чем обычный кофейный напиток. На основании этих результатов было выдвинуто предположение, что продувка кофе паром значительно снижает содержание раздражающих желудок соединений в жареных кофейных зернах, и производители кофе начали маркировать продутый паром кофе как "безвредный для желудка" ('stomach-friendly). Эта технология была первоначально разработана для удаления кофеина и хлорогеновых кислот как основных соединений, позволяющих улучшить сенсорные характеристики кофейных напитков.

Таким образом, технической проблемой, лежащей в основе настоящего изобретения, является обеспечение продукта или других средств предотвращения или уменьшения желудочных проблем, вызванных секрецией кислоты желудочного сока, который может быть использован, например, в качестве пищевой добавки.

Решение вышеуказанной технической проблемы достигается с помощью вариантов осуществления, охарактеризованных в формуле изобретения.

В частности, настоящее изобретение относится к способу получения обогащенного N-метилпиридинием (NMP) экстракта из тригонеллин-содержащего органического материала, сключающему стадии:

(a) депарафинирования тригонеллин-содержащего органического материала;

(b) обжаривания тригонеллин-содержащего органического материала;

(c) обработки обжареного тригонеллин-содержащего органического материала горячей водой для получения водного экстракта; и

(d) прибавления NMP к водному экстракту.

Депарафинирование тригонеллин-содержащего органического материала, обжаривание тригонеллин-содержащего органического материала, а также экстракция горячей водой могут быть осуществлены способами, хорошо известными специалистам.

Например, депарафинирование на Стадии (а) может быть осуществлено способами, описанными van der Stegen, 1979 (van der Stegen, The effect of dewaxing of green coffee on the coffee brew, Fd. Chem (4) 23-29, 1979).

В тех случаях, когда тригонеллин-содержащий органический материал содержит кофеин, способ по настоящему изобретению может необязательно дополнительно включать стадию декофеинирования тригонеллин-содержащего органического материала до и/или после стадии (а), например, путем обработки тригонеллин-содержащего органического материала этилацетатом. Эта стадия может быть осуществлена способами, хорошо известными специалистам.

В предпочтительном варианте осуществления, степень обжаривания тригонеллин-содержащего органического материала после обжаривания на Стадии (b) составляет по меньшей мере 50, более предпочтительно, по меньшей мере 80, более предпочтительно, по меньшей мере 100 делений шкалы. В другом предпочтительном варианте осуществления, степень обжаривания тригонеллин-содержащего органического материала после обжаривания на Стадии (b) составляет от 40 до 110 делений шкалы, более предпочтительно, от 60 до 90 делений шкалы и еще более предпочтительно, от 70 до 90 делений шкалы, и наиболее предпочтительно, от 70 до 80 делений шкалы. Что касается окраски, то степень обжаривания менее 50 делений шкалы считается темной, степень обжаривания примерно 75 делений шкалы считается средней, и степень обжаривания, равная по меньшей мере 90 делений шкалы, считается светлой. Степень обжаривания может быть легко определена квалифицированным специалистом в данной области техники, например, с помощью прибора для определения окраски Dr. Lange - LFM 1, прибора для определения окраски Dr. Lange - LK 100 или прибора для определения окраски RSM 2, производимого фирмой Schaltex GmbH, согласно соответствующим протоколам, предоставляемым производителями указанного устройства.

После обжаривания на Стадии (b) вышеуказанного способа, тригонеллин-содержащий органический материал, предпочтительно, имеет содержание С5НТ менее 50 мкг/г С5НТ, более предпочтительно, менее 40 мкг/г С5НТ, еще более предпочтительно, менее 30 мкг/г С5НТ, еще более предпочтительно, менее 20 мкг/г С5НТ, и наиболее предпочтительно, менее 10 мкг/г С5НТ.

Способ по настоящему изобретению необязательно дополнительно включает стадию помола обжаренного тригонеллин-содержащего органического материала после стадии (b). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, тригонеллин-содержащий органический материал представляет собой кофе, которое размалывают до марки, выбранной из группы, состоящей из тонкого, среднего и грубого помола.

Обработка горячей водой на Стадии (с) не подлежит каким-либо ограничениям. Например, обработка горячей водой на Стадии (с) может осуществляться в течение по меньшей мере 30 секунд и/или вода может иметь температуру по меньшей мере 80°С.

Способ по настоящему изобретению, необязательно, дополнительно включает стадии фильтрации водного экстракта перед и/или после стадии (d). Предпочтительно, фильтрация осуществляется при комнатной температуре с использованием коммерчески доступных кофейных фильтров под действием силы тяжести.

В другом предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 2,95 мг NMP/100 мл, более предпочтительно, по меньшей мере 5 мг NMP/100 мл, более предпочтительно, по меньшей мере 8 мг NMP/100 мл, прибавляют к водному экстракту на Стадии (d).

Предпочтительно, обогащенный NMP экстракт, полученный способом по настоящему изобретению, содержит по меньшей мере 23 мг/л NMP, более предпочтительно, по меньшей мере 36 мг/л NMP, более предпочтительно, по меньшей мере 48 мг/л NMP.

Обогащенный NMP экстракт, полученный способом по настоящему изобретению, предпочтительно, имеет пониженное содержание С5НТ. В частности, обогащенный NMP экстракт, полученный способом по настоящему изобретению, предпочтительно, имеет пониженное содержание С5НТ по сравнению с тригонеллин-содержащим органическим материалом, используемым в качестве исходного материала в способе по настоящему изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления, обогащенный NMP экстракт, полученный способом по настоящему изобретению, содержит менее 50 мкг/л С5НТ, более предпочтительно, менее 40 мкг/л С5НТ, еще более предпочтительно, менее 30 мкг/л С5НТ, еще более предпочтительно, менее 20 мкг/л С5НТ, и наиболее предпочтительно, менее 10 мкг/л С5НТ.

В другом предпочтительном варианте осуществления, соотношение NMP/C5HT×100 в обогащенном NMP экстракте, полученном способом по настоящему изобретению составляет по меньшей мере 100, более предпочтительно, по меньшей мере 120, более предпочтительно, по меньшей мере 140, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 180.

Термин "N-метилпиридиний", в используемом тут значении, относится к N-метилпиридинию в его ионной форме, а также в форме соли, например, в виде его йодида (NMPI), хлорида, гидроксида или сульфата. Аббревиатуры N-MP и NMP используются тут синонимично для обозначения N-метилпиридиния.

Термин "тригонеллин-содержащий органический материал", в используемом тут значении, относится к любому встречающемуся в природе материалу, содержащему алкалоид тригонеллин.

В общем, тригонеллин-содержащий органический материал выбирают из группы, состоящей из кофе, в частности, Coffea arabica, Coffea canephora, Coffea spp.и Psilanthus spp., членов Fabaceae, в частности, Pisum sativum, Glycine max, Phaseolus vulgaris, Lens culinaris, Cicer arietinum и Trigonella foenum-graecum, членов Chenopodiaceae, в частности Chenopodium quinoa, и членов Роасеае, в частности, Avena sativa.

В предпочтительном варианте осуществления, тригонеллин-содержащий органический материал представляет собой Coffea spp. В более предпочтительном варианте осуществления, тригонеллин-содержащий органический материал представляет собой Coffea arabica, более предпочтительно, Coffea arabica, provenience Columbia, или Coffea arabica, provenience Brazil. В другом предпочтительном варианте осуществления, тригонеллин-содержащий органический материал представляет собой Coffea canephora, также известный как "кофе робуста", более предпочтительно, Coffea canephora, provenience Vietnam.

Настоящее изобретение дополнительно относится к обогащенному N-метилпиридинием (NMP) экстракту, полученному способом по настоящему изобретению.

В другом аспекте, настоящее изобретение также относится к использованию указанного обогащенного N-метилпиридинием (NMP) экстракта в качестве пищевой добавки.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей, в терапевтически эффективном количестве, обогащенный N-метилпиридинием (NMP) экстракт по настоящему изобретению, необязательно, в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемым эксципиентом (эксципиентами) и/или носителем (носителями) и/или разбавителем (разбавителями) и/или растворителем (растворителями) и/или солью (солями) и/или буфером (буферами).

Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может иметь любую пригодную форму, известную специалистам. Предпочтительно, она представляет собой твердую форму, жидкую форму или форму аэрозоля. Введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть осуществлено в любой пригодной форме, известной специалистам, например, перорально, внутривенно, интрадермально, интраперитонеально, внутримышечно или путем ингаляции.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению является пригодной для предотвращения или снижения секреции кислоты желудочного сока и для профилактики или ослабления расстройств и/или болезней, связанных с секрецией кислоты желудочного сока.

В еще одном аспекте, настоящее изобретение относится к способу предотвращения или снижения секреции кислоты желудочного сока и к the профилактике расстройств и/или болезней, связанных с секрецией кислоты желудочного сока, причем указанный способ включает введение субъекту обогащенного N-метилпиридинием (NMP) экстракта по настоящему изобретению и/или медикамента и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Такое введение не подлежит каким-либо особым ограничениям и может осуществляться в любой форме, известной специалистам, например, перорально, внутривенно, интрадермально, интраперитонеально или внутримышечно. В предпочтительном варианте осуществления, субъект является человеком.

В предпочтительном варианте осуществления, расстройства и/или болезни, связанные с секрецией кислоты желудочного сока, выбирают из группы, включающей гастроэзофагеальную рефлюксную болезнь, раки и язвы. В более предпочтительных вариантах осуществления, рак представляет собой рак желудка, и язва представляет собой язву желудка.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к пищевому продукту, обогащенному N-метилпиридинием (NMP) путем прибавления указанного обогащенного NMP экстракта по настоящему изобретению.

Термин "пищевой продукт", в используемом тут значении, относится к любому веществу которое может быть съедено или выпито животным или человеком, например, в качестве пищи и/или для удовольствия. В особенно предпочтительном варианте осуществления, пищевой продукт представляет собой кофе.

Предпочтительно, обогащенный NMP экстракт тригонеллин-содержащего органического материала, полученный способом по настоящему изобретению, объединяет высокое содержание NMP с низким содержанием С5НТ. Благодаря депарафинированию тригонеллин-содержащего органического материала содержание NMP в экстракте сохраняется, и содержание С5НТ снижается. Соответственно, обогащенный NMP экстракт по настоящему изобретению имеет очень предпочтительное соотношение NMP/C5HT. Вследствие этого, антисекреторный эффект NMP по отношению к кислоте желудочного сока пролонгируется во времени после употребления обогащенного NMP экстракта по настоящему изобретению путем минимизации содержания С5НТ.

На фигурах изображено:

Фигура 1: Внутриклеточный протонный индекс (IPX) клеток HGT-1, обработанных в течение 10 минут гистамином (HIS, 1 ммоль/л) или одной из фракций растворителя, приготовленного из кофейного напитка, в концентрациях, соответствующих количественному выходу: вода (Н₂O: 2,14 мг/мл), этилацетат (EtAc: 0,16 мг/мл), дихлорметан (CH₂Cl2: 0,18 мг/мл) и пентан: 0,005 мг/мл). Распределение количественно определяемых соединений по фракциям растворителя приведено в таблице ниже (Статистика: двусторонний t-критерий vs. контрольные клетки, ***=р.0.001, n=9).

Фигура 2: Внутриклеточный протонный индекс (IPX) клеток HGT-1, обработанных в течение 10 минут разными концентрациями N-метилпиридиния в виде отдельного соединения (N-MP) или в комбинации с лиофилизатом, полученным из обычного кофе (Кофе + N-MP), при такой же концентрации N-метилпиридиния в системе, как и при его спользовании в виде отдельного соединения (Статистика: односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с дополнительным тестом Холма-Сидака (Holm-Sidak), *=p.0.05, n=9).

Фигура 3: Внутриклеточный протонный индекс (IPX, время воздействия: 10 мин., А) и содержание циклического АМФ (сАМР, время воздействия: 0,5 мин., В) для клеток HGT-1, обработанных гистамином (HIS: 1 ммоль/л) или лиофилизатами, (2,5 мг/мл) приготовленными из С. Arabica Brazil (Кофе А), обработанного паром С. Arabica Brazil (Кофе AT), С. Robusta Vietnam (кофе R) или обработанного паром С. Robusta Vietnam (кофе RT), с высокой (кофе A, AT), средней (кофе R) и низкой (кофе RT) концентрациями N-метилпиридиния, соответственно (Статистика: двусторонний t-критерий vs. контрольные клетки, "=р.0.01, ***=р.0.001, n=9; или vs. кофе RT ##=p.0.01, ###=р.0.001).

Фигура 4: Индексы активации путей EGFr, ERK1/2, Akt1 и ATF-2 в клетках HGT-1, обработанных в течение 10 мин. гистамином (HIS: 1 ммоль/л) или лиофилизатами (2,5 мг/мл) приготовленными из С. Arabica Brazil (Кофе А), обработанного паром С. Arabica Brazil (Кофе AT), С. Robusta Vietnam (кофе R) или обработанного паром С. Robusta Vietnam (кофе RT), с высокой (кофе A, AT), средней (кофе R) и низкой (кофе RT) концентрациями N-метилпиридиния, соответственно. (Статистика: двусторонний t-критерий vs. контрольные клетки, **=р.0.01, ***=р.0.001, n=9; или vs. кофе RT ##=p.0.01, ###=р.0.001).

Фигура 5: Время-зависимые индексы экспрессии генов Н+,K+-АТФазы (АТР4А), Н2-гистаминового рецептора (HRH2), ацетилхолинового рецептора М3 (CHRM3) и рецептора соматостатина (SSTR2) в клетках HGT-1 после воздействия лиофилизатов (2,5 мг/л), приготовленных из С. Robusta Vietnam (кофе R) или обработанного паром С. Robusta Vietnam (кофе RT), со средней (кофе R) и низкой (кофе RT) концентрациями N-метилпиридиния, соответственно (Статистика: односторонний дисперсионный анализ с дополнительным тестом Холма-Сидака, *=р.0.05, **=р.0.01, n=6; р-значение для одностороннего дисперсионного анализа указано на графике, в таблицах ниже приводятся значимые изменения временной зависимости по сравнению с наиболее выраженным изменением экспрессии, определенным путем проведения дополнительного анализа).

Фигура 6: Время-зависимые индексы экспрессии генов Н+,K+-АТФазы (АТР4А), Н2-гистаминового рецептора (HRH2), ацетилхолинового рецептора М3 (CHRM3) и рецептора соматостатина (SSTR2) в клетках HGT-1 после воздействия лиофилизатов (2,5 мг/л), приготовленных из С. Arabica Brazil (кофе А) или обработанного паром С. Arabica Brazil (кофе AT), с высокими концентрациями N-метилпиридиния (Статистика: односторонний дисперсионный анализ с дополнительным тестом Холма-Сидака, *=р.0.05, **=р.0.01, n=6; р-значение для одностороннего дисперсионного анализа указано на графике, в таблицах ниже приводятся значимые изменения временной зависимости по сравнению с наиболее выраженным изменением экспрессии, определенным путем проведения дополнительного анализа).

Фигура 7: Эффект отдельно взятого соединения и комбинации соединений на экспрессию гена Н+,K+-АТФазы (АТР4А) и Н2-гистаминового рецептора (HRH2). А: Было определено, что хлорогеновая кислота (СА) и кофеин (CAFF) через 20 минут осуществляют повышающую регуляцию экспрессии АТР4А. В отличие от этого, пирогаллол (PYR) и N-метилпиридиний (N-MP) осуществляют понижающую регуляцию экспрессии после 20 минут. (Статистика: односторонний дисперсионный анализ с дополнительным тестом). В: Комбинация СА, CAFF или обоих с N-NMP приводила к значительной компенсации повышающей регуляции CAFF или СА (Статистика: t-критерий для CS или CF vs. комбинация с N-MP или PYR). С: N-алканоил-гидрокситриптамиды (С5НТ) осуществляют чрезвычайно сильную понижающую регуляцию HRH2 после пяти минут. Катехин (CAT) также вызывает понижающую регуляцию. СА повышающее регулирует HRH2 после 20 минут. (Статистика: односторонний дисперсионный анализ с дополнительным тестом). D: Комбинация СА с С5НТ приводит к значительному увеличению экспрессии HRH2 (р.0.001) по сравнению с контрольными клетками. СА в комбинации с CAT не влияют на экспрессию HRH2 по сравнению с отдельно взятым CAT (Статистика: t-критерий для обработанных клеток vs. контрольных клеток). (*=р.0.05, **=р.0.01, ***=р.0.001, n=5-9)

Фигура 8: Эффект отдельно взятого соединения и комбинации соединений на экспрессию гена ацетилхолинового рецептора М3 (CHRM3) и рецептора соматостатина 2 (SSTR2). А: Экспрессия CHRM3 значительно усиливается пирогаллолом (PYR) и, в меньшей степени, кофеином (CAFF) и N-метилпиридинием (N-MP). N-MP через 20 минут, а также PYR через 15 минут вызывают последующую понижающую регуляцию. (Статистика: односторонний дисперсионный анализ с дополнительным тестом). В: Рецептор соматостатина 2 подвергается чрезвычайно сильной понижающей регуляции N-алканоил-гидрокситриптамидами (С5НТ) и незначительной - катехином (CAT). N-MP повышающее регулирует этот антисекреторный рецептор более чем вдвое с последующей понижающей регуляцией. (Статистика: односторонний дисперсионный анализ с дополнительным тестом). С: Комбинированный эффект N-MP и С5НТ после пяти минут приводит к полной компенсации эффектов каждого из соединений по отдельности (Статистика: t-критерий для N-MP/C5HT vs. N-MP или С5НТ). (*=р.0.05, **=р.0.01, ***=р.0.001, n=5-9)

Фигура 9: Эффект полной рекомбинации всех соединений на экспрессию гена Н2-гистаминового рецептора (HRH2) ацетилхолинового рецептора М3 (CHRM3), рецептора соматостатина 2 (SSTR2) и Н+,K+-АТФазы (АТР4А). Также представлены активация трансдукции сигнала киназ и фактора транскрипции ATF-2, а также концентрации циклического АМФ. А: HRH2 подвергается сильной повышающей регуляции смесью всех соединений через 10 минут. CHRM3 и SSTR2 подвергается понижающей регуляции с минимумом через 20 минут. АТР4А регулируется в меньшей степени, чем рецепторы, но все же значительно через пять и 10 минут. (Статистика: односторонний дисперсионный анализ с дополнительным тестом). В: EGFr в значительной степени активируется смесью всех соединений, а также Akt1 и фактора транскрипции ATF-2. В отличие от этого, было показано, что статус фосфорилирования ERK1/2 был ниже ниже контрольных уровней (t-критерий для обработанных клеток vs. необработанные клетки (CTR)). С: Концентрации циклического АМФ возрастают вдвое после обработки смесью соединений в течение одной минуты (t-критерий для обработанных клеток vs. необработанные клетки (CTR)). (*=р.0.05, **=р.0.01, ***=р.0.001, n=3-9)

Фигура 10: Влияние отдельно взятых соединений на концентрации циклического АМФ, активацию киназ и фактора транскрипции ATF-2. А: Гистамин (HIS), кофеин (CAFF), катехин (CAT), пирогаллол (PYR), N-алканоил-гидрокситриптамиды (С5НТ) и N-метилпиридиний (N-MP) значительно повышают концентрации циклического АМФ по сравнению с контрольными клетками (CTR). Хлорогеновая кислота (СА) вызывает значительное снижение концентрации циклического АМФ. В: Рецептор эпидермального фактора роста (EGFr) в значительной сиепени активируется HIS, СА, CAFF и С5НТ, но не PYR, CAT и N-МР. Только Akt1 киназа значительно активировалась путем обработки CAFF, PYR, CAT, С5НТ и N-MP. Передача сигналов ERK1/2 усиливается только вследствие обработки N-MP. С: Связующий белок чувствительного элемента циклического АМФ, известный как фактор транскрипции ATF-2, в значительной степени активируется HIS, CAT и N-MP. CAFF вызывает состояние активации ниже контрольных уровней. (Статистика: t-критерий для обработанных клеток vs. необработанные клетки (CTR), *=р.0.05, **=р.0.01, ***=р.0.001, n=3-7)

Фигура 11: Измерение секреторной активности по внутриклеточному протонному индексу (IPX). А: Обработка клеток HGT-1 гистамином (HIS), кофеином (CAFF), пирогаллолом (PYR), катехином (CAT) или С5НТ приводит к усилению секреции, на что указывает отрицательное значение IPX. В отличие от этого, хлорогеновая кислота (СА) N-метилпиридиний (N-MP) и тригонеллин (TRI) вызывают снижение секреции протонов, на что указывает положительное значение IPX. Статистика: односторонний дисперсионный анализ, р=0,01.0,001; n=10-12). В: Обработка клеток HGT-1 хлорогеновой кислотой (СА) усиливает ток, в то время как рекомбинация всех соединений (Mix) приводит к снижению IPX. (Статистика: t-критерий для обработанных клеток vs. необработанные клетки, **=р=0.05, ***=р=0.001, n=3-7)

Фигура 12: Измерение секреторной активности в камере Уссинга. А: Обработка гистамином (HIS) усиливала ток после апикального применения.

Повышенный ток затем уменьшали путем апикального применения омепразола (ОМР), специфическ ингибитора Н+,K+-АТФазы. В: Апикальное применение хлорогеновой кислоты (СА) вызывает снижение тока, что указывает на пониженную секреторную активность, как в (А). С: Апикальное применение кофеина (CAFF) увеличивает ток. После базального применения N-метилпиридиния (N-MP) ток снова уменьшался, что указывает на ингибирующий эффект N-MP. D: Базальное применение одного лишь N-MP вызывает незначительное снижение тока. Е:. Апикальное прибавление катехина (CAT) усиливало ток, но максимум пика не достигался в месте применения, указывая на замедленный ответ париетальных клеток на CAT. F: Апикальное прибавление С5НТ сильно увеличивало ток в месте применения, однако, величина IPX была недостаточной для значимости (р=0.07, см. A). G: Пирогаллол (PYR) вызывал падение тока после апикального применение, что указывает на снижение секреции. H: Базальное применение тригонеллина (TRI) вызывает сильное снижение тока, указывая на антисекреторный потенциал.

Фигура 13: Рекомбинационные эффекты исследуемых соединений. Из полной рекомбинации всех исследуемых соединений (Mix) исключают N-метилпиридиний (N-MP), хлорогеновую кислоту (СА), кофеин (CAFF), катехин (CAT), C5HT или пирогаллол (PYR) для выявления синергичных эффектов каждого соединения. (Статистика: односторонний или двусторонний t-критерий для смеси без соединения vs. смесь, **=р=0.01, ***=р=0.001, n=9)

Фигура 14: Анализ методом ВЭЖХ-МС/МС (ESI⁺) (с ионизацией электрораспылением) фильтрованных напитков из жареного кофе. Кроме C5HT, N-метилпиридиний определяют в том же напитке методом анализа с растворением стабильного изотопа, который был успешно использован в предшествующих исследованиях. Данные приведены на Фиг. 15.

Фигура 15: Обобщение собранных данных, касающихся N-алканоил-5-гидрокситриптамидов (нижняя панель, мкг/л, сумма производных) и N-метилпиридиния (верхняя панель, мг/л). 50, 80, 110 обозначают степень обжаривания в делениях шкалы. 1) "необработанный Col 5", 2) "необработанный Col 2", 3) "декофеинированный 2+2", 4) "депарафинированный Col 5", 5) "депарафинированный Col 2**"

Фигура 16: Сравнение проанализированных образцов кофе на основании соотношения NMP/C5HT (фактор = NMP/C5HT×100). 50, 80, 110 обозначают степень обжаривания в делениях шкалы. Образцы кофе из предыдущих исследований приведены для сравнения. 1) "необработанный Col 5", 2) "необработанный Col 2", 3) "декофеинированный 2+2", 4) "депарафинированный Col 5", 5) "депарафинированный Col 2**"

Фигура 17: Сравнение секреторного потенциала образцов кофе, обогащенных N-MP. Указан внутриклеточный протонный индекс (IPX). Наиболее эффективные концентрации N-метилпиридиния (в ресуспендированном лиофилизате) указаны над фигурой (статистика: двусторонний t-критерий, ***=р<0.001, $ = р<0.05, $$ = р<0.01, $$$ = р<0.001).

Фигура 18: Влияние тригонеллина на секреторную активность (статистика: двусторонний t-критерий, ***=р<0.001).

Фигура 19: Зависимость доза-эффект для тригонеллина (статистика: односторонний дисперсионный анализ; *=р<0.05, $ = р<0.05, $$ = р<0.01, $$$ = р<0.001, n=4)

Фигура 20: Влияние тригонеллина и N-метилпиридиния на ток короткого замыкания.

Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами.

Примеры

Пример 1: Фракционирование по активности для характеризации кофейного напитка, эффективно обеспечивающего понижающее регулирование механизмов секреции кислоты желудочного сока, по сравнению с обычным кофе

У некоторых особ, употребление кофейных напитков часто связано с симптомами раздражения желудка. Обработка необжаренных кофейных зерен горячим водяным паром гипотетически будет существенно снижать одержание раздражающих желудок соединений, и продукты, обработанные по этой технологии, выпускаются на рынок как "безвредный для желудка кофе". Однако, данные о влиянии обработанного паром кофе на секрецию кислоты желудочного сока являются противоречивыми и до настоящего времени не было точно установлено, какие из компонентов кофе действуют как про- или антисекреторные стимуляторы. Представленный тут пример направлен на характеризацию кофейного напитка, который осуществляет эффективную понижающую регуляцию механизмов секреция протонов в желудочных клетках человека (HGT-1).

Сначала, обычный кофейный напиток фракционируют с помощью растворителей разной полярности: воды, этилацетата, дихлорметана и пентана. Функциональные анализы протон-секреторной активности (PSA) этих фракций растворителя продемонстрировали наименее выраженный эффект для водной фракции, в которой количественными анализами было выявлено наибольшее из всех фракций содержание хлорогеновой кислоты (95%), βN-алканоил-5-гидрокситриптамидов (55%) и N-метилпиридиния (N-MP, >99%). Последующие эксперименты продемонстрировали, что клетки HGT-1, обработанные обычным кофе с повышенным содержанием N-MP в концентрации примерно 20 мг/мл N-MP, показывают значительное снижение PSA по сравнению с клетками, которые были подвергнуты воздействию лиофилизатами кофейного напитка, содержащего более высокие (32-34 мг/л) или низкие (5 мг/л) концентрации N-MP. Эти результаты были подтверждены путем проведения анализов метаболических путей факторов транскрипции (ATF-1, Akt1) и передачи сигналов (cAMP, EGFr), киназы (ERK1/2) и экспериментами по экспрессии гена про- (гистамин-НRН2, ацетилхолин-СНRМ3) и анти- (соматостатин-SSTRI) секреторных рецепторов и Н+,K+-АТФазы.

Подготовка образцов. Для фракционирования растворителя, взвешивают 54 г гомогенного материала порошка молотого жареного кофе (обычная рыночная кофейная смесь, не обработанная паром и не декофеинированная) на бумажном фильтре, обычно используемом для домашнего приготовления кофейного напитка (Melitta Gold, Nr. 4, Aldi, Germany). Порции свежевскипяченной водопроводной воды (Т 90-95°С, приблизительно 100 мл каждая) выливают на порошок и горячий фильтрат собирают в мерную колбу на 1000 мл. Точно 500 мл раствора кофе переносят в кристаллизаторы, немедленно замораживают (-20°С) и наконец высушивают лиофилизацией (48 ч, 0,77 мбар, 25°С). Вторую часть кофейного напитка (500 мл) переносят в делительную воронку и водную фазу поочередно экстрагируют пентаном (4×500 мл), дихлорметаном (4×500 мл) и этилацетатом (4×500 мл), причем остается остаток водной фазы. Все полученные фракции концентрируют под вакуумом, разводят в воде, замораживают (-20°С) и лиофилизируют (48 ч, 0,77 мбар, 25°С). Выход определяют гравиметрически. Фракции растворителя используют затем для функциональных анализов секреторной активности желудочных париетальных клеток человека в концентрациях, соответствующих их соответствующему выходу.

Исследования клеточных механизмов регуляции кислоты желудочного сока проводят с двумя образцами С. Arabica Brazil (кофе А) и двумя - С. Robusta Vietnam (кофе R). Один образец каждого сорта кофе представлял собой обычный кофе, не обработанный паром и не декофеинированный, а другой парный образец был подвергнут обработке паром (кофе AT, кофе RT), в соответствии с практикой производителя для удаления предполагаемых раздражающих желудок веществ. Все образцы кофе были типичными торговыми продуктами и были предоставлены местным производителем кофе. Вкратце, необжаренные кофейные зерна подвергают экстракция горячим водяным паром под давлением от 19 до 22 psi (131-152 кПа) в течение 10-30 минут. После этого остаточную влагу испаряют нагреванием зерен до 130-150°С. Наконец, испарившийся водяной пар выпускают из аппарата, а исходное влагосодержание необжаренных кофейных зерен восстанавливают в разреженной атмосфере. Из всех этих четырех образцов кофе (A, AT, R и RT) готовят напитки по стандартному рецепту, типично используемому для домашнего приготовления.

Клеточная культура. Париетальные клетки карциномы человека (HGT-1) были предоставлены Dr. C. Laboisse (Laboratory of Pathological Anatomy, Nantes France) и культивировались при 37°С и 5% CO₂. Модифицированную по Дульбекко среду Игла (DMEM, РАА, Coelbe, Germany) с глюкозой (4%, РАА, Coelbe, Germany) используют в качестве культуральной среды с добавками 20% фетальной телячьей сыворотки (РАА, Coelbe, Germany), 2% L-глутамина (РАА, Coelbe, Germany), 2% пенициллина-стрептомицина (РАА, Coelbe, Germany) и 2% буфера HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота) (РАА, Coelbe, Germany). Перед каждым экспериментом, клетки культивируют в течение 5 дней и синхронизуют с DMEM без добавки фетальной телячьей сыворотки.

Выделение РНК и синтез кДНК. Высеивают 100000 клеток в шестилуночные планшеты. После обработки образца, клетки собирают для анализа полной РНК, которую выделяют с помощью набора RNeasy Midi Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Гидролиз ДНКазы I проводят на колонке с помощью набора RNase free DNase Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Перед количественной ПЦР (qPCR), общее содержание РНК количественно определяют фотометрически при 260 нм. кДНК синтезируюи с использованием набора cDNA High Capacity Synthesis Kit (Applied Biosystems, Munich, Germany), как описано в руководстве производителя.

Анализы генной экспрессии. Анализы генной экспрессии проводят после обработки клеток образцом в течение 5, 10, 15 или 20 мин. Праймеры для альфа-субъединицы Н+,K+-АТФазы (АТР4А), Н2-гистаминового рецептора (HRH2), рецептора соматостатина (SSTR2) и ацетилхол и нового рецептора М3 (CHRM3) были сконструированы с помощью Beacon Designer 7.0 (PremierBiosoft, Palo Alto, CA) и проверены стандартными анализами и по кривой плавления, как описано в литературе. Точность последовательности продуктов ПЦР проверяли методом секвенирования (Medigenomics, Martinsried, Germany, данные не приведены). Анализы методом ПЦР в реальном времени проводили с помощью термоциклера М×3000р cycler (Stratagene, Amsterdam, Netherlands) с использованием набора Brilliant SYBR Green Kit (Stratagene, Amsterdam, Netherlands). Условия термоциклирования: 10:00 мин./95°С (активация), 00:30 с/95°С (денатурация), 00:30 с/60°С (отжиг с измерением флуоресценции), 00:30 с/72°С (удлинение цепи).

Количественное определение циклического АМФ. В общей сложности 50000 клеток высеивают на 24-луночные планшеты и обрабатывают соответствующим образцом в течение 0,5 минут. Для определения циклического АМФ в клеточных супернатантах, мы использовали набор для конкурентного определения циклического АМФ ELISA parameter kit (R&D Systems, Minneapolis, MN) как описано в протоколе производителя. Супернатанты выделяют после 1 минуты инкубации.

Анализ трансдукции сигнала. Состояние фосфорилирования рецептора тирозинкиназы и MAPK киназы детектируют методом твердофазовых иммуноферментных анализов. Выделяют общий белок из клеток HGT-1 после инкубации с исследуемыми марками кофе в течение 10 мин. в соответствии с рекомендациями протокола производителя. Общее содержание белка количественно определяют фотометрически с помощью реагента Бредфорда (Bradford) (Bio-Rad, Munich). Для определения состояния фосфорилирования используют следующие наборы ELISA: EGFr-ELISA, ERK1/2 ELISA (оба Calbiochem/Merck, Nottingham, UK), Akt1 pathscan ELISA и ATF-2 pathscan ELISA (оба Cell Signaling/New England Biolabs, Frankfurt a. M., Germany). Поглощение считывают при 450 нм с помощью планшет-ридера MRX (Dynex, Berlin, Germany) или планшет-ридера Varioscan Flash (Thermo Electron Cooperation, Walthman, MI) с дополнительным считыванием длины волны эталона при 620 нм, если это указано в протоколе производителя.

Секреторная Активность. Для каждого биологического независимого эксперимента используют объем суспензии клеток, равный 2 мл, что соответствует 2000000 клеток, и обрабатывают в течение 10 минут 2,5 мг лиофилизата кофейного напитка (54 г/1,1 л горячей воды) на мл PBS, гистамином (1 ммоль в PBS (фосфатно-солевой буфер)) или разными фракциями растворителя при 37°С. Секреторную активность измеряют путем определения внутриклеточного протонного индекса (IPX). Для измерения внутриклеточного pH используют флуоресцентный краситель Carboxy-SNARF-AM (Invitrogen, Karlsruhe, Germany). Способ аттестуют, как описано в литературе, и гистамин (1 ммоль/л) используют в качестве хорошо изученного эталонного соединения, которое стимулирует секрецию желудочной кислоты. Вкратце, клетки HGT-1 насыщают 3 мкМ красителя в течение 30 минут на льду. Внутриклеточный pH рассчитывают по калибровочной кривой для обработанных 2 мкМ нигерицина (РАА, Coelbe, Germany) клеток HGT-1 в буфере K+ clamp, содержащем 20 мМ NaCl, 110 мМ KCl, 1 мМ CaCl₂, 1 мМ MgSO₄, 18 мМ D-глюкозы и 20 мМ HEPES, который настраивают на разные калибровочные точки pH (6,8-8,2) путем титрования NaOH. Затем рассчитывают внутриклеточный протонный индекс (IPX) путем log2-преобразования соотношения концентраций внутриклеточных протонов для обработанных клеток и контрольных к