Антитела против человеческого il33r и их применение

Антитела против человеческого il33r и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение относится к антителам против человеческого IL33R (IL33R-антитело), способам их получения, фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела, и их применению.

Уровень техники

IL33 человека представляет собой интерлейкин-1-подобный цитокин семейства IL-1, который передает сигнал через IL-1-рецептор-связанный IL33-рецептор (синонимы названия рецептора: IL1RL1, T1/ST2) и индуцирует цитокины, связанные с Т-хелперами типа 2. Синонимами IL33 (рег. № в Swiss-Prot O95760) являются член 11 семейства интерлейкина-1 (IL-1F11) и ядерный фактор из эндотелиальных венул (NF-HEV). NF-HEV описан в Baekkevold, E.S., et al., Am. J. Pathol. 163 (2003) 69-79. IL33 описан в Schmitz, J., et al., Immunity 23 (2005) 479-490.

Человеческий рецептор IL33, IL33R (синоним для ILRL1; рег. № в SwissProt Q01638, другими названиями являются ST2, T1/ST2, Fit-1 и DER4), индуцируется при стимуляции роста фибробластов, а также может индуцироваться при антигенной стимуляции в Th2-клетках. В соответствии с изобретением IL33R и ST2 обозначают человеческий IL33R. Tominaga, S., et al., (FEBS Lett. 258 (1989) 301-304; Biochim. Biophys. Acta. 1171 (1992) 215-218) и Yanagisawa, K., (FEBS Lett. 318 (1993) 83-87) идентифицировали человеческий ST2 (секретируемая форма), ST2L (трансмембранная рецепторная форма) и ST2V (вариант Glu-78). Человеческий ST2 экспрессируется только в стимулированных к росту клетках Balb/c-3Т3 и является членом семейства генов первичного ответа, индуцируемого факторами роста. ST2 кодирует белок, похожий последовательностью на внеклеточную часть человеческого рецептора интерлейкина 1 типа 1 и типа 2. Исследования на мышах с нокаутом IL33R позволили предположить, что IL33R участвует в ранних событиях ТН2-ответа (Kropf, P., et al., Infect. Immunity 70 (2002) 5512-5520; Hoshino, K., et al., J. Exp. Med. 190 (1999) 1541-1548; Senn, et al., Eur. J. Immunol. 30 (2000) 1929-1938; Townsend, M.J., et al., J. Exp. Med. 191 (2000) 1069-1076). ST2 считается маркером, активатором и регулятором ТН2-иммунитета (Kumar, R.K., et al., Clin. Exp. Allergy 32 (2002) 1394-1396).

Анти-IL33R-антитела и их роль в иммунных функциях были описаны в ряде публикаций. Противочеловеческое ST2-антитело Mab523 и поликлональное антитело AF523 коммерчески доступны от R&D Systems (http://www.rndsystems.com). Противочеловеческое ST2-антитело HB12 коммерчески доступно от antibodies-online GmbH, Германия, и от MBL Int. Corp. (www.mblintl.com). Анти-IL33R-антитела приводят к снижению иммунного ответа ТН2-типа. Антитело ингибирует эозинофильную инфильтрацию, продукцию IL-5 и продукцию IgE. Оценка роли ST2 на животных моделях астмы привела к повышенной экспрессии мышиного IL33R на CD4⁺-T-клетках, что указывает на роль IL33R в аллергических или астматических ответах (Lohning, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 6930-6935 и Xu, D., et al., J. Exp. Med. 187 (1998) 787-794; Coyle, A.J., et al., J. Exp. Med. 190 (1999) 895-902). Meisel, С., et al., J. Immunol. 166 (2001) 3143-3150 исследовали регуляцию и функцию Т1/ST2-экспрессии на CD4⁺-T-клетках и индукцию продукции цитокинов 2 типа при перекрестном сшивании T1/ST2. Lohning, M., et al. создали противомышиное ST2-антитело у крыс. Предварительное введение 20 мкг (приблизительно 0,8 мг/кг) такого антитела за 1 час до провокации аллергеном сократило число эозинофилов в дыхательных путях мышей на 70%. Kumar, S., et al., (Biochem. Biophys. Res. Comm. 235 (1997) 474-478 и J. Biol. Chem. 270 (1995) 27905-27913) описывают экспрессию белка ST2, выявляемого при иммунопреципитации с использованием кроличьего поликлонального антитела, созданного против очищенного растворимого ST2-рецептора, экспрессируемого у дрозофил. Исследования с мышами BALB/c показали, что введение анти-IL33-антитела индуцировало более высокий ответ TH1-типа. Система ELISA для количественной оценки человеческого ST2-белка в сыворотках крови пациентов была описана Kuroiwa, K., et al., Hybridoma 19 (2000) 151-159. Анти-IL33R-антитела также уменьшают эффекты, связанные с инфекциями RSV (Walzl, et al., J. Exp. Med. 193 (2001) 785-792). Анти-IL33R-антитела также были исследованы на животной модели артрита (Leung, В.Р., et al., J. Immunol. 173 (2004) 145-150; Walzl, et al., J. Exp. Med. 193 (2001) 785-792). Smithgall, M.D., et al., Int. Immunol. 20 (2008) 1019-1030 исследовали уровни интерферона-γ в NK-клетках в присутствии анти-huST2-антитела. IL33R и/или антитела против IL33R упомянуты в WO 2005/079844, US 7087396, WO 2001/021641, WO 2002/038794, WO 2003/094856. Oboki, K., et al., Allergology Int. 59 (2010) 143-160 рассматривают роль IL-33 и IL-33-рецепторов в защите хозяина и развитии заболеваний и влияние анти-ST2-антитела, растворимого ST2 и анти-IL-33-антитела на воспаление дыхательных путей мыши.

Сущность изобретения

Изобретение включает антитело, связывающееся с IL33R, характеризующееся тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-область из SEQ ID №1, CDR2-область из SEQ ID №2 и CDR1-область из SEQ ID №3, и что вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-область из SEQ ID №4, CDR2-область из SEQ ID №5 и CDR1-область из SEQ ID №6. Предпочтительно антитело характеризуется тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит SEQ ID №7. Предпочтительно антитело характеризуется тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит SEQ ID №7, а вариабельный домен легкой цепи содержит SEQ ID №8. Предпочтительно антитело связывается с IL33R и характеризуется тем, что указанные выше аминокислотные последовательности и фрагменты аминокислотных последовательностей имеют человеческий изотип IgG₁, модифицированный в шарнирной области в аминокислотной позиции 216-240, предпочтительно в аминокислотной позиции 220-240, между C_H1 и C_H2 и/или во второй междоменной области в аминокислотной позиции 327-331 между C_H2 и C_H3. Предпочтительно антитело содержит мутации L234A (аланин вместо лейцина в аминокислотной позиции 234) и L235A. Предпочтительная константная область тяжелой цепи, включающая мутации L234A и L235A, показана в SEQ ID №9. Предпочтительно антитело связывается с IL33R и характеризуется тем, что указанные выше аминокислотные последовательности и фрагменты аминокислотных последовательностей имеют человеческий изотип IgG₄, модифицированный в шарнирной области в аминокислотной позиции 216-240, предпочтительно в аминокислотной позиции 220-240, между C_H1 и C_H2 и/или во второй междоменной области в аминокислотной позиции 327-331 между C_H2 и C_H3. Предпочтительно антитело содержит мутации L235E (глутаминовая кислота вместо лейцина в аминокислотной позиции 235) и S228P (пролин вместо серина в аминокислотной позиции 228).

Антитело ra170 (MKA ra170) представляет собой предпочтительное воплощение изобретения. Другое воплощение изобретения представляет собой химерный, гуманизированный или лишенный T-клеточного эпитопа вариант антитела ra170.

Предпочтительные варианты гуманизированного антитела ra170 характеризуются тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-область из SEQ ID №24, CDR2-область из SEQ ID №23 и CDR1-область из SEQ ID №22, и что вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-область из SEQ ID №33, CDR2-область из SEQ ID №32 и CDR1-область из SEQ ID №31, или характеризуются тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-область из SEQ ID №28, CDR2-область из SEQ ID №27 и CDR1-область из SEQ ID №26, и что вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-область из SEQ ID №33, CDR2-область из SEQ ID №32 и CDR1-область из SEQ ID №31. Предпочтительно гуманизированное антитело характеризуется тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит SEQ ID №21 или 25. Предпочтительно гуманизированное антитело характеризуется тем, что вариабельный домен легкой цепи содержит SEQ ID №30.

Антитело специфически связывается с IL33R с аффинностью 10^-10 М или ниже.

Данное изобретение относится также к антителу, которое связывается с IL33R и характеризуется связыванием с тем же эпитопом IL33R, с которым связывается моноклональное антитело ra170. Антитело связывается с IL33R с аффинностью по меньшей мере от 10^-8 М^-1 до 10^-12 М^-1, предпочтительно имеет человеческий изотип IgG₁, модифицированный в шарнирной области в аминокислотной позиции 216-240, предпочтительно в аминокислотной позиции 220-240, между C_H1 и C_H2 и/или во второй междоменной области в аминокислотной позиции 327-331 между C_H2 и C_H3. Предпочтительно антитело имеет человеческий изотип IgG₁, включающий мутации L234A и L235A или человеческий изотип IgG₄, включающий мутации L235E и S228P.

Предпочтительно антитело представляет собой гуманизированное или человеческое антитело. Предпочтительно антитело в соответствии с изобретением ингибирует связывание IL33 с IL33R со значением IC₅₀ 0,32 нМ для человеческого IL33/IL33R и 0,13 нМ для IL33/IL33R макаки.

Антитела в соответствии с изобретением предпочтительно демонстрируют величины IC₅₀ 5 нМ или ниже в анализе эозинофилов, анализе тучных клеток, Th2-анализе, анализе базофилов (IL-5). Такие антитела особенно полезны при лечении ревматоидного артрита, астмы или язвенного колита.

Другое воплощение данного изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело в соответствии с изобретением. Предпочтительно фармацевтическая композиция содержит антитело, которое характеризуется связыванием с тем же эпитопом IL33R, с которым связывается моноклональное антитело ra170. Предпочтительно антитело фармацевтической композиции связывается с IL33R с аффинностью по меньшей мере от 10^-8 М^-1 до 10^-12 М^-1, предпочтительно имеет человеческий изотип IgG₁, модифицированный в шарнирной области в аминокислотной позиции 216-240, предпочтительно в аминокислотной позиции 220-240, между C_H1 и C_H2 и/или во второй междоменной области в аминокислотной позиции 327-331 между C_H2 и C_H3. Предпочтительно антитело имеет человеческий изотип IgG₁, включающий мутации L234A (аланин вместо лейцина в аминокислотной позиции 234) и L235A, или человеческий изотип IgG₄, включающий мутации L235E и S228P.

Другим воплощением данного изобретения является применение антитела в соответствии с изобретением для изготовления фармацевтической композиции. Предпочтительно фармацевтическая композиция содержит антитело, которое характеризуется связыванием с тем же эпитопом IL33R, с которым связывается моноклональное антитело ra170. Предпочтительно антитело фармацевтической композиции связывается с IL33R с аффинностью по меньшей мере от 10^-8 М^-1 до 10^-12 М^-1, предпочтительно имеет человеческий изотип IgG₁, модифицированный в шарнирной области в аминокислотной позиции 216-240, предпочтительно в аминокислотной позиции 220-240, между C_H1 и C_H2 и/или во второй междоменной области в аминокислотной позиции 327-331 между C_H2 и C_H3. Предпочтительно антитело имеет человеческий изотип IgG₁, включающий мутации L234A (аланин вместо лейцина в аминокислотной позиции 234) и L235A, или человеческий изотип IgG₄, включающий мутации L235E и S228P.

Другим воплощением данного изобретения является применение антитела в соответствии с изобретением для лечения язвенного колита или астмы. фармацевтической композиции. Другим воплощением изобретения является способ изготовления фармацевтической композиции, содержащей антитело в соответствии с изобретением. Предпочтительно фармацевтическая композиция содержит антитело, которое характеризуется связыванием с тем же эпитопом IL33R, с которым связывается моноклональное антитело ra170. Предпочтительно антитело фармацевтической композиции связывается с IL33R с аффинностью по меньшей мере от 10^-8 М^-1 до 10^-12 М^-1, предпочтительно имеет человеческий изотип IgG₁, модифицированный в шарнирной области в аминокислотной позиции 216-240, предпочтительно в аминокислотной позиции 220-240, между C_H1 и C_H2 и/или во второй междоменной области в аминокислотной позиции 327-331 между C_H2 и C_H3. Предпочтительно антитело имеет человеческий изотип IgG₁, включающий мутации L234A (аланин вместо лейцина в аминокислотной позиции 234) и L235A, или человеческий изотип IgG₄, включающий мутации L235E и S228P.

Другим воплощением данного изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, связывающегося с IL33R, которое характеризуется тем, что содержит CDR3-область тяжелой цепи из SEQ ID №1 и предпочтительно мутации L234A и L235A в константном домене тяжелой цепи IgG₁. Предпочтительно антитело содержит в дополнение CDR2-область тяжелой цепи из SEQ ID №2 и CDR1-область из SEQ ID №3. Другим воплощением данного изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, связывающегося с IL33R, которое характеризуется тем, что содержит CDR3-область легкой цепи из SEQ ID №4 и предпочтительно мутации L234A и L235A в константном домене тяжелой цепи IgG₁. Предпочтительно антитело содержит в дополнение CDR2-область легкой цепи из SEQ ID №5 и CDR1-область из SEQ ID №6. Другим воплощением данного изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая антитело в соответствии с изобретением, которое характеризуется тем, что содержит вариабельный домен тяжелой цепи из SEQ ID №7 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID №8, и предпочтительно мутации L234A и L235A в константном домене тяжелой цепи IgG₁ человека или мутации L235E и S228P в константном домене тяжелой цепи IgG₄ человека.

Другим воплощением данного изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, связывающегося с IL33R, которое характеризуется тем, что содержит CDR3-область тяжелой цепи из SEQ ID №24 и предпочтительно мутации L234A и L235A в константном домене тяжелой цепи IgG₁. Предпочтительно антитело содержит в дополнение CDR2-область тяжелой цепи из SEQ ID №23 и CDR1-область из SEQ ID №22. Другим воплощением данного изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, связывающегося с IL33R, которое характеризуется тем, что содержит CDR3-область легкой цепи из SEQ ID №33 и предпочтительно мутации L234A и L235A в константном домене тяжелой цепи IgG₁. Предпочтительно антитело содержит в дополнение CDR2-область легкой цепи из SEQ ID №2 и CDR1-область из SEQ ID №31. Другим воплощением данного изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая антитело в соответствии с изобретением, которое характеризуется тем, что содержит вариабельный домен тяжелой цепи из SEQ ID №21 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID №30, и предпочтительно мутации L234A и L235A в константном домене тяжелой цепи IgG₁ человека или мутации L235E и S228P в константном домене тяжелой цепи IgG₄ человека.

Другим воплощением данного изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, связывающегося с IL33R, которое характеризуется тем, что содержит CDR3-область тяжелой цепи из SEQ ID №28 и предпочтительно мутации L234A и L235A в константном домене тяжелой цепи IgG₁. Предпочтительно антитело содержит в дополнение CDR2-область тяжелой цепи из SEQ ID №27 и CDR1-область из SEQ ID №26. Другим воплощением данного изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, связывающегося с IL33R, которое характеризуется тем, что содержит CDR3-область легкой цепи из SEQ ID №33 и предпочтительно мутации L234A и L235A в константном домене тяжелой цепи IgG₁. Предпочтительно антитело содержит в дополнение легкой цепи CDR2-область из SEQ ID №2 и CDR1-область из SEQ ID №31. Другим воплощением данного изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая антитело в соответствии с изобретением, которое характеризуется тем, что содержит вариабельный домен тяжелой цепи из SEQ ID №25 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID №30, и предпочтительно мутации L234A и L235A в константном домене тяжелой цепи IgG₁ человека или мутации L235E и S228P в константном домене тяжелой цепи IgG₄ человека.

Антитело в соответствии с изобретением предпочтительно характеризуется тем, что константные цепи имеют человеческое происхождение. Такие константные цепи хорошо известны в данной области и описываются, например, Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), и Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218). Например, используемая человеческая константная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID №9 (IgG₁ человека с мутациями L234A и L235A) или SEQ ID №29 (IgG₄ человека с мутациями L235E и S228P). Например, используемая человеческая константная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность константной области легкой каппа-цепи из SEQ ID №12 или 34. Кроме того, предпочтительно антитело имеет мышиное происхождение и включает последовательность рамки вариабельной области мышиного антитела в соответствии с Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991); и Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218).

Антитело в соответствии с изобретением особенно характеризуется ингибированием связывания IL33 с IL33R и, следовательно, ингибированием передачи сигнала через сигнальный комплекс IL-33R/IL-1RacP.

Антитело в соответствии с изобретением предпочтительно имеет человеческий изотип IgG₁. Предпочтительные константные области тяжелой цепи γ1 показаны в SEQ ID №10 или 29 и SEQ ID №11 без мутаций L234A и L235A. Предпочтительная константная область легкой κ-цепи показана в SEQ ID №12 или 34.

Антитело в соответствии с изобретением предпочтительно характеризуется тем, что не связывается с человеческим фактором комплемента C1q и, следовательно, не имеет CDC-эффекторной функции.

Антитело в соответствии с изобретением предпочтительно имеет человеческий изотип IgG₁, модифицированный в шарнирной области в аминокислотной позиции 216-240, предпочтительно в аминокислотной позиции 220-240, между C_H1 и C_H2 и/или во второй междоменной области в аминокислотной позиции 327-331 между C_H2 и C_H3. Антитело в соответствии с изобретением предпочтительно характеризуется тем, что имеет человеческий изотип IgG₁, включающий по меньшей мере одну мутацию из L234 (лейцин в аминокислотной позиции 234), L235, D270, N297, Е318, K320, K322, Р331 и/или Р329 (нумерация в соответствии с индексом ЕС). Предпочтительно антитело имеет человеческий изотип IgG₁, включающий мутации L234A (аланин вместо лейцина в аминокислотной позиции 234) и L235A, или человеческий изотип IgG₄, включающий мутации L235E и S228P.

Данное изобретение также относится к экспрессионным векторам, содержащим нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением, способным экспрессировать указанную нуклеиновую кислоту в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине, а также к клеткам-хозяевам, содержащим такие векторы для рекомбинантной продукции такого антитела. Кроме того, изобретение включает прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, содержащую вектор в соответствии с изобретением. Кроме того, изобретение включает способ получения рекомбинантного человеческого или гуманизированного антитела в соответствии с изобретением, который характеризуется экспрессией нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине и выделением указанного антитела из указанной клетки или супернатанта клеточной культуры. Кроме того, изобретение включает антитело, получаемое с помощью такого рекомбинантного способа.

Антитела в соответствии с изобретением демонстрируют преимущества для пациентов, нуждающихся в терапии, нацеленной на IL33R. Антитела в соответствии с изобретением имеют новые и изобретательные свойства, которые особенно полезны для пациента, страдающего от таких иммунологических заболеваний, особенно страдающего от ревматоидного артрита, неспецифического язвенного колита или астмы. Антитела в соответствии с изобретением не вызывают чувствительность к стафилококковой и энтеральной бактериальным инфекциям у пациента, получающего лечение. Кроме того, изобретение относится к способу лечения пациента, страдающего от ревматоидного артрита, неспецифического язвенного колита или астмы, включающему введение пациенту, у которого диагностировано такое заболевание (и, следовательно, нуждающемуся в такой терапии), эффективного количества антитела, связывающегося с IL33R, в соответствии с изобретением. Антитело предпочтительно вводят в виде фармацевтической композиции. Еще одно воплощение данного изобретения относится к способу лечения пациента, страдающего от ревматоидного артрита, неспецифического язвенного колита или астмы, характеризующемуся введением пациенту антитела в соответствии с изобретением. Кроме того, изобретение относится к применению антитела в соответствии с изобретением для лечения пациента, страдающего от ревматоидного артрита, неспецифического язвенного колита или астмы, и для изготовления фармацевтической композиции в соответствии с изобретением. Кроме того, изобретение относится к способу изготовления фармацевтической композиции в соответствии с изобретением.

Кроме того, изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело в соответствии с изобретением, возможно вместе с буфером и/или адъювантом, используемым для состава антитела для фармацевтических целей. Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим антитело в соответствии с изобретением в фармацевтически приемлемом носителе. В одном воплощении фармацевтическая композиция может быть включена в изделие или набор.

Подробное описание изобретения

Термин «антитело» включает в себя различные формы структур антител, в том числе, но не ограничиваясь ими, целые антитела и фрагменты антител. Антитело в соответствии с изобретением предпочтительно представляет собой гуманизированное антитело, химерное антитело или другое антитело, полученное путем генной инженерии, до тех пор, пока сохраняются его характерные свойства в соответствии с изобретением. «Фрагменты антитела» включают часть антитела полной длины, предпочтительно его вариабельный домен, или по меньшей мере антигенсвязывающую часть. Примеры фрагментов антител включают двойные антитела, одноцепочечные молекулы антител и полиспецифические антитела, сформированные из фрагментов антител. Например, scFv-антитела описаны в Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88. Кроме того, фрагменты антитела включают одноцепочечные полипептиды, имеющие характеристики домена V_H, a именно возможность объединяться с доменом V_L, или характеристики домена V_L, связывающего IL33R, а именно возможность объединяться с доменом V_H для формирования функционального антигенсвязывающего сайта и обеспечения таким образом свойств антитела в соответствии с изобретением. Используемые в данном документе термины «моноклональное антитело» или «композиция с моноклональным антителом» относятся к изготовлению молекул антитела единого аминокислотного состава. Термин «гуманизированное антитело» относится к антителам, в которых были изменены каркасные участки или «участки, определяющие комплементарность» (CDR) так, чтобы они содержали CDR иммуноглобулина другого вида, отличного от родительского иммуноглобулина. В предпочтительном воплощении мышиный CDR прививают в каркасную область человеческого антитела для получения «гуманизированного антитела». См., например, Riechmann, L, et al., Nature 332 (1988) 323-327; и Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270.

Термин «связывание с IL33R», используемый в данном документе, означает связывание антитела с иммобилизованным человеческим IL33R в анализе связывания ELISA. Связывание обнаруживается, если антитело вызывает сигнал, больший чем среднее значение +3 стандартных отклонения или более относительно контроля без антитела при концентрации антитела выше 12 нг/мл.

Термин «аффинность» относится к силе суммарных общих нековалентных взаимодействий между отдельным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и его партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иное, то термин «аффинность связывания», используемый в данном документе, относится к внутренней аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антитела и антигена). Аффинность молекулы Х в отношении ее партнера Y может в основном выражаться константой диссоциации (K_d). Аффинность может быть измерена обычными способами, известными в данной области, включая те, которые приведены в данном описании. Конкретные иллюстративные и примерные воплощения измерения аффинности связывания описаны далее.

Термин «эпитоп» обозначает белковую детерминанту, способную специфически связываться с антителом. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или углеводные боковые цепи, и обычно эпитопы имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Конформационный и неконформационный эпитопы отличаются тем, что связывание с первым, но не с последним теряется в присутствии денатурирующих растворителей. Предпочтительно антитело в соответствии с изобретением специфически связывается с нативным, но не денатурированным IL33R. IL33R-антитело в соответствии с изобретением связывается с тем же эпитопом на IL33R, с которым связывается антитело МКА ra170. Эпитопсвязывающие свойства антитела IL33R в соответствии с изобретением можно определить с помощью методик, известных в данной области. IL33R-антитело проверяется в анализе конкурентного связывания in vitro для определения способности анализируемого антитела препятствовать связыванию антитела МКА ra170 с IL33R. Если есть вымещение анализируемого антитела антителом МКА ra170 по меньшей мере на 15%, то эпитопы находятся в непосредственной близости.

Термин «вариабельный домен» (вариабельный домен легкой цепи (V_L), вариабельный домен тяжелой цепи (V_H)), используемый в данном документе, означает пару из легкой и тяжелой цепей, которая непосредственно участвует в связывании антитела с антигеном. Домены вариабельной легкой и тяжелой цепей имеют одинаковые общие структуры, и каждый домен содержит четыре каркасных участка (framework region, FR), последовательности которых в значительной степени консервативны, соединенные тремя «гипервариабельными участками» (или участками, определяющими комплементарность, CDR). Каркасные участки принимают конформацию β-листа, и CDR могут образовывать петли, связывающие структуру β-листа. CDR в каждой цепи удерживаются в их трехмерной структуре с помощью каркасных участков и образуют вместе с CDR из другой цепи антигенсвязывающий участок. CDR3-участки тяжелой и легкой цепей антитела играют особенно важную роль в специфичности связывания/аффинности антител в соответствии с изобретением и, следовательно, обеспечивают дальнейший предмет изобретения.

Термин «антигенсвязывающая часть антитела», используемый в данном документе, относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Антигенсвязывающая часть антитела содержит аминокислотные остатки из «участков, определяющих комплементарность», или «CDR». «Каркасными участками», или «FR», являются те участки вариабельного домена, которые отличаются от остатков гипервариабельных участков, определенных здесь. Таким образом, вариабельные домены легких и тяжелых цепей антитела содержат от N-конца к C-концу домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. В частности, CDR3 тяжелой цепи является участком, который вносит наибольший вклад в связывание антигена и определяет свойства антитела. Области CDR и FR определены в соответствии со стандартной системой определения Кабата, Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или этими остатками из «гипервариабельной петли».

Термин «аминокислота», используемый в данной заявке, обозначает группу природных карбокси-α-аминокислот, включающую аланин (трехбуквенный код: Ala, однобуквенный код: А), аргинин (arg, R), аспарагин (asn, N), аспарагиновую кислоту (asp, D), цистеин (cys, С), глутамин (gln, Q), глутаминовую кислоту (glu, E), глицин (gly, G), гистидин (his, Н), изолейцин (Ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, K), метионин (met, М), фенилаланин (phe, F), пролин (pro, Р), серин (ser, S), треонин (thr, Т), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).

Термины «нуклеиновая кислота» или «нуклеиновокислотная молекула», используемые в данном документе, включают молекулы ДНК и молекулы РНК. Нуклеиновокислотная молекула может быть одноцепочечной или двуцепочечной, но предпочтительной является двуцепочечной ДНК. Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», когда она находится в функциональной взаимосвязи с другой нуклеиновой кислотой. Например, ДНК предпоследовательности или секреторного лидера функционально связана с ДНК полипептида, если он экспрессируется как пребелок, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы облегчить трансляцию. Как правило, «функционально связаны» означает, что последовательности ДНК являются смежными и, в случае секреторного лидера, смежными и в одной рамке считывания. Тем не менее, энхансеры не обязательно должны быть смежными. Связывание осуществляется путем лигирования на подходящих сайтах рестрикции. Если таких сайтов не существует, то в соответствии с обычной практикой используются синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры. Используемые в данном документе выражения «клетка», «клеточная линия» и «клеточная культура» используются взаимозаменяемо, и все такие обозначения включают потомство. Таким образом, слова «трансформанты» и «трансформированные клетки» включают первичную клетку-объект и культуры, полученные из нее, независимо от количества переносов. Также понятно, что все потомство может не быть точно идентичным по содержанию ДНК из-за преднамеренных или случайных мутаций. Подразумевается вариантное потомство, которое имеет такие же функции или биологическую активность, как и у исходной трансформированной клетки.

«Fc-часть» антитела непосредственно не вовлечена в связывание антитела с антигеном, но демонстрирует различные эффекторные функции. «Fc-часть антитела» является термином, хорошо известным специалистам, и определяется на основе расщепления антител папаином. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей антитела или иммуноглобулины делятся на классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть разделены на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃ и IgG₄, IgA₁ и IgA₂. В соответствии с константными областями тяжелой цепи различные классы иммуноглобулинов называются α, δ, ε, γ и µ, соответственно. Fc-часть антитела непосредственно участвует в ADCC (антителозависимой клеточной цитотоксичности) и CDC (комплементзависимой цитотоксичности) на основе активации комплемента, C1q-связывании и Fc-рецепторном связывании. Активация комплемента (CDC) начинается при связывании фактора комплемента C1q с Fc-частью большинства подклассов IgG-антител. В то время как влияние антитела на систему комплемента зависит от определенных условий, связывание с C1q вызвано определенными сайтами связывания в Fc-части. Такие сайты связывания Fc-части известны в данной области и описаны, например, Boackle, R.J., et al., Nature 282 (1979) 742-743; Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0307434. Такими сайтами связывания являются, например, L234, L235, D270, N297, Е318, K320, K322, Р331 и Р329 (нумерация в соответствии с EU индексом Кабата, Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Антитела подклассов IgG₁, IgG₂ и IgG₃ обычно демонстрируют активацию комплемента и C1q-связывание, в то время как IgG₄ не активируют систему комплемента и не связывают C1q.

Антитело в соответствии с изобретением содержит Fc-часть человеческого происхождения, которая является Fc-частью человеческого антитела подкласса IgG₁ или IgG₄. Для Fc-части антитела в соответствии с изобретением предпочтительно не может быть обнаружено C1q-связывание, как определено ниже.

Таким образом, изобретение включает антитело в соответствии с изобретением, при этом указанное антитело связывает IL33R, содержит Fc-часть человеческого происхождения и не связывает человеческий фактор комплемента C1q и, следовательно, не имеет CDC-эффекторной функции.

Предпочтительно антитело в соответствии с изобретением находится в связи с Fcγ-рецепторным связыванием человеческих подклассов IgG₁ или IgG₂ с мутацией L234, L235 и/или D265 и/или содержит мутацию PVA236. Предпочтительными являются мутации L234A, L235A, L235E и/или PVA236 (PVA236 означает, что аминокислотная последовательность ELLG (данная в однобуквенном аминокислотном коде) из аминокислотных позиций 233-236 из IgG₁ или IgG₄ из EFLG заменяется на PVA). Таким образом, данное изобретение относится к антителу в соответствии с изобретением, при этом указанное антитело представляет собой человеческое антитело подкласса IgG₁, содержащее по меньшей мере одну мутацию из L234, L235, D270, N297, Е318, K320, K322, Р331 и/или Р329. В одном воплощении антитело представляет собой человеческое антитело. В другом воплощении антитело представляет собой гуманизированное антитело. В одном воплощении данное изобретение относится к антителу в соответствии с изобретением, содержащему Fc-часть человеческого происхождения, при этом указанное антитело представляет собой человеческое антитело подкласса IgG₁, содержащее по меньшей мере одну мутацию из L234, L235, D270, N297, Е318, K320, K322, Р331, и связывается с IL33R со значением K_D менее 10^-8 М в анализе BIAcore. В другом воплощении диапазон K_D составляет от 10^-11 до 10^-9 М.

C1q-связывание может быть измерено в соответствии с Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184. Отсутствие C1q-связывания в соответствии с изобретением характеризуется тем, что если в таком анализе планшет ELISA покрыт различными концентрациями антитела, то добавляется человеческий C1q. Связывание C1q обнаруживается с помощью антитела, направленного против человеческого C1q с последующим обнаружением меченного пероксидазой конъюгата с помощью пероксидазного субстрата ABTS® (2,2′-азино-ди-[3-этилбензтиазолинсульфонат]). Отсутствие C1q-связывания в соответствии с изобретением не будет обнаружено, если оптическая плотность (OD) при 405 нм составляет для анализируемого антитела менее 0,05 при концентрации антитела 10 м кг/мл.

Антитело в соответствии с изобретением предпочтительно характеризуется тем, что константные цепи имеют человеческое происхождение. Такие константные цепи хорошо известны в данной области и описаны, например, Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991); и Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218). Например, используемая человеческая константная область тяжелой цепи включает SEQ ID №10, 11 или 29. Например, используемая человеческая константная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность константной области легкой каппа-цепи из SEQ ID №12 или 34.

Еще одно воплощение данного изобретения относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей тяжелую и легкую цепи антитела в соответствии с изобретением.

Изобретение относится к способу лечения пациента, нуждающегося в терапии, который характеризуется введением пациенту терапевтически эффективного количества антитела в соответствии с изобретением. Изобретение относится к применению антитела в соответствии с изобретением в терапии. Изобретение относится к применению антитела в соответствии с изобретением для получения лекарственного средства для профилактики и лечения особенно воспалительных заболеваний. Изобретение относится к применению антитела в соответствии с изобретением для лечения воспалительных заболеваний, предпочтительно для лечения ревматоидного артрита, неспецифического язвенного колита и астмы.

Кроме того антитела в соответствии с изобретением включают такие антитела с «модификациями консервативных последовательностей» (вариантные антитела), у которых модификации нуклеотидных и аминокислотных последовательностей не влияют или не изменяют вышеуказанные характеристики антитела в соответствии с изобретением. Модификации могут быть введены стандартными методиками, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативные аминокислотные замены включают те, при которых аминокислотный остаток заменен на аминокислотный остаток со сходной боковой цепью. В данной области были выявлены семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин,