Комбинированная терапия антителами анти-cd20 типа i и типа ii

Комбинированная терапия антителами анти-cd20 типа i и типа ii

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к применению двух различных антител анти-CD20 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, прежде всего рака, экспрессирующего CD20.

Предпосылки создания изобретения

Белок CD20 (так называемый дифференцировочный антиген созревания В-лимфоцитов или Вр35) представляет собой гидрофобный трансмембранный белок с мол. массой приблизительно 35 кДа, локализованный в предшественниках В-клеток и в зрелых В лимфоцитах (Valentine M.A. и др., J. Biol. Chem., 264(19), 11282-11287 (1989) и Einfield D.A. и др., ЕМВО J.. 7(3), 711-717 (1988)). CD20 найден на поверхности более 90% В-клеток периферической крови или лимфоидных органов, экспрессируется на ранней стадии развития предшественников В-клеток и остается до дифференцировки плазматических клеток. CD20 присутствует в нормальных В-клетках, а также в злокачественных В-клетках. CD20 прежде всего экспрессируется в более 90% В-клеток лимфомы не-Ходжкина (НХЛ) (Anderson К.С. и др., Blood, 63(6), 1424-1433 (1984)), но не обнаружен на кроветворных стволовых клетках, про-В-клетках, нормальных плазматических клетках или на других нормальных тканях (Tedder T.F. и др., J, Immunol., 135 (2), 973- 979 (1985)).

С-концевой фрагмент (содержащий 85 аминокислотных остатков) белка CD20 локализован в цитоплазме. Длина такого участка существенно отличается от размеров цитоплазматического участка других поверхностных белков В-клеток, таких как тяжелые цепи IgM, IgD, и IgG или α-, или β-цепей антигенов гистосовместимости класса I1, которые характеризуются относительно короткими цитоплазматическими фрагментами, содержащими 3, 3, 28, 15 и 16 аминокислотных остатков, соответственно (Komaromy M. и др., NAR, 11, 6775-6785 (1983)). В С-концевом фрагменте 21 из 61 аминокислотных остатков являются кислотными и только 2 основными, т.е. указанная область обладает суммарным высоким отрицательным зарядом (The GenBank рег. №NP-690605). Принято считать, что CD20 может принимать участие в регуляции ранней стадии (стадий) процесса активации и дифференцировки В-клеток (Tedder и др., Eur. J. Immunol., 25, 16, 881-887 (1986)) и может функционировать как кальциевый канал (Tedder T.F. и др., J.Cell. Biochem., 14D, 195 (1990)).

Существуют два различных типа антител анти-CD20, которые существенно отличаются по способу связывания с CD20 и по биологической активности (Cragg M.S. и др., Blood, 103, 2738-2743 (2004) и Cragg M.S. и др., Blood, 101, 1045-1052 (2003)). Антитела типа I, ритуксимаб, активны в проявлении цитотоксичности, опосредованной комплементом, в то время как антитела типа II, тоситумомаб (B1), 11B8 и АТ80 или гуманизированные антитела В-Lyl, эффективно инициируют гибель клеток-мишеней за счет каспаза-независимого апоптоза с одновременным воздействием фосфатидилсерина.

Сводка общих свойств антител анти-CD20 типа I и типа II приводятся в Таблице 1.

Таблица 1
Свойства антител анти-CD20 типа I и типа II
Антитела анти-CD20 типа I	Антитела анти-CD20 типа II
Эпитоп CD20 типа I	Эпитоп CD20 типа II
Локализует CD20 в липидном слое	Не локализует CD20 в липидном слое
Повышенный КЗЦ (если изотип IgGl)	Пониженный КЗЦ (если изотип IgGl)
ЗАКЦ активность (если изотип IgGl)	ЗАКЦ активность (если изотип IgGl)
Полная связывающая способность	Пониженная связывающая способность
Гомотипическая агрегация	Высокая гомотипическая агрегация
Индукция апоптоза после перекрестного сшивания с рецептором	Индукция быстрой гибели клеток без перекрестного сшивания с рецептором

Изобретение относится к моноклональным антителам человека, специфичным к CD20, и к их применению для лечения заболеваний, ассоциированных с клетками, экспрессирующими CD20.

Краткое описание сущности изобретения

Изобретение включает применение антител анти-CD20 типа I для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, экспрессирующего CD20, отличающееся тем, что указанные антитела анти-CD20 типа I вводят совместно с антителами анти-CD20 типа II.

Изобретение также включает применение антител анти-CD20 типа I в качестве первых антител анти-CD20 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, экспрессирующего CD20, отличающееся тем, что

а) соотношение связывающих активностей указанных первых антител анти-CD20 и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,8 до 1,2,

б) указанные первые антитела анти-CD20 вводят совместно с антителами анти-CD20 типа II в качестве вторых антител анти-CD20,

в) соотношение связывающих активностей указанных вторых антител анти-CD20 и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC №CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6.

Изобретение также включает применение антител анти-CD20 типа I для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20, отличающееся тем, что указанные антитела анти-CD20 типа I вводят совместно с антителами анти-CD20 типа II.

Изобретение также включает применение антител анти-CD20 типа I в качестве первых антител анти-CD20 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20, отличающееся тем, что

а) соотношение связывающих активностей указанных первых антител анти-CD20 и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,8 до 1,2,

б) указанные первые антитела анти-CD20 вводят совместно с антителами анти-CD20 типа II в качестве вторых антител анти-CD20,

в) соотношение связывающих активностей указанных вторых антител анти-CD20 и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC №CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6.

Изобретение также включает антитела анти-CD20 типа I для лечения рака, экспрессирующего CD20, отличающиеся тем, что указанные антитела анти-CD20 типа I вводят совместно с антителами анти-CD20 типа II.

Изобретение также включает антитела анти-CD20 типа I для лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20, отличающиеся тем, что указанные антитела анти-CD20 типа I вводят совместно с антителами анти-CD20 типа II.

Предпочтительно рак, экспрессирующий CD20, обозначает В-клеточную лимфому не-Ходжкина (ЛНХ).

Предпочтительно указанные первые и вторые антитела анти-CD20 (типа I и типа II) являются моноклональными антителами.

Предпочтительно указанными антителами анти-CD20 типа I является ритуксимаб.

Предпочтительно указанными антителами анти-CD20 типа II являются гуманизированные антитела B-Lyl.

Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II обладают повышенной зависимой от антител клеточной цитотоксичностью (ЗАКЦ).

Предпочтительно соотношение связывающих активностей указанных антител анти-CD20 типа I и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (АТСС №CCL-86) составляет от 0,9 до 1,1,

Предпочтительно соотношение связывающих активностей указанных антител анти-CD20 типа II и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (АТСС №CCL-8б) составляет 0,35 до 0,55, более предпочтительно от 0,4 до 0,5.

В одном предпочтительном варианте изобретения указанными антителами анти-CD20 типа I является ритуксимаб, указанными антителами типа II являются гуманизированные антитела B-Lyl, а указанным раком, экспрессирующим CD20, является В-клеточная лимфома не-Ходжкина.

Изобретение также включает набор, включающий антитела анти-CD20 типа II и анти-CD20 типа I, предназначенный для комбинированного лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20

Предпочтительно набор отличается тем, что указанными антителами анти-CD20 типа I является ритуксимаб, указанными антителами типа II являются гуманизированные антитела B-Lyl, а указанным раком, экспрессирующим CD20, является В-клеточная лимфома не-Ходжкина (ЛНХ).

Подробное описание изобретения

Термин "антитела" обозначает различные формы антител, включающих, но, не ограничиваясь только ими, полноразмерные антитела, антитела человека, гуманизированные антитела и генно-инженерные антитела, такие как моноклональные антитела, химерные антитела или рекомбинантные антитела, а также фрагменты таких антител при условии сохранения их характерных свойств по изобретению.

Термины "моноклональные антитела" или "композиция моноклональных антител", используемые в описании заявки, относятся к получению молекул антител одного аминокислотного состава. Соответственно, термин "моноклональные антитела человека" относится к моноспецифичным антителам, содержащим вариабельные и константные области иммуноглобулинов зародышевой линии клеток человека. В одном варианте моноклональные антитела человека получают с использованием гибридомы, которая включает В-клетки, полученные от трансгенного животного (исключая человека), например, трансгенной мыши, в геноме которой содержится трансген тяжелой цепи человека и трансген легкой цепи человека, включенные в иммортализованные клетки.

Предпочтительно указанные первые и вторые анти-CD20 антитела (типа I и типа II) являются моноклональными антителами.

Термин "химерные антитела" обозначает моноклональные антитела, включающие вариабельную область, т.е. связывающий участок, от одного источника или вида и по меньшей мере часть константной области от другого источника или вида, обычно полученные методов рекомбинантных ДНК. Более предпочтительны химерные антитела, включающие вариабельную область мыши и константную область человека. Такие химерные антитела человека/мыши являются продуктом экспрессированных генов иммуноглобулинов, содержащих сегменты ДНК, кодирующие вариабельные области иммуноглобулина мыши и сегменты ДНК, кодирующие константные области иммуноглобулина человека. Другими формами " химерных антител" по настоящему изобретению являются такие антитела, класс или подкласс которых модифицирован или изменен по сравнению с исходными антителами. Такие "химерные" антитела обозначаются также как "переключенные по классу антитела". Способы получения химерных антител включают метод рекомбинантных ДНК и методы генной трансфекции, известные в данной области техники. См., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 81, 6851-6855 (1984), US 5202238 и US 5204244.

Термин "гуманизированные антитела" обозначает антитела, в которых каркасный участок или "участки комплементарности" (CDR) модифицированы для включения CDR иммуноглобулина другой специфичности по сравнению с исходным иммуноглобулином. В предпочтительном варианте CDR мыши прививают в каркасный участок антител человека для получения "гуманизированных антител". См., например, Riechmann L. и др., Nature, 332, 323-327 (1988) и Neuberger M.S. и др., Nature, 314, 268-270 (1985)). Более предпочтительные CDR представляют собой аминокислотные последовательности, узнающие антигены, указанные выше для химерных и бифункциональных антител.

Термин "антитела человека", используемый в описании заявки, включает антитела, содержащие вариабельную и константную области иммуноглобулина зародышевой линии клеток человека. Антитела человека известны в данной области техники (van Dijk M.A. и van de Winkel J.G., Curr. Opin. in Chemical Biology, 5, 368-374 (2001)). С использованием такой технологии получают антитела человека, специфичные в отношении множества мишеней. Примеры антител человека, описаны, например, в статье Kellermann S.A., и др., Curr. Opin. Biotechnol., 13, 593-597 (2002).

Термин "рекомбинантные антитела человека", используемый в описании заявки, обозначает все антитела человека, которые получают, экспрессируют, конструируют или выделяют рекомбинантными методами, такие как антитела, выделенные из клетки-хозяина, таких как клетки NSO или СНО, или из животного (например, мыши), которое является трансгенным для генов иммуноглобулина человека, или антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, трансфектированного в клетку-хозяина. Такие рекомбинантные антитела человека содержат константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии клеток человека в перегруппированной форме. Рекомбинантные антитела человека по изобретению подвергались in vivo соматической гипермутации. Таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител являются такими последовательностями, которые, хотя они получены из последовательностей VH и VL зародышевой линии клеток человека, не содержатся в нативном репертуаре зародышевой линии клеток человека in vivo.

Термин "специфичное связывание" или "специфично связывается", используемый в описании заявки, обозначает антитела, которые специфично связываются с антигеном CD20. Предпочтительно аффинность связывания характеризуется величиной KD 10^-8 моль./л или менее, предпочтительно 10^-9 моль/л или менее (например, 10^-10 моль/л), более предпочтительно величиной KD 10^-10 моль./л или менее (например, 10^-12 моль/л). Аффинность связывания определяют стандартным анализом связывания, таким как метод поверхностного плазменного резонанса (например, Biacore®) с использованием клеток, экспрессирующих CD20.

Термин "молекула нуклеиновой кислоты", используемый в описании заявки, обозначает молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты является одноцепочечной или двухцепочечной, предпочтительно двухцепочечной ДНК.

Термин "константные домены" не имеет прямого отношения к связыванию антител с антигеном, а относится к эффекторным функциям (ЗАКЦ, связывание комплемента и КЗЦ).

Термин "вариабельная область" (вариабельная область легкой цепи (VL), вариабельная область тяжелой цепи (VH)), используемый в описании заявки, каждый, обозначает пару легкой и тяжелой цепей, которые принимают непосредственное участие в связывании антител с антигеном. Домены вариабельной легкой цепи и тяжелой цепи человека характеризуются одинаковой общей структурой, и каждый домен включает четыре каркасных участка (FR), последовательности которых являются строго консервативными, соединенные тремя "гипервариабельными областями" (или участками комплементарности, CDR). Каркасные участки образуют конформацию β-складчатого листа, а участки CDR образуют петли, связывающие β-складчатую структуру. В каждой цепи CDR сохраняют свою трехмерную структуру благодаря каркасным участкам и вместе с CDR другой цепи образуют антиген-связывающий участок. Участки CDR3 тяжелой и легкой цепи играют главную роль в специфичности связывания антитела по изобретению и, следовательно, представляют еще одни объект изобретения.

Термины "гипервариабельная область" или "антиген-связывающий участок антитела", используемый в описании заявки, обозначают аминокислотные остатки, которые отвечают за связывание с антигеном. Гипервариабельная область включает аминокислотные остатки из "участков комплементарности" или участков "CDR". "Каркасные участки" или "FR" представляют собой такие области вариабельного домена, которые не относятся к указанным гипервариабельным участкам. Следовательно, легкая и тяжелая цепи антитела включают (в направлении от N- до С-концевого фрагмента) домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Наиболее важным фрагментом тяжелой цепи является CDR3, который вносит основной вклад в связывание с антигеном. Области CDR и FR определяют, как описано Kabat E.A. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 изд., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), и/или по их остаткам, включенным в состав "гипервариабельной петли".

Термины "CD20" и "антиген CD20" используются взаимозаменяемым образом и обозначают любые варианты, изоформы и видовые гомологи CD20 человека, который обычно экспрессируется клетками или на клетках, трансфектированных геном CD20. Связывание антител по изобретению с антигеном CD20 опосредует гибель клеток, экспрессирующих CD20 (например, опухолевых клеток), за счет инактивациии CD20. Гибель клеток, экспрессирующих CD20, может происходить по одному или более следующих механизмов: индукция апоптоза, ЗАКЦ и/или КЗЦ.

Синонимами CD20, известными в данной области техники, являются антиген CD20 В-лимфоцитов, поверхностный антиген В1 В-лимфоцитов, Leu-16, Вр35, ВМ5 и LF5.

Термин "антитела анти-CD20" по изобретению обозначает антитела, которые специфично связываются с антигеном CD20. В зависимости от связывающих свойств и биологической активности антитела анти-CD20 подразделяются на два типа: тип I и тип II (См. Cragg M.S. и др., Blood, 103, 2738-2743 (2004) и Cragg M.S. и др., Blood, 101, 1045-1052 (2003)), как указано в таблице 2.

Таблица 2

Свойства антител анти-CD20 типа I и типа II

Антитела анти-CD20 типа I	Антитела aHTH-CD20 типа II
Эпитоп CD20 типа I	Эпитоп CD20 типа II
Локализует CD20 в липидном слое	Не локализует CD20 в липидном слое
Повышенный КЗЦ (если изотип IgGl)	Пониженный КЗЦ (если изотип IgGl)
ЗАКЦ активность (если изотип IgGl)	ЗАКЦ активность (если изотип IgGl)
Полная связывающая способность	Пониженная связывающая способность
Антитела анти-CD20 типа I	Антитела анти-CD20 типа II
Гомотипическая агрегация	Высокая гомотипическая агрегация
Индукция апоптоза после перекрестного сшивания с рецептором	Индукция быстрой гибели клеток без перекрестного сшивания с рецептором

Одним из важнейших свойств антител анти-CD20 типа I и типа II является способ связывания. Таким образом, антитела анти-CD20 типа I и типа II классифицируются по соотношению связывающих активностей указанных антител и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86).

Соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 типа I и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,8 до 1,2, предпочтительно от 0,9 до 1,1. Примерами таких антител анти-CD20 типа I являются, например, ритуксимаб, 1F5 IgG2a (ECACC, гибридома. Press O.W. и др., Blood, 69/2, 584-591 (1987)), HI47 IgG3 (ECACC, гибридома), 2С6 IgGl (описанные в WO 2005/103081), 2F2 IgGl (описанные в WO 2004/035607 и WO 2005/103081) и 2Н7 IgGl (описанные в WO 2004/056312). Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа I являются моноклональными антителами, которые связываются с тем же эпитопом, что и ритуксимаб.

Соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 типа II и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,35 до 0,55, более предпочтительно от 0,4 до 0,5. Примерами таких антител анти-CD20 типа II являются, например, тоситумомаб (В1 IgG2a), гуманизированные антитела В-Lyl IgGl (химерные гуманизированные антитела IgGl, описанные в WO 2005/044859), 11 В8 IgGl (описанные в WO 2004/035607) и АТ80 IgGl. Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II являются моноклональными антителами, которые связываются с тем же эпитопом, что и гуманизированные антитела В-Lyl (описанные в WO 2005/044859).

Соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86)" определяют прямым измерением иммунофлуоресценции (измеряется средняя интенсивность флуоресценции (СИФ)) указанных антител анти-CD20, конъюгированных с Су5, и ритуксимаба, конъюгированного с Су5, на клеточном сортере FACS (фирма Becton Dickinson) и клеток Raji (ATCC, №CCL-86), как описано в Примере 2, и рассчитывают по следующей формуле:

Соотношение связывающих активностей в отношении CD20 на клетках Raji

(ATCC . №CCL-86) = С И Ф   ( С у 5 / а н т и т е л а   а н т и − C D 20 ) С И Ф   ( С У 5 / р и т у к с и м а б ) × с о д е р ж а н и е   С у 5  в конъюгате ( С у 5 -ритуксимаб) с о д е р ж а н и е  Су5 в конъюгате ( С у 5   / антитела анти-CD20)

СИФ обозначает среднюю интенсивность флуоресценции. Термин "содержание Су5 в конъюгате" обозначает число молекул метки Су5-в расчете на молекулу антитела.

Обычно соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 типа I и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,8 до 1,2, предпочтительно от 0,9 до 1,1.

Обычно соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 типа II и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,35 до 0,55, более предпочтительно от 0,4 до 0,5.

В предпочтительном варианте указанные антитела анти-CD20 типа II, предпочтительно гуманизированные антитела В-Lyl, обладают повышенной зависимой от антител клеточной цитотоксичностью (ЗАКЦ).

Термин "антитела, обладающие повышенной зависимой от антител клеточной цитотоксичностью (ЗАКЦ)" обозначает антитела, описанные выше, обладающие повышенной ЗАКЦ, которую определяют способом, известным специалисту в данной области. Например, известными способом анализа ЗАКЦ является следующий:

1) анализ проводят с использованием клеток-мишеней, которые экспрессируют антиген, узнаваемый антиген-связывающей областью антитела,

2) анализ проводят с использованием в качестве эффекторных клеток одноядерных клеток периферической крови человека (ОКПК), выделенных из крови произвольно выбранного здорового донора,

3) анализ проводят в соответствии со следующим протоколом:

3.1) ОКПК выделяют с использованием стандартного центрифугирования в градиенте плотности и суспендируют с плотностью 5×10⁶ клеток в культуральной среде RPMI,

3.2) клетки-мишени выращивают стандартными методами культуры тканей, собирают на экспоненциальной фазе роста с выживаемостью более 90%, промывают культуральной средой RPMI, вводят метку в виде 100 мкКи Cl^-, дважды промывают культуральной средой и ресуспендируют в культуральной среде с плотностью 10' клеток/мл,

3.3) 100 мкл конечной суспензии клеток-мишеней переносят в лунки 96-луночного планшета для микротитрования,

3.4) раствор антител серийно разбавляют культуральной средой (от 4000 нг/мл до 0,04 нг/мл) и полученные растворы добавляют (по 50 мкл) в лунки 96-луночного планшета, содержащие клетки-мишени, анализ проводят при различных концентрациях антител в указанном выше интервале при тройном повторе,

3.5) для контролей с максимальным высвобождением (MB) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащем меченые клетки-мишени, вместо раствора антитела (как указано в п.3.4) добавляют по 50 мкл 2% водного раствора неионного детергента (VN, Nonidet, фирма Sigma, St. Louis),

3.6) для контролей с произвольным высвобождением (ПВ) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащем меченые клетки-мишени, вместо раствора антитела (как указано в п.3.4) добавляют по 50 мкл культуральной среды RPMI,

3.7) затем 96-луночный планшет центрифугируют при 50 g в течение 1 мин и инкубируют в течение 1 ч при 4°С,

3.8) в каждую лунку добавляют по 50 мкл суспензии ОКПК (см. п.3.1, выше) до соотношения клетки эффекторы/клетки-мишени 25:1 и планшеты инкубируют в инкубаторе в атмосфере 5% СО₂ при 37°С в течение 4 ч,

3.9) из каждой лунки извлекают супернатант и измеряют экспериментальную радиоактивность (ЭР) с использованием γ-счетчика,

3.10) для каждой концентрации антитела рассчитывают процент специфичного лизиса по формуле (ЭР-МВ)/(МВ-СВ)×100, где ЭР обозначает среднее значение измеренной радиоактивности (см. п.3.9) для данной концентрации антитела, MB обозначает среднюю радиоактивность (см. п.3.9) для MB контролей (см. п.3.5) в СВ обозначает среднюю радиоактивность (см. п.3.9) для СВ контролей (см. п.3.6),

4) "повышенный уровень ЗАКЦ" определяют по повышению максимума (%) специфичного лизиса, наблюдаемого в интервале концентраций антител, анализируемых выше, и/или по понижению концентрации антител, необходимой для снижения вдвое максимума (%) специфичного лизиса, наблюдаемого в интервале концентраций антител, анализируемых выше. Превышение ЗАКЦ по сравнению с цитотоксичностью (ЗАКЦ), измеренной в указанном выше анализе, опосредуется указанными антителами, продуцируемыми теми же клетками-хозяина, с использованием той же стандартной методики методов очистки, получения и хранения, известной специалисту в данной области, но которые не продуцируются клетками-хозяина, сконструированными для гиперэкспрессии GnTIII.

Указанную "повышенную ЗАКЦ" получают гликоинженерией указанных антител, которая обозначает усиление указанных природных опосредованных клетками эффекторных функций моноклональных антител за счет инженерии их олигосахаридного компонента, как описано в статье Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и US 6602684.

Термин "комплемент-зависимая цитотоксичность (КЗЦ)" обозначает лизис клеток-мишеней опухоли человека антителами по изобретению в присутствии комплемента. Предпочтительно КЗЦ измеряют при обработке клеток, экспрессирующих CD20, антителами анти-CD20 по изобретению в присутствии комплемента. КЗЦ наблюдается в том случае, если при концентрации 100 нМ антитела индуцируют лизис 20% или более опухолевых клеток через 4 ч. Предпочтительно анализ проводят с использованием опухолевых клеток, меченых ⁵¹Cr или Eu, и измеряют высвобождаемый ⁵¹Cr или Eu. Контроль включает инкубацию опухолевых клеток-мишеней в присутствии комплемента, но в отсутствие антител.

Обычно антитела анти-CD20 типа I и типа II изотипа IgGl обладают характерными КЗЦ свойствами. Антитела анти-CD20 типа I (изотипа IgGl) обладают повышенной КЗЦ активностью, а антитела анти-CD20 типа II (изотипа IgGl) обладают пониженной КЗЦ активностью, по сравнению друг с другом. Предпочтительно оба типа антител (тип I и тип II) являются изотипами IgGl.

Антитела "ритуксимаб" представляют собой генетически модифицированные химерные моноклональные антитела γ1 человека, содержащие константный домен мыши, специфичные в отношении антигена CD20 человека. Указанные химерные антитела содержат константные домены γ1 человека и обозначаются "С2 В8" (US 5736137, Andersen, и др., зарегистрированном 17 апреля 1998 г. Фармацевтическая корпорация IDEC). Ритуксимаб предназначен для лечения пациентов с рецидивирующей или повторной вялотекущей или фолликулярной, CD20-позитивной В-клеточной лимфомы не-Ходжкина. При исследовании механизма действия in vitro установлено, что ритуксимаб проявляет комплемент-зависимую цитоксичность (КЗЦ) (Reiff M.E. и др., Blood, 83(2), 435-445 (1994)). Кроме того, препарат проявляет высокую активность в анализах, где измеряется зависимая от антител клеточная цитотоксичность (ЗАКЦ).

Термин "гуманизированные антитела В-Lyl" обозначает гуманизированные антитела В-Lyl, описанные в WO 2005/044859 и WO 2007/031875, которые получают из мышиных моноклональных антител анти-CD20 В-Lyl (вариабельная область тяжелой цепи (VH): SEQ ID NO: 1, вариабельная область легкой цепи (VL): SEQ ID NO: 2, см. Poppema S. и Visser L., Biotest. Bulletin, 3, 131-139 (1987)) за счет химеризации с константным доменом IgGl человека и последующей гуманизации (см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Указанные "гуманизированные антитела В-Lyl" подробно описаны в WO 2005/044859 и WO 2007/031875.

Предпочтительно "гуманизированные антитела В-Lyl" содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), выбранную из группы, включающей SEQ ID No.3 - SEQ ID No.20 (B-HH2 - B-HH9 и B-HL8 - B-HL17, см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Более предпочтительны Seq. ID No. 3, 4, 7, 9, 11, 13 и 15 (B-HH2, ВНН-3, В-НН6, В-НН8, B-HL8, B-HL11 и B-HL13, описанные в WO 2005/044859). Предпочтительно "гуманизированные антитела В-Lyl" содержат вариабельную область легкой цепи (VL) SEQ ID No. 20 (В-KV1, см. WO 2005/044859). Кроме того, гуманизированные антитела В-Lyl предпочтительно являются антителами IgGl. Предпочтительно такие гуманизированные антитела В-Lyl гликозилируют в Fc области по методикам, описанным в WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, Umana P. и др.. Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и WO 99/154342. Такие гликозилированные гуманизированные антитела В-Lyl обладают измененным характером гликозилирования в Fc области, предпочтительно они характеризуются пониженным содержанием остатков фукозы. Предпочтительно в этих антителах не фукозилированы по меньшей мере 40% или более (в одном варианте от 40% до 60%, в другом варианте по меньшей мере 50%, и в еще одном варианте по меньшей мере 70% или более) олигосахаридов Fc области. Кроме того, олигосахариды Fc области предпочтительно являются двухсекционными.

Изобретение включает применение антител анти-CD20 типа I для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения, рака, экспрессирующего CD20, отличающееся тем, что указанные антитела анти-CD20 типа I вводят совместно с антителами анти-CD20 типа II.

Изобретение включает применение антител анти-CD20 типа I для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20, отличающееся тем, что указанные антитела анти-CD20 типа I вводят совместно с антителами анти-CD20 типа II.

Предпочтительно применение характеризуется тем, что указанными антителами анти-CD20 типа I является ритуксимаб, указанными антителами анти-CD20 типа II являются гуманизированные антитела В-Lyl, а указанным раком, экспрессирующим указанные CD20 является В-клеточная лимфома не-Ходжкина (ЛНХ).

Олигосахаридный компонент может оказывать существенное влияние на свойства, обеспечивающие эффективность действия терапевтического гликопротеина, такие как стабильность, устойчивость к действию протеазы, взаимодействие с иммунной системой, фармакокинетика и специфичная биологическая активность. Такие свойства могут зависеть не только от присутствия или отсутствия, но также и от конкретных структур олигосахаридов. Можно указать на некоторое соответствие между структурой олигосахарида и функцией гликопротеина. Например, некоторые структуры олигосахарида опосредуют быстрый клиренс гликопротеина из кровотока за счет взаимодействия с некоторыми белками, связывающимися с конкретными углеводами, тогда как другие углеводы могут связываться с антителами и запускать нежелательные иммунные реакции (Jenkins N. и др., Nature Biotechnol., 14, 975-981 (1996)).

Предпочтительными клетками для продуцирования терапевтических гликопротеинов являются клетки млекопитающих благодаря их способности гликозилировать белки в форме, наиболее совместимой с организмом человека (Gumming D.A. и др., Glycobiology, 1, 115-130 (1991), Jenkins N. и др., Nature Biotechnol., 14, 975-981 (1996)). Бактерии очень редко гликозилируют белки, а другие подобные типы продуцентов, такие как дрожжи, нитевидные грибы, клетки насекомых и растений, обеспечивают такой профиль гликозилирования, который ассоциируется с быстрым клиренсом из кровотока, нежелательными иммунными взаимодействиями и некоторыми процессами, снижающими биологическую активность. Последние двадцать лет в качестве клеток млекопитающих наиболее часто используют клетки яичника китайского хомячка (СНО). Кроме того, для придания пригодного профиля гликозилирования указанные клетки позволяют провести последовательное размножение генетически стабильных, высокопродуктивных линий клональных клеток. Такие клетки можно культивировать до высокой плотности в простых биореакторах с использованием бессывороточной среды, что позволяет разрабатывать безопасные и воспроизводимые биотехнологии. Другие часто используемые клетки животных включают клетки почек детеныша хомячка (ВНК.), клетки NSO- и SР2/0-мышинной миеломы. Кроме того, в последнее время исследовалось продуцирование с использованием трансгенных животных (Jenkins N. и др. Nature Biotechnol., 14, 975-981 (1996)).

Все антитела содержат углеводные структуры в консервативных позициях константных областей тяжелой цепи, причем каждый изотип обладает собственным профилем N-углеводных структур, которые по разному воздействует на сборку, секрецию или функциональную активность белка (Wright А. и Morrison S.L, Trends Biotech., 15, 26-32 (1997)). Структуры N-углеводных цепей существенно варьируют в зависимости от степени процессинга и могут включать олигосахариды с высоким содержанием маннозы, полиразветвленные, а также двухантенные комплексные олигосахариды (Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotech. 15, 26-32 (1997)). Обычно имеет место гетерогенный процессинг каркасных олигосахаридных структур, присоединенных к конкретному сайту гликозилирования, и даже моноклональные антитела присутствуют в виде полигликозилированных форм. Установлено также, что главные различия в гликозилировании антител наблюдаются между клеточными линиями и даже незначительные различия проявляются для данной клеточной линии в различных условиях культивирования (Lifely M.R. и др., Glycobiology, 5(8), 813-822 (1995)).

Одним из способов существенного повышения активности и возможно исключения значительного нежелательного побочного действия антител в процессе получения является усиление природных, клеточно-опосредованных эффекторных функций моноклональных антител за счет формирования их олигосахаридного компонента, как описано в статье Umana P. и др.. Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и US 6602684. Антитела типа IgGl, наиболее часто используемые в иммунотерапии рака, являются гликопротеинами, которые содержат консервативный сайт N-гликозилирования по Asn297 в каждом домене СН2. Два сложных двухантенных олигосахарида, присоединенных к Asn297, располагаются между СН2 доменами, формируя плотные контакты с полипептидной цепью, и их присутствие является существенным для антител при осуществлении эффекторных функций, таких как зависимая от антител клеточная цитотоксичность (ЗАКЦ) (Lifely M.R. и др., Glycobiology, 5, 813-822 (1995); Jefferis R. и др., Immunol. Rev., 163, 59-76 (1998), Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotechnol., 15, 26-32 (1997)).

Ранее установлено, что гиперэкспрессия в клетках яичника китайского хомячка (СНО) β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I11 (GnTII17y), гликозилтрансферазы, катализирующей образование бисекционных олигосахаридов, существенно повышает активность ЗАКЦ in vitro анти-необластомных химерных моноклональных антител (chCE7), продуцируемых модифицированным клетками СНО (см. статьи Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17. 176-180 (1999) и WO 99/154342, включенные в описание заявки в качестве ссылок в полном объеме). Антитела chCE7 принадлежат к большому классу неконъюгированных моноклональных антител, которые обладают высокой аффинностью и специфичностью в отношении опухоли, но малоэффективны для клинического применения при продуцировании в стандартных производственных клеточных линиях, не содержащих фермента GnTIII (Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999)). В указанной работе впервые установлено, что значительное увеличение ЗАКЦ можно получить благодаря конструированию клеток, продуцирующих антитела и экспрессирующих GnTIII, что приводит к повышению доли (Fc)-ассоциированных, бисекционных олигосахаридов, включая бисекционные, нефукозилированные олигосахариды, на уровне, превышающем уровень, наблюдаемый в природных антителах.

Термин "экспрессия антигена CD20" обозначает высокий уровень экспрессии в клетке антигена CD20, предпочтительно на поверхности Т- или В-клеток, более предпочтительно В-клеток, полученных от опухоли или рака, соответственно, предпочтительно несолидной опухоли. Пациентов, страдающих от "рака, экспрессирующего CD20", определяют стандартными методами анализа. Например, экспрессию антигена CD20 измеряют иммуногистохимическим детектированием (ИГХ), АФАК (FACS) или детектированием соответствующей мРНК методом ПЦР.

Термин "рак, экспрессирующий CD20", используемый в описании заявки, предпочтительно обозначает лимфомы (предпочтительно В-клеточную лимфому не-Ходжкина (ЛНХ)) и лимфолейкозы. Такие лимфомы и лимфолейкозы включают, например: а) фолликулярные лимфомы; б) мелкоклеточную лимфому с нерасщепленным ядром/лимфому Беркитта (включая эндемическую лимфому Беркитта, спорадическую лимфому Беркитта и лимфому не-Беркитта); в) лимфомы маргинальной зоны (включая В-клеточную лимфому экстранодальной маргинальной зоны (ассоциированная со слизистой и лимфоидной тканью лимфома, MALT), В-клеточную лимфому нодальной маргинальной зоны и лимфому селезеночной маргинальной зоны); г) лимфому мантийных клеток (ЛМК); д) крупноклеточную лимфому (включая В-клеточную диффузную крупноклеточную лимфому (ДККЛ), диффузную клеточную лимфому смешанного типа, иммунобластическую лимфому, первичную медиастинальную В-клеточную лимфому, В-клеточную лимфангиому легких); е) лейкоз ворсистых клеток; ж) лимфолейкоз, макроглобулинемию Вальденстрема; з) острый лимфолейкоз (ОЛЛ), хронический лимфолейкоз (ХЛЛ)/слабый лимфолейкоз (СЛЛ), В-клеточный пролимфолейкоз; и) плазмоцитому, миеломную болезнь, множественную миелому, плазмацитому; к) болезнь Ходжкина.

Предпочтительно рак, экспрессирующий CD20, представляет собой В-клеточные лимфомы не-Ходжкина (НХЛ). Рак, экспрессирующий CD20, прежде всего представляет собой лимфому мантийных клеток (ЛМК), острый лимфолейкоз (ОЛЛ), хронический лимфолейкоз (ХЛЛ), В-клеточную диффузную крупноклеточную лимфому (ДККЛ), ли