Биспецифические двухвалентные антитела анти-vegf/анти-ang-2

Биспецифические двухвалентные антитела анти-vegf/анти-ang-2

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к биспецифическим, двухвалентным антителам против фактора роста эндотелия сосудов человека (VEGF/VEGF-A) и против ангиопоэтина-2 человека (ANG-2), к способам их получения, к фармацевтическим композициям, содержащим эти антитела, и к их применениям.

Предшествующий уровень техники

Ангиогенез вовлечен в патогенез ряда расстройств, которые включают солидные опухоли, внутриглазные неоваскулярные синдромы, такие как пролиферативные ретинопатии или возрастная макулярная дегенерация (ВМД), ревматоидный артрит и псориаз (Folkman, J., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931-10934; Klagsbrun, M., et al., Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239; и Garner, A., Vascular diseases, in: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G.K. (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp.1625-1710). В случае солидных опухолей неоваскуляризация дает возможность опухолевым клеткам приобретать преимущество роста и пролиферативную автономию по сравнению с нормальными клетками. Соответственно, наблюдается корреляция между плотностью микрососудов в срезах опухолей и выживанием пациента, как при раке молочной железы, так и при нескольких других опухолях (Weidner, N„ et al., N Engl J Med. 324 (1991) 1-8; Horak, E.R., et al., Lancet 340 (1992) 1120-1124; и Macchiarini, P., et al., Lancet 340 (1992) 145-146).

VEGF и антитела против VEGF

Фактор роста эндотелия сосудов человека (VEGF/VEGF-A) (SEQ ID No:105) описан, например, в Leung, D.W., et al., Science 246 (1989) 1306-9; Keck, P.J., et al., Science 246 (1989) 1309-12 и Connolly, D.T„ et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-24. VEGF вовлечен в регуляцию нормального и аномального ангиогенеза и неоваскуляризацию, ассоциированную с опухолями и внутриглазными расстройствами (Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25; Berkman, R.A., et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159; Brown, LF., et al., Human Pathol. 26 (1995) 86-91; Brown, L.F., et al., Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735; Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934; и Dvorak, H.F., et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039). VEGF представляет собой гомодимерный гликопротеин, который выделен из нескольких источников. VEGF проявляет высокоспецифичную митогенную активность к эндотелиальным клеткам. VEGF обладает важными регуляторными функциями в формировании новых кровеносных сосудов в процессе эмбрионального васкулогенеза и в ангиогенезе в течение взрослой жизни (Carmeliet, P., et al., Nature, 380 (1996) 435-439; Ferrara, N, et al. Nature, 380 (1996) 439-442; обзор в Ferrara, N., et al, Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25). Значимость роли, которую играет VEGF, продемонстрирована в исследованиях, показывающих, что инактивация единственного аллеля VEGF приводит в результате к эмбриональной летальности вследствие неспособности к развитию сосудистой сети (Carmeliet, P., et al., Nature, 380 (1996) 435-439; Ferrara, N, et al. Nature, 380 (1996) 439-442). Кроме того, VEGF обладает сильной хемоаттрактантной активностью в отношении моноцитов, могут индуцировать активатор плазминогена и ингибитор активатора плазминогена в эндотелиальных клетках, а также могут индуцировать проницаемость микрососудов. В связи с последней активностью иногда на него ссылаются как на фактор проницаемости сосудов (VPF). Сделан обзор выделения и свойств VEGF; см. Ferrara, N., et al., J. Cellular Biochem, 47 (1991) 211-218 и Connolly, D.T, J. Cellular Biochem., 47 (1991) 219-223. Альтернативный сплайсинг мРНК единственного гена VEGF образует пять изоформ VEGF.

Нейтрализующие антитела против VEGF подавляют рост ряда опухолевых клеточных линий человека у мышей (Kirn, K.J, et al., Nature 362 (1993) 841-844; Warren, S.R, et al., J. Clin. Invest. 95 (1995) 1789-1797; Borgstrom, P., et al., Cancer Res. 56 (1996) 4032-4039; и Melnyk, 0, et al., Cancer Res. 56 (1996) 921-924). WO 94/10202, WO 98/45332, WO 2005/00900 и WO 00/35956 относятся к антителам против VEGF. Гуманизированное моноклональное антитело бевацизумаб (имеющееся в продаже под торговым названием Авастин®) представляет собой антитело против VEGF, применяемое в противоопухолевой терапии (WO 98/45331).

Ранибизумаб (торговое название Луцентис®) представляет собой фрагмент моноклонального антитела, имеющий происхождение от того же родительского антитела, что и бевацизумаб (Авастин). Он намного меньше родительской молекулы и обладает созревшим сродством, обеспечивающим более сильное связывание с VEGF-A (WO 98/45331). Он является антиангиогенным, что одобрено для лечения "влажного" типа возрастной макулярной дегенерации (ВМД), распространенной формы возрастной потери зрения. Другим антителом против VEGF является, например, HuMab G6-31, описанное, например, в US 2007/0141065.

ANG-2 и антитела против ANG-2

Ангиопоэтин-2 человека (ANG-2) (альтернативно сокращенный как ANGPT2 или ANG2) (SEQ ID No:106) описан в Maisonpierre, P.C, et al, Science 277 (1997) 55-60 и Cheung.A.H, et al., Genomics 48 (1998) 389-91. Ангиопоэтины-1 и -2 (ANG-1 (SEQ ID No:107) и ANG-2 (SEQ ID No:106)) были открыты как лиганды к Tie, семейству тирозинкиназ, которые селективно экспрессируются внутри эндотелия сосудов. Yancopoulos, G.D., et al., Nature 407 (2000) 242-48. В настоящее время существует четыре точно определенных члена семейства ангиопоэтинов. Ангиопоэтин-3 и -4 (Апд-3 и Апд-4) могут представлять собой широко дивергировавшие копии одного и того же генного локуса у мыши и человека. Kirn, I., et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-56; Kim, I., et at., J Biol Chem 274 (1999) 26523-28. ANG-1 и ANG-2 были исходно идентифицированы в экспериментах на тканевых культурах как агонист и антагонист, соответственно (см. для ANG-1: Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-69; и для ANG-2: Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60). Все известные ангиопоэтины связываются, прежде всего, с Tie2, и оба Апд-1 и -2 связываются с Tie2 со сродством 3 нМ (Kd). Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60. Было показано, что Апд-1 поддерживает выживание ЕС и стимулирует целостность эндотелия, Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-69; Kwak, H.J., et al., FEBS Lett 448 (1999) 249-53; Suri, С., et al., Science 282 (1998) 468-71; Thurston, G., et al., Science 286 (1999) 2511-2514; Thurston, G., et al., Nat. Med. 6 (2000) 460-63, тогда как ANG-2 обладал противоположным эффектом и стимулировал дестабилизацию и регрессию кровеносных сосудов в отсутствие факторов выживания VEGF или основного фактора роста фибробластов. Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60. Однако многие исследования функции ANG-2 позволили предположить более сложную ситуацию. ANG-2 может быть комплексным регулятором ремоделирования сосудов, который играет роль как в спрутинге сосудов, так и в регрессии сосудов. В подтверждение таких ролей для ANG-2, экспрессионные анализы выявили, что ANG-2 быстро индуцируется, вместе с VEGF, в моделях ангиогенного спрутинга у взрослых, тогда как ANG-2 индуцируется в отсутствие VEGF в моделях васкулярной регрессии. Holash, J., et al., Science 284 (1999) 1994-98; Holash, J., et al., Oncogene 18 (1999) 5356-62. В соответствии с контекстно-зависимой ролью, ANG-2 специфично связывается с одним и тем же рецептором эндотелиальной специфичности, Tie-2, который активируется Апд-1, но обладает контекстно-зависимыми эффектами на его активацию. Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60.

Анализы ангиогенеза роговицы показали, что и ANG-1, и ANG-2 обладают сходными эффектами, действуя синергично с VEGF, по стимуляции роста новых кровеносных сосудов. Asahara, Т., et al., Circ. Res. 83 (1998) 233-40. Вопрос о возможности того, что существует дозозависимый эндотелиальный ответ, был вызван в результате наблюдения, что in vitro при высокой концентрации ANG-2 может также быть проангиогенным. Kirn, I., et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52. При высокой концентрации ANG-2 действует как фактор выживания апоптоза для эндотелиальных клеток в процессе апоптоза, обусловленного сывороточным голоданием, посредством активации Tie2 через биохимический путь киназы PI-3 и Akt. Kirn, I., et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52.

Другие эксперименты in vitro позволили предположить, что во время пролонгированного воздействия эффекты ANG-2 могут претерпевать постепенный сдвиг от эффекта антагониста к эффекту агониста Tie2, и в более поздние моменты времени они могут вносить непосредственный вклад в формирование сосудистой трубки и стабилизации нового кровеносного сосуда. Teichert-Kuliszewska, К., et al., Cardiovasc. Res. 49 (2001) 659-70. Кроме того, если ЕС культивировали на фибриновом геле, активацию Tie2 за счет ANG-2 также наблюдали, что, возможно, предполагает, что действие ANG-2 может зависеть от стадии дифференциации ЕС.Teichert-Kuliszewska, К., et al., Cardiovasc. Res. 49 (2001) 659-70. В ЕС микрососудов, культивируемых в трехмерном коллагеновом геле, ANG-2 также может индуцировать активацию Tie2 и стимулировать образование капилляроподобных структур. Mochizuki, Y., et al., J. Cell. Sci. 115 (2002) 175-83. Использование 3-D сферической совместной культуры в качестве in-vitro модели созревания кровеносных сосудов продемонстрировало, что прямой контакт между ЕС и мезенхимными клетками уничтожает реактивность в отношении VEGF, тогда как присутствие VEGF и ANG-2 индуцирует спрутинг.Korff, Т., et al., Faseb J. 15 (2001) 447-57. Авторы Etoh, Т.Н. et al. продемонстрировали, что в ЕС, которые конститутивно экспрессируют Tie2, экспрессия ММР-1, -9 и и-РА претерпевала сильную понижающую регуляцию ANG-2 в присутствии VEGF. Etoh, Т., et al., Cancer Res. 61 (2001) 2145-53. На модели in vivo зрачковой перепонки Lobov, I.В. et al. показали, что ANG-2 в присутствии эндогенного VEGF стимулирует быстрое увеличение диаметра капилляра, ремоделирование базальной пластинки, пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток, а также стимулирует спрутинг новых кровеносных сосудов. Lobov, I.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 11205-10. Напротив, ANG-2 стимулирует гибель эндотелиальных клеток и регрессию сосудов без эндогенного VEGF. Lobov, I.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 11205-10. Подобным образом, в модели опухоли in vivo авторы Vajkoczy, P., et al. продемонстрировали, что многоклеточные агрегаты инициируют рост кровеносных сосудов путем ангиогенного спрутинга посредством одновременной экспрессии VEGFR-2 и ANG-2 эндотелием хозяина и опухоли. Vajkoczy, P., et al., J. Clin. Invest. 109 (2002) 777-85. Данная модель проиллюстрировала, что установившаяся сеть микрососудов растущих опухолей характеризуется непрерывным ремоделированием, предположительно опосредованным экспрессией VEGF и ANG-2 (Vajkoczy, P., et al., J. Clin. Invest. 109 (2002) 777-85).

Исследования Tie-2 и ангиопоэтина-1 на нокаут-мышах показывают сходные фенотипы и позволяют предположить, что стимулируемое ангиопоэтином-1 фосфорилирование Tie-2 опосредует ремоделирование и стабилизацию развивающегося сосуда, стимулируя созревание кровеносного сосуда в процессе ангиогенеза, и сохранение клеточной адгезии, поддерживаемой эндотелиальными клетками (Dumont, D.J., et al., Genes & Development, 8 (1994) 1897-1909; Sato, T.N., Nature, 376 (1995) 70-74; (Thurston, G., et al., Nature Medicine 6 (2000) 460-463). Считают, что роль ангиопоэтина-1 консервативна у взрослых, где он экспрессируется широко и конститутивно (Hanahan, D., Science, 277 (1997) 48-50; Zagzag, D., et al., Exp Neurology 159 (1999) 391-400). Напротив, экспрессия ангиопоэтина-2, в основном, ограничена сайтами ремоделирования сосудов, где, как считают, она блокирует конститутивную функцию ангиопоэтина-1 по стабилизации или созреванию, что дает возможность кровеносным сосудам вернуться в пластичное состояние, которое может быть более реактивным на сигналы спрутинга, или оставаться в нем (Hanahan, D., 1997; Holash, J., et al., Oncogene 18 (199) 5356-62; Maisonpierre, P.C., 1997). В исследованиях экспрессии ангиопоэтина-2 при патологическом ангиогенезе обнаружено, что многие типы опухолей проявляют экспрессию ангиопоэтина-2 кровеносных сосудов (Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60). Функциональные исследования позволяют предположить, что ангиопоэтин-2 вовлечен в опухолевый ангиогенез, и связывают гиперэкспрессию ангиопоэтина-2 с повышенным опухолевым ростом в мышиной модели ксенотрансплантата (Ahmad, S.A., et al., Cancer Res., 61 (2001) 1255-1259). Другие исследования связывают гиперэкспрессию ангиопоэтина-2 с гиперваскулярностью опухоли (Eton, Т., et al., Cancer Res. 61 (2001) 2145-53; Tanaka, F., et al., Cancer Res. 62 (2002) 7124-7129).

В последние годы ангиопоэтин-1, ангиопоэтин-2 и/или Tie-2 предложены в качестве возможных противораковых терапевтических мишеней. Например, в каждом из US 6166185, US 5650490 и US 5814464 раскрыты антитела против лиганда и рецептора Tie-2. В исследованиях с использованием растворимого Tie-2 сообщали о снижении числа и размера опухолей у грызунов (Lin, 1997; Lin 1998). Авторы Siemeister, G., et al., Cancer Res. 59:3 (1999) 3185-91 создали линии клеток меланомы человека, экспрессирующие внеклеточный домен Tie-2, инъецировали их бестимусным мышам и сообщили, что растворимый Tie-2 приводит в результате к значимому ингибированию опухолевого роста и опухолевого ангиогенеза. С учетом того, что и ангиопоэтин-1, и ангиопоэтин-2 связывается с Tie-2, из этих исследований непонятно, будет ли ангиопоэтин-1, ангиопоэтин-2 или Tie-2 привлекательной мишенью для противораковой терапии. Однако считают, что эффективная терапия против ангиопоэтина-2 полезна при лечении заболеваний, таких как рак, при которых прогрессирование зависит от аберрантного ангиогенеза, где блокирование этого процесса может привести к предотвращению прогрессивного развития заболевания (Folkman, J., Nature Medicine. 1 (1995) 27-31).

Кроме того, некоторые группы сообщили о применении антител и пептидов, которые связываются с ангиопоэтином-2. См., например, US 6166185 и US 2003/10124129. WO 03/030833, WO 2006/068953, WO 03/057134 или US 2006/0122370.

Исследование эффекта очаговой экспрессии ангиопоэтина-2 показало, то антагонизация сигнала ангиопоэтина-1Л1е-2 ослабляет жесткую структуру сосудов, подвергая посредством этого ЕС воздействию активирующих сигналов от индукторов ангиогенеза, например, VEGF (Hanahan, D., Science, 277 (1997) 48-50). Этот проангиогенный эффект, являющийся результатом ингибирования ангиопоэтина-1, указывает на то, что терапия против ангиотензина-1 не будет эффективной противораковой терапией.

ANG-2 экспрессируется в процессе развития в сайтах, где происходит ремоделирование кровеносных сосудов. Maisonpierre, P.С., et al., Science 277 (1997) 55-60. У взрослых индивидуумов экспрессия ANG-2 ограничена сайтами ремоделирования кровеносных сосудов, а также в высоко васкуляризированных опухолях, включая глиому, Osada, H., et al., Int. J. Oncol. 18 (2001) 305-09); Кода, К., et al., Cancer Res. 61 (2001) 6248-54, печеночно-клеточный рак, Tanaka, S., et al., J. Clin. Invest. 103 (1999) 341-45, карциному желудка, Eton, Т., et al., Cancer Res. 61 (2001) 2145-53; Lee, J.H., et al., Int. J. Oncol. 18 (2001) 355-61, опухоль щитовидной железы, Bunone, G., et al., Am J Pathol 155 (1999) 1967-76, немелкоклеточный рак легкого, Wong, M.P., et al., Lung Cancer 29 (2000) 11-22, и рак ободочной кишки, Ahmad, S.A., et al., Cancer 92 (2001) 1138-43, и простаты, Wurmbach, J.H., et al., Anticancer Res. 20 (2000) 5217-20. Обнаружено, что некоторые опухолевые клетки экспрессируют ANG-2. Например, Tanaka, S., et al., J. Clin. Invest. 103 (1999) 341-45 обнаружили мРНК ANG-2 в 10 из 12 образцов печеночно-клеточного рака человека (НСС). Группа Ellis' сообщила, что ANG-2 экспрессируется повсеместно в эпителии опухоли. Ahmad, S.A., et al., Cancer 92 (2001) 1138-43. Другие исследователи сообщали о подобных открытиях. Chen, L, et al., J. Tongji Med. Univ. 21 (2001) 228-35. В результате определения уровней мРНК ANG-2 в архивированных образцах опухолей молочной железы человека Sfiligoi, С., et al., Int. J. Cancer 103 (2003) 466-74 сообщили, что мРНК ANG-2 в значительной степени связана с сопутствующей инвазией лимфоузлов, коротким периодом времени без заболевания и плохой общей выживаемостью. Tanaka, F., et al., Cancer Res. 62 (2002) 7124-29 проведен обзор суммарно 236 пациентов с немелкоклеточным раком легкого (НМКРЛ) с патологической стадией I-IIIA, соответственно. Используя иммуногистохимию, они обнаружили, что 16,9% из пациентов с НМКРЛ были положительными по ANG-2. Плотность микрососудов для опухоли, положительной по ANG-2, значительно выше, чем для отрицательных по ANG-2. Такой ангиогенный эффект ANG-2 наблюдали только тогда, когда экспрессия VEGF была высокой. Кроме того, положительная экспрессия ANG-2 была значимым фактором для предсказания плохой послеоперационной выживаемости. Tanaka, F., et al., Cancer Res. 62 (2002) 7124-7129. Однако они не обнаружили значимую корреляцию между экспрессией Ang-1 и плотностью микрососудов. Tanaka, F., et al., Cancer Res. 62 (2002) 7124-7129. Эти результаты позволяют предположить, что ANG-2 является индикатором пациентов с плохим прогнозом при нескольких типах рака.

Недавно, используя модель нокаут-мышей по ANG-2, группа Yancopoulos' сообщила, что ANG-2 требуется для постнатального ангиогенеза. Gale, N.W., et al., Dev. Cell 3 (2002) 411-23. Они показали, что программируемая в процессе развития регрессия сосудистой сети гиалоидной мембраны в глазу не происходит у нокаут-мышей по ANG-2, и кровеносные сосуды их сетчатки неспособны к спрутингу из центральной ретинальной артерии. Gale, N.W., et al., Dev. Cell 3 (2002) 411-23. Эти авторы также обнаружили, что делеция ANG-2 приводит в результате к глубоким дефектам в структурировании и функции сети лимфатических сосудов. Gale, N.W., et al., Dev. Cell 3 (2002) 411-23. Генетическое спасение Ang-1 корректирует лимфатические дефекты, но не дефекты ангиогенеза. Gale, N.W., et al., Dev. Cell 3 (2002) 411-23.

Peters с соавторами сообщили, что растворимый Tie2 при доставке либо в виде рекомбинантного белка, либо в вирусном экспрессионном векторе ингибирует in vivo рост карциномы молочной железы мыши и меланомы в мышиных моделях. Lin, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 8829-34; Lin, P., et al., J. Clin. Invest. 100 (1997) 2072-78. Плотности кровеносных сосудов в опухолевых тканях, обработанных таким образом, были значительно снижены. Кроме того, растворимый Tie2 блокировал ангиогенез роговицы крыс, стимулированный средой, кондиционированной опухолевыми клетками. Lin, P., et al., J. Clin. Invest. 100 (1997) 2072-78. Кроме того, Isner и его группой продемонстрировано, что добавление ANG-2 к VEGF стимулировано значительно более длительную и более в большей степени кольцевую неоваскуляризацию, чем только VEGF. Asahara, Т., et al., Circ. Res. 83 (1998) 233-40. Избыток растворимого рецептора Tie2 препятствовал модулированию VEGF-индуцированной неоваскуляризации ANG-2. Asahara, Т., et al., Circ. Res. 83 (1998) 233-40. Siemeister, G., et al., Cancer Res. 59:3 (1999) 3185-91 с помощью ксенотрансплантатов бестимусных мышей показали, что гиперэкспрессия внеклеточных лиганд-связывающих доменов либо Flt-1, либо Tie2 в ксенотрансплантатах, приводящая в результате к значимому ингибированию биохимического пути, не может компенсироваться друг другом, что позволяет предположить, что биохимический путь рецептора VEGF и биохимический путь Tie2 следует считать двумя независимыми медиаторами, существенными для процесса ангиогенеза in vivo. Siemeister, G., et al., Cancer Res. 59:3 (1999) 3185-91. Это доказано недавней публикацией White, R., R., et al.,, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (2003) 5028-33. В их исследовании было продемонстрировано, что устойчивый к нуклеазе аптамер РНК, который специфично связывает и ингибирует ANG-2, значимо ингибирует неоваскуляризацию, индуцированную bFGF, в модели ангиогенеза микродивертикулов роговицы крыс.

Биспецифические антитела

В недавнем прошлом разработано широкое разнообразие форматов рекомбинантных антител, например, четырехвалентные биспецифические антитела, путем слияния, например, IgG-формата антитела и одноцепочечных доменов (см., например, Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15 (1997) 159-163; WO 2001/077342; и Morrison, S.L, Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234).

Также разработано несколько других новых форматов, где сердцевинная структура антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) больше не сохраняется, как, например, диа-, триа- или тетратела, минитела, несколько одноцепочечных форматов (scFv, Bis-scFv), которые способны к связыванию двух или более чем двух антигенов (Holliger, P., et al., Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J., et al., Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74; Wu, С., et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297).

Во всех таких форматах используют линкеры, либо для слияния сердцевины антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) с другим связывающим белком (например, scFv), либо для слияния, например, двух Fab фрагментов или scFv (Fischer, N., Leger, О., Pathobiology 74 (2007) 3-14). Следует помнить, что в одном случае желательно сохранить эффекторные функции, такие как, например, комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC) или антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC), которые опосредованы связыванием рецептора Fc, путем сохранения высокой степени подобия встречающимся в природе антителам.

В WO 2007/024715 описаны иммуноглобулины с двойным вариабельным доменом, как сконструированные поливалентные и полиспецифические связывающие белки. Способ получения биологически активных димеров антитела описан в US 6897044. Конструкция Fy поливалентного антитела, имеющего по меньшей мере четыре вариабельных домена, которые связаны друг с другом посредством пептидных линкеров, описана в US 7129330. Димерные и мультимерные антигенсвязывающие структуры описаны в US 2005/0079170. Трех-или четырехвалентный моноспецифический антигенсвязывающий белок, содержащий три или четыре Fab фрагмента, связанные друг с другом ковалентно посредством соединительной структуры, где этот белок не является природным иммуноглобулином, описан в US 6511663. В WO 2006/020258 описаны четырехвалентные биспецифические антитела, которые могут эффективно экспрессироваться в прокариотических и эукариотических клетках, и полезны в терапевтических и диагностических методах. Способ разделения или преимущественного синтеза димеров, которые связаны посредством по меньшей мере одной межцепочечной дисульфидной связи, и димеров, которые не связаны посредством по меньшей мере одной межцепочечной дисульфидной связи, из смеси, содержащей эти два типа полипептидных димеров, описан в US 2005/0163782. Биспецифические тетравалентные рецепторы описаны в US 5959083. Сконструированные антитела с тремя или большим числом функциональных антигенсвязывающих сайтов описаны в WO 2001/077342.

Полиспецифические и поливалентные антигенсвязывающие полипептиды описаны в WO 1997/001580. В WO 1992/004053 описаны гомоконъюгаты, типично полученные из моноклональных антител класса IgG, которые связываются с одной и той же антигенной детерминантой, и ковалентно связанные посредством синтетического сшивания. Олигомерные моноклональные антитела с высоким авидитетом к антигену описаны в WO 1991/06305, где секретируются олигомеры, типично класса IgG, имеющие два или более чем два иммуноглобулиновых мономера, ассоциированные вместе с образованием четырехвалентных или шестивалентных молекул IgG. Антитела, полученные от овцы, и сконструированные конструкции антител описаны в US 6350860, где их можно применять при лечении заболеваний, где активность интерферона гамма является патогенной. В US 2005/0100543 описаны направляемые конструкции, которые являются поливалентными носителями биспецифических антител, то есть каждая молекула направляемой конструкции может служить в качестве носителя двух или более чем двух биспецифических антител. Генетически сконструированные биспецифические четырехвалентные антитела описаны в W01995/009917. В WO 2007/109254 описаны стабилизированные связывающие молекулы, которые состоят из стабилизированного scFv или включают его.

Комбинация ингибиторов VEGF и ANG-2

WO 2007/068895 относится к комбинации антагониста ANG-2 и VEGF, антагонистов KDR и/или FLTL. WO 2007/089445 относится к комбинациям ингибиторов ANG-2 и VEGF.

WO 2003/106501 относится к слитым белкам, связывающимся с ангиопоэтином и содержащим домен мультимеризации. WO 2008/132568 относится к слитым белкам, связывающимся с ангиопоэтином и VEGF. W0 2003/020906 относится к поливалентным белковым конъюгатам с множественными лиганд-связывающими доменами рецепторов.

WO 2009/136352 относится к антиангиогенным соединениям.

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретение направлено на биспецифическое, двухвалентное антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается с VEGF человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается с ANG-2 человека, характеризующееся тем, что

i) первый антигенсвязывающий сайт содержит в качестве вариабельного домена тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO:1 и в качестве вариабельного домена легкой цепи (VL) SEQ ID NO:2; и

ii) второй антигенсвязывающий сайт содержит в качестве вариабельного домена тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO:3 и в качестве вариабельного домена легкой цепи (VL) SEQ ID NO:4.

В одном аспекте изобретения биспецифическое антитело в соответствии с изобретением характеризуется содержанием

a) тяжелой цепи и легкой цепи первого полноразмерного антитела, которое специфично связывается с VEGF; и

b) модифицированной тяжелой цепи и модифицированной легкой цепи первого полноразмерного антитела, которое специфично связывается с ANG-2, где константные домены CL и СН1 заменены друг другом.

В одной форме осуществления такое биспецифическое, двухвалентное антитело характеризуется содержанием

a) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:7 в качестве тяжелой цепи первого полноразмерного антитела, и аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5 в качестве легкой цепи первого полноразмерного антитела, и

b) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:8 в качестве модифицированной тяжелой цепи второго полноразмерного антитела, и аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6 в качестве модифицированной легкой цепи второго полноразмерного антитела.

В одной форме осуществления такое биспецифическое, двухвалентное антитело характеризуется содержанием

a) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:11 в качестве тяжелой цепи первого полноразмерного антитела, и аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9 в качестве легкой цепи первого полноразмерного антитела, и

b) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12 в качестве модифицированной тяжелой цепи второго полноразмерного антитела, и аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10 в качестве модифицированной легкой цепи второго полноразмерного антитела.

В одной форме осуществления такое биспецифическое, двухвалентное антитело характеризуется содержанием

a) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:15 в качестве тяжелой цепи первого полноразмерного антитела, и аминокислотной последовательности SEQ ID NO:13 в качестве легкой цепи первого полноразмерного антитела, и

b) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:16 в качестве модифицированной тяжелой цепи второго полноразмерного антитела, и аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14 в качестве модифицированной легкой цепи второго полноразмерного антитела.

Следующими аспектами изобретения являются: фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическое антитело, данная композиция для лечения рака, применение данного биспецифического антитела для получения лекарственного средства для лечения рака, способ лечения пациента, страдающего раком, путем введения данного биспецифического антитела пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

Следующими аспектами изобретения являются: фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическое антитело, данная композиция для лечения сосудистых заболеваний, применение данного биспецифического антитела для получения лекарственного средства для лечения сосудистых заболеваний, способ лечения пациента, страдающего сосудистым заболеванием, путем введения данного биспецифического антитела пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

Следующим аспектом изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая цепь биспецифического антитела в соответствии с изобретением.

Далее в изобретении предложены экспрессионные векторы, содержащие нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением, способные экспрессировать эту нуклеиновую кислоту в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине, и клетки-хозяева, содержащие такие векторы, для рекомбинантного продуцирования биспецифического антитела в соответствии с изобретением.

Далее изобретение включает прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, содержащую вектор в соответствии с изобретением.

Далее изобретение включает способ получения биспецифического антитела в соответствии с изобретением, характеризующийся экспрессией нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине и выделение биспецифического антитела из клетки или из супернатанта клеточной культуры. Далее изобретение включает антитело, полученное таким способом получения биспецифического антитела.

Соответственно, одной формой осуществления изобретения является биспецифическое, двухвалентное антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается с VEGF человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается с ANG-2 человека, характеризующееся содержанием аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8.

Соответственно, одной формой осуществления изобретения является биспецифическое, двухвалентное антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается с VEGF человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается с ANG-2 человека, характеризующееся содержанием аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12.

Соответственно, одной формой осуществления изобретения является биспецифическое, двухвалентное антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается с VEGF человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается с ANG-2 человека, характеризующееся содержанием аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 и SEQ ID NO:16.

Биспецифические, двухвалентные антитела в соответствии с изобретением проявляют полезные эффекты для пациентов-людей, нуждающихся в терапии, направленной на VEGF и ANG-2. Антитела в соответствии с изобретением обладают в высокой степени ценными свойствами, дающими пользу пациенту, страдающему таким заболеванием, в частности, страдающему раком. Биспецифические антитела в соответствии с изобретением высокоэффективны при ингибировании опухолевого роста и/или ингибировании опухолевого ангиогенеза или сосудистых заболеваний. Биспецифические, двухвалентные антитела <VEGF-ANG-2> в соответствии с изобретением проявляют ценные фармакокинетические/-динамические свойства, такие как, например, стабильность, хороший (то есть медленный) клиренс (например, при низких дозах).

Биспецифические антитела в соответствии с изобретением высоко эффективны при

a) ингибировании опухолевого роста (например, посредством биспецифических антител в соответствии с изобретением стаз опухоли может быть уже достигнут при более низких концентрациях по сравнению с комбинацией двух моноспецифических антител (например, в моделях опухолей Colo205 и KPL-4 Примера 9 и 10 стаз опухоли был уже достигнут при 10 мг/кг XMAb1 по сравнению с комбинацией 10 мг/кг ANG2i-LC06+10 мг/кг авастина), и/или

b) ингибировании опухолевого ангиогенеза или сосудистых заболеваний (например, максимальные антиангиогенные эффекты посредством биспецифических антител в соответствии с изобретением могли быть уже достигнуты при более низких концентрациях по сравнению с комбинацией двух моноспецифических антител (например, в анализе ангиогенеза роговицы мыши Примера 8 максимальный антиангиогенный эффект был уже достигнут при 10 мг/кг XMAb1 по сравнению с комбинацией 10 мг/кг ANG2i-LC06+10 мг/кг авастина).

Описание графических материалов

Фиг.1. Примерный формат двухвалентного биспецифического антитела для примеров XMab, включающий домены СН3, модифицированные как выступы-во-впадины.

Фиг.2а. Примерный формат двухвалентного биспецифического антитела для примеров OAscFab, включающий домены СН3, модифицированные как выступы-во-впадины.

Фиг.2b. Примерный формат двухвалентного биспецифического антитела для примера OAscXFab1, включающий домены СН3, модифицированные как выступы-во-впадины.

Фиг.2с. Примерный формат двухвалентного биспецифического антитела для примеров OAscXFab2 и OAscXFab3, включающий домены СН3, модифицированные как выступы-во-впадины.

Фиг.3. Одновременное связывание <VEGF-Ang-2> XMab1 с VEGF (первая стадия) с последующим связыванием с hAng-2 (вторая стадия).

Фиг.4. Принцип ELISA для количественного определения связывания активных антител mAb <Ang2/VEGF>.

Фиг.5. Калибровочная кривая ELISA для количественного определения связывания активных антител <Ang2/VEGF>XMab1.

Фиг.6. Анализ ангиогенеза роговицы мыши - ингибирование прорастания сосудов из лимба роговицы в направлении градиента VEGF введением биспецифического антитела в соответствии с изобретением.

Фиг.7. Анализ ангиогенеза роговицы мыши - ингибирование ангиогенеза/прорастания сосудов из лимба роговицы в направлении градиента VEGF введением биспецифического антитела в соответствии с изобретением - сравнение биспецифического антитела <Ang2/VEGF>XMab1, <Ang2>Mab ANG2i-LC06 (LC06), <VEGF>Mab бевацизумаба (авастина) и комбинации ANG2i-LC06 и <VEGF>Mab бевацизумаба (авастина).

Фиг.8. Ингибирование опухолевого роста in vivo в ксенотрансплантате мыши колоректального рака человека Colo205 (мелкие опухоли) биспецифическим антителом в соответствии с изобретением - сравнение биспецифического антитела <Ang2/VEGF>XMab1, <Ang2>Mab ANG2i-LC06 (LC06), <VEGF>Mab бевацизумаба (авастина) и комбинации ANG2i-LC06 и <VEGF>Mab бевацизумаба (авастина).

Фиг.9. Ингибирование опухолевого роста in vivo в ксенотрансплантате мыши колоректального рака человека Colo205 (большие опухоли) биспецифическим антителом в соответствии с изобретением - сравнение биспецифического антитела <Ang2/VEGF>XMab1, <Ang2>Mab ANG2i-LC06 (LC06),<VEGF>Mab бевацизумаба (авастина) и комбинации ANG2i-LC06 и <VEGF>Mab бевацизумаба (авастина).

Фиг. 10. Ингибирование опухолевого роста in vivo в ксенотрансплантате мыши рака молочной железы человека KPL-4 (мелкие опухоли) биспецифическим антителом в соответствии с изобретением - сравнение биспецифического антитела <Ang2/VEGF> XMab1, <Ang2> Mab ANG2i-LC06 (LC06), <VEGF> Mab бевацизумаба (авастина) и комбинации ANG2i-LC06 и <VEGF> Mab бевацизумаба (авастина).

Фиг. 11. Ингибирование опухолевого роста in vivo в ксенотрансплантате мыши рака молочной железы человека KPL-4 (большие опухоли) биспецифическим антителом в соответствии с изобретением - сравнение биспецифического антитела <Ang2/VEGF> XMab1, <Ang2> Mab ANG2i-LC06 (LC06), <VEGF> Mab бевацизумаба (авастина) и комбинации ANG2i-LC06 и <VEGF> Mab бевацизумаба (авастина).

Фиг. 12. Ингибирование опухолевого роста in vivo в ксенотрансплантате мыши рака желудка N87 биспецифическим антителом в соответствии с изобретением - сравнение биспецифического антитела <Ang2/VEGF> XMab1, <Ang2> Mab ANG2i-LC06 (LC06), <VEGF> Mab бевацизумаба (авастина) и комбинации ANG2i-LC06 и <VEGF> Mab бевацизумаба (авастина).

Фиг. 13. Ингибирование опухолевого роста in vivo в ксенотрансплантате колоректального рака Colo205 антителом XMab1 8 мг/кг и комбинацией антител LC06 и авастина (по 4 мг/кг).

Подробное описание изобретения

Изобретение направлено на биспецифическое, двухвалентное антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается с VEGF человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается с ANG-2 человека. Характеризующееся тем, что

i) первый антигенсвязывающий сайт содержит в качестве вариабельного домена тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 1 и в качестве вариабельного домена легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 2; и

ii) второй антигенсвязывающий сайт содержит в качестве вариабельного домена тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 3 и в качестве вариабельного домена легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 4.

В одном аспекте изобретения биспецифическое антитело в соответствии с изобретением характеризуется содержанием

a) тяжелой цепи и легкой цепи первого полноразмерного антитела, которое специфично связывается с VEGF;

b) модифицированной тяжелой цепи и модифицированной легкой цепи полноразмерного антитела, которое специфично связывается с ANG-2, где константные домены CL и СН1 заменены друг другом.

Данный формат биспецифического, двухвалентного антитела для биспецифического антитела, специфично связывающегося с фактором роста эндотелия сосудов человека (VEGF) и ангиопоэтином-2 (ANG-2) человека, описан в WO 2009/080253 (см. примерную схему при включении доменов СН3, модифицированных как выступы-во-впадины, на Фиг.1). Антитела, основанные на данном формате биспецифического, двухвалентного антитела, названы ХМаЬ в примерах настоящего изобретения.

В одной форме осуществления такое биспецифическое, двухвалентное антитело характеризуется содержанием

a) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:7 в качестве тяжелой цепи первого полноразмерного антитела и аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5 в качестве легкой цепи первого полноразмерного антитела, и

b) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:8 в качестве модифицированной тяжелой цепи второго полноразмерного антитела и аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6 в качестве модифицированной легкой цепи второго полноразмерного антитела.

В одной форме осуществления такое биспецифическое, двухвалентное антитело характеризуется содержанием

a) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:11 в качестве тяжелой цепи первого полноразмерного антитела и аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9 в качестве легкой цепи первого полноразмерного антитела, и

b) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12 в качестве модифицированной тяжелой цепи второго полноразмерного антитела и аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10 в качестве модифицированной легкой цепи второго полноразмерного антитела.

В одной форме осуществления такое биспецифическое, двухвалентное антитело характеризуется содержанием

a) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:15 в качестве тяжелой цепи первого полноразмерного антитела и аминокислотной последовательности SEQ ID NO:13 в качестве легкой цепи первого полноразмерного антитела, и

b) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:16 в качестве модифицированной тяжелой цепи второго полноразмерного антитела и аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14 в качестве модифицированной легкой цепи второго полноразмерного антитела.

В одной форме осуществл