Прогнозирование прогрессирования возрастной макулодистрофии до поздней стадии с помощью полигенного показателя

Прогнозирование прогрессирования возрастной макулодистрофии до поздней стадии с помощью полигенного показателя

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способам выявления лиц с промежуточной возрастной макулодистрофией (ВМД), характеризующихся повышенным риском прогрессирования ВМД до поздней стадии, с помощью полигенного показателя, рассчитываемого на основании результатов полногеномного исследования генных ассоциаций, использующего тысячи однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП).

Уровень техники

Возрастная макулодистрофия (ВМД)

ВМД является возрастной дегенерацией желтого пятна, являющейся основной причиной необратимых нарушений зрения у лиц старше 60 лет. Существуют два типа ВМД - неэкссудативная (сухая) и экссудативная (влажная) ВМД. Сухая, или неэкссудативная, форма включает атрофические и гипертрофические изменения пигментного эпителия сетчатки (ПЭС), подстилающего центральную область сетчатки (желтое пятно), а также отложения (друзы) в ПЭС. У пациентов с неэкссудативной ВМД может происходить прогрессирование до влажной, или экссудативной, формы ВМД. По мере прогрессирования заболевания, первоначально образовавшиеся друзы увеличиваются в размерах и количестве. На поздних стадиях ВМД под сетчаткой развиваются аномальные кровеносные сосуды, называемые хориоидальными неоваскулярными мембранами (CNVM), возникают утечки жидкости и крови, и в конечном итоге образуется дисковидный рубец в и под сетчаткой, что приводит к слепоте. Неэкссудативная ВМД, как правило, являющаяся предшественником экссудативной ВМД, является более распространенной.

Полногеномные исследования ассоциаций

Параллельно с секвенированием генома человека развивался международный проект, направленный на разработку карты гаплотипов генома человека HapMap, описывающей общую картину изменчивости последовательности ДНК человека. Проект HapMap стартовал в 2002 году, и его результаты общедоступны за счет периодических выпусков. Кроме того, быстрое развитие методик генотипирования и анализа позволили выполнить полногеномное исследование ассоциаций среди крупных групп населения для выявления генетических вариантов, характеризующихся значительной частотой среди населения. Это, в свою очередь, позволило выполнить исследование полигенных заболеваний и признаков. С тех пор полногеномные исследования ассоциаций выявили многочисленные генетические локусы, в которых находятся распространенные генетические варианты, воспроизводимо ассоциированные с полигенными признаками. См., например, Altshuler et al., Science (2008), 322:881-8 (генетическое картирование заболевания человека); Mohkle et al., Hum Mol Genet (2008) 17:R102-R108 (распространенные генетические варианты, ассоциированные с заболеваниями обмена веществ и сердечно-сосудистыми заболеваниями); Lettre et al., Hum Mol Genet (2008):17-R116-R121 (распространенные генетические варианты, ассоциированные с аутоиммунными заболеваниями); Purcell et al., Nature (2009) 460(7256):748-52 (распространенные генетические варианты, ассоциированные с риском шизофрении и биполярного расстройства) и Wei et al., PLoS Genet. (2009) 5(10):e1000678. Epub 2009 Oct 9 (сахарный диабет 1 типа).

Johanna M. Seddon, магистр наук медицинского факультета медицинского центра Новой Англии им. Тафтса, Бостон, США, и ее коллеги выполнили оценку прогностической значимости некоторых генетических вариантов для прогрессирования ВМД до поздней стадии и связанной с этим потери зрения, и сообщили о результатах своего исследования в статье Seddon et al., JAMA (2007) 297:1793-1800. В исследование были включены 1466 европеоидов-участников исследования возрастных заболеваний глаз (AREDS) - многоцентрового клинического исследования, проводившегося в США с 1990 по 2001 год при среднем времени наблюдения 6,3 года. В ходе исследования у 281 участника произошло прогрессирование ВМД до поздней стадии в одном или обоих глазах, включавшее: географическую атрофию (приводившую к истончению и обесцвечиванию сетчатки), экссудативное заболевание (выход жидкости, клеток и остатков клеток из кровеносных сосудов) или потерю зрения, вызванную ВМД. На основе генотипирования определили, что распространенные полиморфизмы в генах CFH и LOC387715 независимо друг от друга связаны с прогрессированием ВМД от ранних стадий ВМД (друзы и пигментные изменения) до поздних форм ВМД (географическая атрофия или неоваскулярная ВМД), приводивших к нарушениям зрения или слепоте. Исследователи обнаружили, что генетические полиморфизмы CFH Y402H и LOC387715 A69S связаны с прогрессированием до более поздней стадии ВМД, причем риск прогрессирования был в 2,6 раза выше для генотипа риска CFH и в 4,1 раза выше для генотипа риска LOC387715 с учетом других факторов, ассоциированных с ВМД. Вероятность прогрессирования составила 48 процентов для генотипа с наиболее высоким риском по сравнению с 5 процентами для генотипов с низким риском. Наличие всех неблагоприятных факторов (оба указанных генотипа риска, курение и индекс массы тела 25 или более) повышает риск в 19 раз. Курение и высокий индекс массы тела повышают вероятность прогрессирования в пределах каждого генотипа риска.

Эта же группа сообщила о результатах более позднего исследования, в ходе которого изучалось совместное влияние генетических, офтальмологических и экологических факторов и прогностических моделей на распространенность и заболеваемость ВМД. (Seddon et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science (2009) 50:2044-53. Авторы обнаружили независимую ассоциированность шести генетических вариантов (CFH Y402H; CFH rs1410996; LOC387715 A69S (ARMS2); C2 E318D; CFB; C3 R102G) как с распространенностью, так и с заболеваемостью ВМД на поздних стадиях. По мнению авторов, все указанные варианты, кроме CFB, были в значительной степени связаны с прогрессированием до поздних стадий ВМД, с учетом исходной стадии ВМД и других факторов.

Установлено, что генетические, демографические (например, возраст, пол) и экологические (например, курение) факторы вносят вклад в развитие и прогрессирование ВМД, причем генетические факторы включают однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП), варианты количества копий (ВКК) и эпигенетические варианты, связанные с метилированием ДНК или модификацией гистонами. Тем не менее, относительный вклад этих факторов, в том числе вклад каждого класса генетических вариантов, в риск возникновения или прогрессирования заболевания до сих пор неизвестен. Соответственно, существует потребность в лучшем понимании и инструментах для прогнозирования вероятности развития ВМД или, для пациентов, у которых уже диагностирована ВМД, риска прогрессирования их состояния.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение, по меньшей мере частично, основано на признании того, что тысячи распространенных генетических вариантов, оказывающих незначительный эффект, вносят вклад в прогрессирование промежуточной ВМД до ВМД поздней стадии, и, в общей сложности, с помощью полигенного показателя можно объяснить и прогнозировать риск прогрессирования от промежуточной ВМД до ВМД на поздней стадии.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки риска развития поздней стадии возрастной макулодистрофии (ВМД) у субъекта-человека, включающему определение в биологическом образце от субъекта наличия или отсутствия аллелей риска распространенных аллельных вариантов, ассоциированных с ВМД во множестве независимых локусов.

В одном варианте воплощения исследуемые аллели риска не включали комплемент rs10737680 и rs1329424 (фактор комплемента H); rs2285714 (фактор комплемента I); rs429608 и rs9380272 (комплемент C2), rs3793917 (HTRA1) и rs2230199 (комплемент C3).

В конкретном варианте воплощения после определения наличия или отсутствия аллелей риска рассчитывают полигенный показатель для субъекта, причем высокий полигенный показатель указывает на более высокий риск развития поздней стадии ВМД.

В различных вариантах воплощения определяют частоты аллелей в, по меньшей мере, 20, или, по меньшей мере, 50, или, по меньшей мере, 100, или, по меньшей мере, 200, или, по меньшей мере, 500, или, по меньшей мере, 750, или, по меньшей мере, 1000 или, по меньшей мере, 1500 или, по меньшей мере, 2000 или, по меньшей мере, 2500 или, по меньшей мере, 3000 или, по меньшей мере, 3500 или, по меньшей мере, 4000 или, по меньшей мере, 4500 или, по меньшей мере, 5000 или, по меньшей мере, 5500 или, по меньшей мере, 6000 или, по меньшей мере, 6500 или, по меньшей мере, 7000 или, по меньшей мере, 7500 или, по меньшей мере, 8000 или, по меньшей мере, 8500 или, по меньшей мере, 9000 или, по меньшей мере, 9500 или, по меньшей мере, 10000 независимых локусов.

В еще одном варианте воплощения у субъекта диагностирована ранняя стадия ВМД.

В еще одном варианте воплощения у субъекта диагностирована промежуточная стадия ВМД.

В другом варианте воплощения указанный способ дополнительно включает оценку одного или более аспектов анамнеза субъекта, например, одного или более из: возраста, этнической принадлежности, индекса массы тела, истории потребления алкоголя, истории курения, истории физических нагрузок, диеты, семейного анамнеза ВМД или других возрастных офтальмологических состояний, включая возраст родственников на момент постановки им диагноза, и индивидуальной истории лечения ВМД.

В другом варианте воплощения определение наличия или отсутствия аллелей риска осуществляют путем амплификации нуклеиновой кислоты из указанного образца.

В различных вариантах воплощения амплификация может включать ПЦР, амплификация может осуществляться на чипе, причем праймеры для амплификации специфичны к тестируемым аллелям распространенных генетических вариантов.

В конкретном варианте воплощения амплификация включает: (1) смешивание праймера для амплификации или пары праймеров для амплификации с нуклеотидной матрицей, выделенной из биологического образца, причем праймер или пара праймеров комплементарны или частично комплементарны области, располагающейся вблизи от или включающей полиморфизм, и способны инициировать полимеризацию нуклеиновой кислоты на матричной нуклеиновой кислоте за счет полимеразы; и б) удлинение праймера или пары праймеров в ходе реакции полимеризации ДНК с участием полимеразы и матричной нуклеиновой кислоты, приводящее к получению ампликона.

Ампликон можно, например, обнаружить с помощью способа, включающего одно или более из следующего: гибридизацию ампликона с набором фрагментов, гидролиз ампликона с помощью фермента рестрикции или анализ на основе ПЦР в реальном времени.

В еще одном варианте воплощения амплификация включает проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР), ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) или лигазной цепной реакции (ЛЦР) с использованием нуклеиновой кислоты, выделенной из организма или биологического образца, в качестве матрицы для ПЦР, ОТ-ПЦР или ЛЦР.

В еще одном варианте воплощения способ дополнительно может включать расщепление амплифицированной нуклеиновой кислоты.

В другом варианте воплощения биологический образец получают из физиологической жидкости, например, слюны или крови.

В других вариантах воплощения способ дополнительно включает этап принятия решения о расписании и/или частоте диагностического тестирования ВМД для субъекта и/или о расписании и/или частоте лечения ВМД для субъекта.

В другом варианте воплощения способ дополнительно включает этап лечения ВМД у субъекта с установленным повышенным риском развития поздней стадии ВМД, причем лечение может, например, включать введение лекарственного средства, выбранного из группы, состоящей из антител против фактора D, антител против ФРЭС, CRIg и гибрида CRIg-Ig.

В еще одном варианте воплощения указанный способ включает определение наличия или отсутствия аллелей риска для всех однонуклеотидных полиморфизмов, представленных в Таблице S1, и расчет полигенного показателя на основе такого определения.

В еще одном варианте воплощения указанный способ дополнительно включает этап записи результатов указанного определения на машиночитаемый носитель.

В еще одном варианте воплощения о результатах уведомляют субъекта или врача субъекта и/или записывают результаты в виде отчета.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к отчету, включающему результаты способов, описанных здесь.

Краткое описание чертежей

Файл настоящего патента содержит, по меньшей мере, один цветной рисунок. Копии настоящего патента или патентной публикации с цветным(и) рисунком(ами) будут предоставлены Управлением после запроса и оплаты в необходимом размере

Фигура 1: Известные гены риска ВМД дают возможность прогноза прогрессирования.

Фигура 2: Полигенный показатель идентифицирует лиц с повышенным риском прогрессирования ВМД до поздней стадии.

Фигура 3: Полигенный показатель идентифицирует лиц с повышенным риском прогрессирования ВМД до поздней стадии независимо от клинической оценки исходного уровня.

Таблица S1: Список 10617 ОНП. CHR= хромосома; ОНП= ОНП ID; BP= физическое положение (пар оснований); А1= код первого (минорного) аллеля; F_A - частота аллеля 1 в исследуемых случаях; F_U: частота аллеля в контрольных случаях; А2= код второго (основного) аллеля; CHISQ=значение хи-квадрат; Р= значение р (значимости теста ассоциированности "случай/контроль"); OR= коэффициент несогласия для ассоциированности с риском ВМД. В некоторых случаях минорный аллель ассоциирован с риском (OR>1), а в некоторых случаях основной аллель ассоциирован с риском ВМД (OR<1).

Подробное описание изобретения

I. Определения

При использовании здесь торговых наименований

подразумевается, что заявители независимо включают торговоенаименование состава продукта, непатентованное название лекарства и активный(е) фармацевтический(е) ингредиент(ы) продукта под торговым наименованием.

В настоящем описании подразумевается, что следующие термины и фразы имеют следующие значения, если не указано иное:

Термин "комплемент-ассоциированное состояние глаза" используется в самом широком смысле и включает все офтальмологические состояния, в патогенезе которых участвует комплемент, в том числе классический и альтернативный пути и, в частности, альтернативный путь комплемента. Комплемент-ассоциированные состояния глаза включают, без ограничения, дегенеративные заболевания желтого пятна, например, все стадии возрастной макулодистрофии (ВМД), включая сухую и влажную (неэкссудативную и экссудативную) формы, хориоидальную неоваскуляризацию (CNV), увеит, диабетическую и другие виды ишемической ретинопатии, и другие заболевания, сопровождающиеся внутриглазной неоваскуляризацией, например, диабетический отек желтого пятна, патологическую миопию, болезнь фон Гиппеля-Линдау, гистоплазмоз глаз, окклюзию центральной вены сетчатки (CRVO), неоваскуляризацию роговицы и неоваскуляризацию сетчатки. Предпочтительная группа комплемент-ассоциированных состояний глаза включает возрастную макулодистрофию (ВМД), в том числе неэкссудативную (влажную) и экссудативную (сухую или атрофическую) ВМД, хориоидальную неоваскуляризацию (CNV), диабетическую ретинопатию (ДР) и эндофтальмит.

Термин "возрастная макулодистрофия" или "ВМД" используется здесь для охвата всех стадий ВМД, в том числе категории 2 (ранней стадии), категории 3 (промежуточной) и категории 4 (поздней стадии) ВМД.

"Лечение" является вмешательством, осуществляемым с целью предупреждения развития или изменения патологии расстройства. Соответственно, "лечение" относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим и предохранительным мероприятиям. "Те, кто нуждается в лечении", включают тех, кто уже страдает расстройством, а также тех, у кого расстройство следует предотвратить. При лечении комплемент-ассоциированных состояний глаз, например, ВМД, терапевтический агент может непосредственно благотворно влиять на величину, тяжесть, прогрессирование или симптомы заболевания или повышать восприимчивость заболевания к лечению другими терапевтическими агентами.

"Патология" заболевания, например, комплемент-ассоциированного состояния глаза, в том числе ВМД, включает все явления, угрожающие благополучию пациента. Указанный термин включает, без ограничения, морфологические явления, связанные с различными стадиями заболевания, например, наличие, количество и размер друз в одном или обоих глазах, накопление базальных пластинчатых отложений (BLamD) и базальных линейных отложений (BLinD), пигментные изменения, географическую атрофию (GA) и изменения пигментного эпителия сетчатки (ПЭС), разрушение светочувствительных клеток и опорной ткани в центральной области сетчатки (поздняя стадия сухой формы), или аномальные и хрупкие кровеносные сосуды под сетчаткой (влажная форма); физиологические изменения, например, нарушение зрения, частичная или полная потеря зрения.

Термин "млекопитающее", как используется здесь, относится к любому животному, классифицируемому как млекопитающее, включая, без ограничения, людей, высших приматов, домашних и сельскохозяйственных животных, и животных, содержащихся в зоопарках, спортивных или комнатных животных, например, лошадей, свиней, крупный рогатый скот, собак, кошек и хорьков и т.д. В предпочтительном варианте осуществления изобретения млекопитающее является человеком или другим высшим приматом.

Введение "в комбинации с" одним или более дополнительным терапевтическим агентом включает одновременное (совместное) и последовательное введение в любом порядке.

"Фенотип" является признаком или совокупностью признаков, наблюдаемым/наблюдаемых у особи или в популяции. Указанный признак может быть количественным (количественный признак, или QTL) или качественным. Например, восприимчивость к ВМД является фенотипом, который можно отслеживать в соответствии со способами, композициями, наборами и системами, описанными здесь.

"Фенотип подверженности ВМД" является фенотипом, отражающим предрасположенность к развитию ВМД у субъекта. Фенотип, отражающий предрасположенность к ВМД, может, например, демонстрировать более высокую вероятность развития ВМД у субъекта с указанным фенотипом, чем у членов соответствующей общей популяции, при данном наборе условий окружающей среды (диета, режим физической активности, географическое положение и т.д.).

"Этническая принадлежность" может быть основана на самоидентификации (собственной оценке), но предпочтительно основывается на использовании полногеномных данных о ОНП с целью определения степени родства образцов и сравнения образцов с эталонными популяциями проекта Human HapMap для присвоения этнической принадлежности. Популяциями, включенными в HapMap, являются йоруба в г. Ибадан, Нигерия (обозначение: YRI); японцы в г. Токио, Япония (обозначение: JPT); китайские ханьцы в г. Пекин, Китай (обозначение: CHB); и CEPH (Центр по изучению полиморфизма у человека, Centre d'Etude du Polymorphisme Humain) (жители штата Юта, происходящие из северной и западной Европы) (обозначение: CEU). Анализ главных компонентов использует данные о генотипе для расчета осей изменчивости, которые можно интерпретировать как описание непрерывной наследственной гетерогенности в пределах группы лиц. Эти оси изменчивости определяются как верхние собственные векторы матрицы ковариации между индивидуумами в исследуемой популяции. Затем можно скорректировать ассоциацию между генотипами и фенотипами, связанную с родословной по каждой оси. Обычно образцы, являющиеся значимо аномальными образцами (по отношению к исследуемой популяции), исключают из анализа в целях контроля за расслоением популяции. В частности, генотипы из всего генома используют для расчета собственных векторов (форма анализа главных компонентов, PCA), а затем анализируют образцы на основе первичных собственных векторов. Экстремально аномальные значения (сигма > 6) удаляют, а результаты ассоциаций корректируют, используя первые 5 собственных векторов в качестве ковариат. См. также Price, A.L. et al. Principal components analysis corrects for stratification in genome-wide association studies. Nat. Genet. 38, 904-909 (2006) и Пример.

"Полиморфизм" является изменчивым локусом; т.е. в популяции присутствует более одной версии или аллеля нуклеотидной последовательности в области полиморфизма.

Термин "аллель" относится к одной из двух или более различных нуклеотидных последовательностей, встречающихся или кодируемых в определенном локусе, или двух или более различных полипептидных последовательностей, кодируемых таким локусом. Например, первый аллель может находиться на одной хромосоме, в то время как второй аллель находится на второй гомологичной хромосоме, например, как это происходит с разными хромосомами гетерозиготной особи или между различными гомозиготными или гетерозиготными особями в популяции. Одним из примеров полиморфизма является "однонуклеотидный полиморфизм" (ОНП), являющийся полиморфизм по одиночному нуклеотидному положению в геноме (нуклеотид в указанном положении варьирует между отдельными лицами или популяциями).

Аллель "положительно" коррелирует с признаком, когда аллель сцеплен с признаком, и когда присутствие аллеля указывает на то, что признак или форма признака будет иметь место у особи, включающей указанный аллель. Аллель отрицательно коррелирует с признаком, когда аллель сцеплен с признаком, и когда присутствие аллеля указывает на то, что признак или форма признака не будет иметь место у особи, включающей указанный аллель.

Маркерный полиморфизм или аллель "коррелирует" или "ассоциирован" с указанным фенотипом (например, подверженностью ВМД и т.д.), если можно установить его статистическую связь (положительную или отрицательную) с фенотипом. То есть указанный полиморфизм чаще встречается в исследуемой популяции (например, пациентов с ВМД), чем в контрольной популяции (например, лиц, не страдающих раком молочной железы). Часто определяют, что эта корреляция носит причинный характер, но этого может и не быть - простой генетической связи (ассоциации) признака, лежащего в основе фенотипа, с локусом достаточно для возникновения корреляции/ассоциации.

"Благоприятный аллель" является аллелем конкретного локуса, положительно коррелирующим с желательным фенотипом, например, устойчивостью к ВМД, например, аллелем, отрицательно коррелирующим с предрасположенностью к ВМД. Благоприятный аллель сцепленного маркера является маркерным аллелем, который отделяют от благоприятного аллеля. Благоприятная аллельная форма сегмента хромосомы является сегментом хромосомы, включающим нуклеотидную последовательность, положительно коррелирующую с желательным фенотипом или отрицательно коррелирующую с неблагоприятным фенотипом, в одном или более генетических локусов, физически расположенных на сегменте хромосомы.

"Неблагоприятный аллель" является аллелем конкретного локуса, отрицательно коррелирующим с желательным фенотипом или положительно коррелирующим с нежелательным фенотипом, например, положительно коррелирующим с подверженностью раку молочной железы. Неблагоприятный аллель сцепленного маркера является маркерным аллелем, который отделяют от неблагоприятного аллеля. Неблагоприятная аллельная форма сегмента хромосомы является сегментом хромосомы, включающим нуклеотидную последовательность, отрицательно коррелирующую с желательным фенотипом или положительно коррелирующую с нежелательным фенотипом, в одном или более генетических локусов, физически расположенных на сегменте хромосомы.

"Аллель риска" является аллелем, положительно коррелирующим с риском развития заболевания или состояния, например, ВМД, то есть указывающим на то, что субъект обладает повышенной вероятностью развития ВМД, или прогрессирования ВМД до более поздней стадии.

"Полигенный показатель" используется для определения риска развития заболевания у субъекта или прогрессирования заболевания до более поздней стадии, на основе большого количества, обычно тысяч, распространенных генетических вариантов, каждый из которых по отдельности может оказывать незначительный эффект, внося вклад в заболевание или его прогрессирование, но в совокупности имеющих значительное прогностическое значение. В данном случае полигенный показатель используют для прогнозирования вероятности того, что ВМД у пациента будет прогрессировать до поздней стадии, с помощью распространенных однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП), ассоциированных с ВМД. Логарифм коэффициента несогласия (OR) каждого варианта, достигавшего P < 0,1 в наборе собранных данных, используют для расчета полигенного показателя. В частности, для каждого из 10617 вариантов, используемых при расчете показателя, логарифм коэффициента несогласия умножают на количество эталонных аллелей (0, 1 или 2), присутствующих у субъекта. Полученную сумму делят на количество вариантов, протестированных у каждого субъекта, получая конечный полигенный показатель. В соответствии с настоящим изобретением, "высокий полигенный показатель" используют для обозначения полигенного показателя > 0,0001, "низкий полигенный показатель" используют для обозначения полигенного показателя < 0,0001, а полигенные показатели между двумя указанными порогами определяются как "средние полигенные показатели".

"Частота аллеля" относится к частоте (доле или проценту), с которой аллель присутствует в локусе у субъекта, в пределах линии или популяции линий. Например, для аллеля "А" диплоидные особи генотипа "AA", "Aa" или "аа" могут обладать частотой аллеля 2, 1 или 0, соответственно. Частоту аллеля в пределах линии или популяции (например, исследуемой или контрольной) можно оценить путем усреднения частот аллелей в образцах особей из этой линии или популяции. Аналогично, можно рассчитать частоты аллелей в популяции линий путем усреднения частот аллелей линий, из которых состоит популяция.

Особь является "гомозиготной", если особь несет только один тип аллеля в данном локусе (например, диплоидная особь несет копию одного и того же аллеля в данном локусе на каждой из двух гомологичных хромосом). Особь является "гетерозиготной", если в данном локусе присутствует более одного типа аллеля (например, диплоидная особь несет одну копию каждого из двух различных аллелей). Термин "гомогенность" означает, что члены группы обладают одинаковым генотипом в одном или более конкретных локусах. В противоположность этому, термин "гетерогенность" используется для указания того, что особи в группе различаются по генотипу в одном или более указанных локусах.

"Локус" является положением или областью на хромосоме. Например, полиморфный локус является положением или областью, где расположена полиморфная нуклеиновая кислота, детерминанта признака, ген или маркер. В другом примере "локус гена" является определенным положением (областью) хромосомы в геноме вида, где может находиться определенный ген. Аналогично, термин "локус количественного признака" или "QTL" относится к локусу, содержащему, по меньшей мере, два аллеля, по-разному влияющие на экспрессию или изменяющие вариант количественного или непрерывного фенотипического признака в, по меньшей мере, одном генетическом окружении, например, в, по меньшей мере, одной популяции или потомстве.

"Маркер", "молекулярный маркер" или "маркерная нуклеиновая кислота" относится к нуклеотидной последовательности или кодируемому ею продукту (например, белку), используемому в качестве точки отсчета при идентификации локуса или сцепленного локуса. Маркер может происходить от геномной нуклеотидной последовательности или от экспрессированных нуклеотидных последовательностей (например, из РНК, ядерной _ΝРНК, мРНК, кДНК и т.д.), или от кодируемого полипептида. Данный термин также относится к нуклеотидным последовательностям, комплементарным или фланкирующим маркерные последовательности, например, нуклеиновым кислотам, используемым в качестве зондов или пар праймеров, способных амплифицировать маркерную последовательность.

"Маркерный зонд" является нуклеотидной последовательностью или молекулой, которую можно использовать для определения присутствия маркерного локуса, например, нуклеотидным зондом, комплементарным последовательности маркерного локуса. Нуклеиновые кислоты являются "комплементарными", когда они специфически гибридизуются в растворе, например, в соответствии с правилами спаривания оснований по Уотсону-Крику.

"Маркерный локус" является локусом, который можно использовать для отслеживания присутствия второго сцепленного локуса, например, сцепленного или коррелирующего локуса, кодирующего или вносящего вклад в популяционную изменчивость фенотипического признака. Например, маркерный локус можно использовать для мониторинга сегрегации аллелей в локусе, например, QTL, генетически или физически сцепленном с маркерным локусом. Таким образом, "маркерный аллель", или "аллель маркерного локуса" является одной из множества полиморфных нуклеотидных последовательностей, присутствующих в маркерном локусе в популяции, полиморфной по маркерному локусу. В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает маркерные локусы, коррелирующие с интересующим фенотипом, например, фенотипом, увеличивающим вероятность того, что у субъекта с промежуточной ВМД заболевание будет прогрессировать до поздней стадии ВМД. Маркеры, соответствующие генетическим полиморфизмам у членов популяции, можно обнаружить с помощью способов, хорошо известных в данной области техники. Указанные способы включают, например, способы специфической амплификации последовательностей на основе ПЦР, обнаружение полиморфизмов длин рестрикционных фрагментов (RFLP), обнаружение маркеров изоферментов, обнаружение аллель-специфической гибридизации (ASH), обнаружение однонуклеотидного расширения, обнаружение амплифицированных вариабельных последовательностей генома, обнаружение самоподдерживающейся репликации последовательностей, обнаружение простых повторов последовательности (SSR), обнаружение однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) или обнаружение полиморфизмов длины амплифицированных фрагментов (AFLP).

"Генотип" является генетической структурой особи (или группы особей) по одному или более генетическим локусам. Генотип определяется аллелем(ями) одного или более известных локусов особи, обычно, совокупностью аллелей, унаследованных от родителей. "Гаплотип" является генотипом особи по множеству генетических локусов в одной цепи ДНК. Как правило, генетические локусы, описываемые гаплотипом, физически и генетически сцеплены, т.е. находятся на одной и той же цепи хромосомы.

"Множество" маркеров или зондов относится к коллекции или группе маркеров или зондов, либо данным, полученным из них, используемым для достижения общей цели, например, идентификации особи с указанным фенотипом (например, подверженностью ВМД или подверженностью развитию поздней стадии ВМД). Часто данные, соответствующие маркерам или зондам, или полученные при их использовании, хранятся на электронном носителе. Хотя каждый из членов множества полезен для достижения указанной цели, отдельные маркеры, выбранные из множества, а также подмножества, включающие некоторые, но не все из маркеров, также являются эффективными для достижения указанной цели.

"Машиночитаемый носитель" является носителем информации, который может быть доступен с помощью компьютера при использовании доступного или пользовательского интерфейса. Примеры включают память (например, ПЗУ или ОЗУ, флэш-память и т.д.), оптические накопители (например, CD-ROM), магнитные накопители (например, жесткие диски, гибкие диски и т.д.), перфокарты, и многие другие носители, доступные и известные специалистам в данной области техники. Информацию можно передавать между интересующей системой и компьютером, или в или из компьютера на или с машиночитаемого носителя для хранения и доступа к хранимой информации. Эта передача может являться электрической передачей, либо может осуществляться другими доступными способами, например, с помощью ИК-связи, беспроводного соединения и т.п.

Термины "фактор D" и "фактор комплемента D" используются взаимозаменяемо и относятся к нативной последовательности и вариантным полипептидам фактора D.

Фактор D с "нативной последовательностью" является полипептидом, обладающим аминокислотной последовательностью, аналогичной полипептиду фактора D, полученному из природного источника, независимо от способа его получения. Таким образом, фактор D с нативной последовательностью можно выделить из естественных источников или получить рекомбинантным и/или синтетическим путем. В дополнение к зрелому белку фактора D, например, зрелому белку фактора D человека, термин "фактор D с нативной последовательностью", в частности, охватывает природные формы-предшественники фактора D (например, неактивный белок-предшественник, протеолитически расщепляющийся с получением активной формы), природные вариантные формы (например, формы, получаемые при альтернативном сплайсинге) и природные аллельные варианты фактора D, а также структурные конформационные варианты молекул фактора D, обладающих аминокислотной последовательностью, аналогичной полипептиду фактора D, полученному из природного источника. Полипептиды фактора D животных, не являющихся человеком, в том числе высших приматов и млекопитающих, не являющихся человеком, специфически включены в данное определение.

"Вариант фактора D" или "вариант фактора комплемента D" означает активный полипептид фактора D, как определено ниже, обладающий, по меньшей мере, приблизительно 80% идентичностью аминокислотной последовательности нативной последовательности полипептида фактора D. Обычно вариант фактора D обладает, по меньшей мере, приблизительно 80% идентичностью аминокислотной последовательности, или, по меньшей мере, приблизительно 85% идентичностью аминокислотной последовательности, или, по меньшей мере, приблизительно 90% идентичностью аминокислотной последовательности, или, по меньшей мере, приблизительно 95% идентичностью аминокислотной последовательности или, по меньшей мере, приблизительно 98% идентичностью аминокислотной последовательности, или, по меньшей мере, приблизительно 99% идентичностью аминокислотной последовательности зрелому полипептиду фактора D. Предпочтительно, наибольшая степень идентичности последовательности имеет место в пределах активного центра фактора D.

"Активный центр" фактора D определяется His-57, Asp-102 и Ser-195 (химотрипсиногенная нумерация) последовательности фактора D человека. Фактор D содержит Asp189 (химотрипсиновая нумерация) в нижней части кармана первичной специфичности и расщепляет пептидную связь Arg. Указанная каталитическая триада состоит из His-57, Asp-102 и Ser-195. Asp-102 и His57 демонстрируют атипичные конформации по сравнению с другими сериновыми протеазами (Narayana et al., J. Mol. Biol. 235 (1994), 695-708). Между Asp189 и Arg218 в нижней части кармана S1 наблюдается уникальный солевой мостик, поднимающий петлю 214-218 и образующий глубокий и узкий карман 1 (Jinget al., J. Mol. Biol. 282 (1998) 1061-1081). Мутационный анализ показал, что эта петля и несколько других остатков вокруг активного сайта являются ключевыми структурными детерминантами эстеролитической активности фактора D (Kim et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 24399-24405). На основании этих результатов предполагалось, что фактор D может подвергаться конформационному изменению при связывании C3b-связанного фактора В, что приводит к проявлению протеолитической активности (Volanakis and Narayana, Protein Sci. 5 (1996) 553-564).

Термин "ФРЭС" или "VEGF", как используется здесь, относится к 165-аминокислотному фактору роста эндотелия сосудов человека и родственным 121-, 189- и 206-аминокислотным факторам роста эндотелия сосудов человека, как описано в Leung et al. Science, 246:1306 (1989), и Houck et al. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991), а также их природным аллельным и полученным в результате процессинга формам. Термин "ФРЭС" также относится к ФРЭС видов, не являющихся человеком, например, мыши, крысы или приматов. Иногда ФРЭС из определенного вида обозначают такими терминами, как hVEGF для ФРЭС человека, mVEGF для ФРЭС мыши и т.д. Термин "ФРЭС" также используют по отношению к укороченным формам полипептида, включающим аминокислоты 8-109 или 1-109 165-аминокислотного фактора роста эндотелия сосудов человека. Упоминание таких форм ФРЭС в настоящей заявке можно определить, например, по "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" или "VEGF.sub.165". Аминокислотные положения в "укороченном" нативном ФРЭС нумеруют, как указано в нативной последовательности ФРЭС. Например, аминокислотное положение 17 (метионин) в укороченном нативном ФРЭС также является положением 17 (метионин) в нативном ФРЭС. Укороченный нативный ФРЭС обла