Платформы доставки антигенов

Платформы доставки антигенов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННАЯ ЗАЯВКА

[01] По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США, No. 61/391960, поданной 11 октября 2010 г., полное объяснение содержания которой приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[02] Вирусы герпеса широко распространены и вызывают у человека широкий ряд заболеваний, которые в худших случаях могут приводить к значительной заболеваемости и смертности, в первую очередь, у индивидуумов с иммунной недостаточностью (например, реципиентов трансплантатов и ВИЧ-инфицированных индивидуумов). Люди являются чувствительными к инфекции по меньшей мере восемью вирусами герпеса. Вирус простого герпеса-1 (HSV-1, HHV-1), вирус простого герпеса-2 (HSV-2, HHV-2) и вирус ветряной оспы (VZV, HHV-3) являются вирусами альфа-подсемейства, цитомегаловирус (CMV, HHV-5) и розеоловирус (HHV-6 и HHV-7) являются вирусами бета-подсемейства, вирус Эпштейна-Барра (EBV, HHV-4) и ассоциированный с саркомой Капоши вирус герпеса (KSHV, HHV-8) являются вирусами гамма-подсемейства, инфицирующими человека.

[03] Инфекция CMV приводит к значительной заболеваемости и смертности у индивидуумов с иммунной недостаточностью (например, реципиентов трансплантатов и ВИЧ-инфицированных индивидуумов), и врожденная инфекция может приводить к разрушительным дефектам в неврологическом развитии новорожденных. Гликопротеины gB, gH, gL, gM и gN оболочки CMV являются привлекательными кандидатами для вакцины, поскольку они экспрессированы на поверхности вируса и могут вызывать защитные нейтрализующие вирус гуморальные иммунные ответы. Несколько стратегий вакцин против CMV были нацелены на главный поверхностный гликопротеин B (gB), который может индуцировать доминантный ответ антител. (Go and Pollard, JID 197: 1631-1633 (2008)). Гликопротеин gB CMV может индуцировать ответ нейтрализующих антител, и большая фракция антител, нейтрализующих инфекцию фибробластов, в сыворотке от CMV-положительных пациентов направлена против gB (Britt 1990). Подобным образом, опубликовано, что gH и gM/gN являются мишенями для иммунного ответа на природную инфекцию (Urban et al (1996) J. Gen. Virol. 77(Pt. 7): 1537-47; Mach et al (2000) J. Virol. 74(24): 11881-92).

[04] Комплексы белков CMV также являются привлекательными кандидатами для вакцины, поскольку они, по-видимому, вовлечены в важные процессы в жизненном цикле вируса. Например, комплекс gH/gL/gO, по-видимому, играет значительные роли в проникновении как в фибробласты, так и в эпителиальные/эндотелиальные клетки. Наиболее распространенная модель предполагает, что комплекс gH/gL/gO опосредует инфекцию фибробластов. hCMV gO-нуль-мутанты образуют небольшие бляшки на фибробластах и очень низкий титр вируса, что указывает на роль в проникновении (Dunn (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:14223-28; Hobom (2000) J. Virol. 74:7720-29). Недавние исследования позволяют предполагать, что gO не включается в вирионы с gH/gL, но может действовать как молекулярный шаперон, увеличивая экспорт gH/gL из ER к аппарату Гольджи и включение в вирионы (Ryckman (2009) J. Virol 82:60-70). В ходе экспериментов с вытеснением метки показано, что небольшие количества gO остаются связанными с gH/gL в течение длительных периодов времени, но большинство gO диссоциирует и/или деградирует из комплекса gH/gL/gO, поскольку он не обнаружен во внеклеточных вирионах или секретированным из клеток. Когда gO делетировали из клинического штамма CMV (TR), эти вирусные частицы обладали значительно сниженными количествами gH/gL, включенных в вирион. Кроме того, gO, делетированный из вируса TR, также ингибировал проникновение в эпителиальные и эндотелиальные клетки, что позволяет предполагать, что gH/gL также необходимы для проникновения в эпителиальные/эндотелиальные клетки (Wille (2010) J. Virol. 84(5):2585-96).

[05] gH/gL CMV могут также ассоциировать с UL128, UL130 и UL131A (обозначенным в настоящем документе как UL131) и формировать пентамерный комплекс, который необходим для проникновения в несколько типов клеток, включая эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки и дендритные клетки (Hahn et al (2004) J. Virol. 78(18): 10023-33; Wang and Shenk (2005) Proc. Natl. Acad. Sci USA 102(50): 18153-8; Gerna et al (2005). J. Gen. Virol. 84(Pt 6): 1431-6; Ryckman et al (2008) J. Virol. 82:60-70). В отличие от этого, этот комплекс не является необходимым для инфекции фибробластов. Лабораторные изоляты hCMV несут мутации в локусе UL128-UL131, и мутации возникают в клинических изолятах после только небольшого количества пассажей на культивируемых фибробластах (Akter et al (2003) J. Gen. Virol. 84(Pt 5): 1117-22). В ходе природной инфекции пентамерный комплекс вызывает образование антител, нейтрализующих инфекцию эпителиальных клеток, эндотелиальных клеток (и, по-видимому, любого другого типа клеток, где пентамерный комплекс опосредует проникновение вируса) с очень высокой активностью (Macagno et al (2010) J. Virol. 84(2): 1005-13). Также, по-видимому, антитела к этому комплексу вносят значительный вклад в способность сыворотки человека нейтрализовывать инфекцию эпителиальных клеток (Genini et al (2011) J. Clin. Virol. 52(2): 113-8).

[06] В US 5767250 описаны способы получения конкретных комплексов белков CMV, содержащих gH и gL. Комплексы получают введением конструкции ДНК, кодирующей gH, и конструкции ДНК, кодирующей gL, в клетку, так что gH и gL экспрессируются совместно.

[07] В WO 2004/076645 описаны рекомбинантные молекулы ДНК, кодирующие белки CMV. Согласно этому документу, комбинации отдельных молекул ДНК, кодирующих различные белки CMV, можно вводить в клетки, чтобы вызывать совместную экспрессию кодируемых белков CMV. Когда gM и gN совместно экспрессировали таким образом, они формировали комплекс с дисульфидными связями. У кроликов, иммунизированных конструкциями ДНК, образующими комплекс gM/gN, или конструкцией ДНК, кодирующей gB, получали эквивалентные ответы нейтрализующих антител.

[08] Существует необходимость в нуклеиновых кислотах, кодирующих два или более белка вируса герпеса, в способах экспрессии двух или более белков вируса герпеса в одной и той же клетке, и в способах иммунизации, приводящих к лучшим иммунным ответам.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[09] Изобретение относится к платформам для совместной доставки к клеткам двух или более белков вируса герпеса, таких как белки цитомегаловируса (CMV), в частности, белков, формирующих комплексы in vivo. В одном аспекте изобретение относится к молекулам рекомбинантной полицистронной нуклеиновой кислоты, содержащим первую последовательность, кодирующую первый белок вируса герпеса (например, CMV) или его фрагмент, и вторую последовательность, кодирующую второй белок вируса герпеса (например, CMV) или его фрагмент.

[10] Например, изобретение относится к самореплицирующейся молекуле РНК, содержащей полинуклеотид, который содержит a) первую нуклеотидную последовательность, кодирующую первый белок или его фрагмент из вируса герпеса; и b) вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую второй белок или его фрагмент из вируса герпеса. Первая нуклеотидная последовательность и вторая нуклеотидная последовательность являются функционально связанными с одним или несколькими контрольными элементами, так что когда самореплицирующуюся молекулу РНК вводят в подходящую клетку, первый и второй белки вируса герпеса или их фрагменты продуцируются в количестве, достаточном для формирования в клетке комплекса, содержащего первый и второй белки или фрагменты. Предпочтительно, первый белок и второй белок не являются одним и тем же белком или фрагментами одного и того же белка, первый белок не является фрагментом второго белка, и второй белок не является фрагментом первого белка. Первая нуклеотидная последовательность может являться функционально связанной с первым контрольным элементом, и вторая нуклеотидная последовательность может являться функционально связанной со вторым контрольным элементом.

[11] Самореплицирующаяся молекула РНК может дополнительно содержать третью нуклеотидную последовательность, кодирующую третий белок или его фрагмент из указанного вируса герпеса, необязательно, четвертую нуклеотидную последовательность, кодирующую четвертый белок или его фрагмент из указанного вируса герпеса; и необязательно пятую нуклеотидную последовательность, кодирующую пятый белок или его фрагмент из указанного вируса герпеса. Когда присутствуют последовательности, кодирующие дополнительные белки или фрагменты из вируса герпеса, (т.е. третья, четвертая и пятая нуклеотидные последовательности), они являются функционально связанными с одним или более контрольными элементами. В одном из примеров пентацистронной конструкции первая нуклеотидная последовательность является функционально связанной с первым контрольным элементом, вторая нуклеотидная последовательность является функционально связанной со вторым контрольным элементом, третья нуклеотидная последовательность является функционально связанной с третьим контрольным элементом, четвертая нуклеотидная последовательность является функционально связанной с четвертым контрольным элементом, и пятая нуклеотидная последовательность является функционально связанной с пятым контрольным элементом. Контрольные элементы, присутствующие в конструкции (например, первый, второй, третий, четвертый и пятый контрольные элементы) могут являться независимо выбранными из группы, состоящей из субгеномного промотора, IRES и участка 2A вируса (например, FMDV).

[12] Вирус герпеса может представлять собой HSV-1, HSV-2, VZV, EBV типа 1, EBV типа 2, CMV, HHV-6 типа A, HHV-6 типа B, HHV-7 и HHV-8. В некоторых вариантах осуществления молекула рекомбинантной полицистронной нуклеиновой кислоты (например, самореплицирующаяся РНК) кодирует gH или его фрагмент и gL или его фрагмент из любого из этих вирусов герпеса. В более конкретных вариантах осуществления вирус герпеса представляет собой CMV или VZV.

[13] Когда молекула рекомбинантной полицистронной нуклеиновой кислоты (например, самореплицирующаяся РНК) кодирует два или более белка VZV, белки могут являться выбранными из группы, состоящей из gB, gE, gH, gI, gL и их фрагмента (например, по меньшей мере из 10 аминокислот). В некоторых вариантах осуществления молекула рекомбинантной полицистронной нуклеиновой кислоты (например, самореплицирующаяся РНК) кодирует VZV gH или его фрагмент и VZV gL или его фрагмент.

[14] В конкретном примере изобретение относится к самореплицирующейся молекуле РНК, содержащей полинуклеотид, который содержит a) первую последовательность, кодирующую первый белок цитомегаловируса (CMV) или его фрагмент; и b) вторую последовательность, кодирующую второй белок CMV или его фрагмент. Первая последовательность и вторая последовательность являются функционально связанными с одним или более контрольными элементами, так что когда самореплицирующуюся молекулу РНК вводят в подходящую клетку, первый и второй белки CMV продуцируются в количестве, достаточном для формирования в клетке комплекса, содержащего первый и второй белки CMV или их фрагменты.

[15] Первый белок CMV и второй белок CMV являются независимо выбранными из группы, состоящей из gB, gH, gL; gO; gM, gN; UL128, UL130, UL131 и фрагмента любого из вышеуказанных. Предпочтительно, первый белок CMV и второй белок CMV не являются одним и тем же белком или фрагментами одного и того же белка, первый белок CMV не является фрагментом второго белка CMV, и второй белок CMV не является фрагментом первого белка CMV. Если желательно, самореплицирующаяся молекула РНК может дополнительно содержать третью последовательность, кодирующую третий белок CMV, где третья последовательность является функционально связанной с контрольным элементом. Сходным образом, можно включать дополнительные последовательности, кодирующие дополнительные белки CMV (например, четвертую последовательность, кодирующую четвертый белок CMV, пятую последовательность, кодирующую пятый белок CMV). Контрольные элементы могут являться независимо выбранными из группы, состоящей из субгеномного промотора и IRES, и участка 2A вируса.

[16] В некоторых вариантах осуществления самореплицирующаяся молекула нуклеиновой кислоты кодирует белки gH и gL CMV. В других вариантах осуществления самореплицирующаяся молекула РНК кодирует белки gH, gL и gO CMV. В других вариантах осуществления самореплицирующаяся молекула РНК кодирует белки gH, gL, UL128, UL130 и UL131 CMV.

[17] Самореплицирующиеся молекулы РНК могут представлять собой репликон альфавируса. В таких случаях репликон альфавируса можно доставлять в форме частицы репликона альфавируса (VRP). Самореплицирующаяся молекула РНК может также присутствовать в форме «голой» молекулы РНК.

[18] Изобретение также относится к молекуле рекомбинантной ДНК, кодирующей самореплицирующуюся молекулу РНК, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная молекула ДНК представляет собой плазмиду. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная молекула ДНК включает промотор млекопитающих, управляющий транскрипцией кодированной самореплицирующейся молекулы РНК.

[19] Изобретение также относится к композиции, содержащей самореплицирующуюся молекулу РНК, как описано в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель. Самореплицирующаяся молекула РНК может являться «голой». В некоторых вариантах осуществления композиция содержит самореплицирующуюся молекулу РНК, кодирующую белки gH и gL CMV. В других вариантах осуществления композиция дополнительно содержит самореплицирующуюся молекулу РНК, кодирующую белок gB CMV. Композиция может также содержать систему доставки РНК, такую как липосома, полимерная наночастица, катионная наноэмульсия масло-в-воде или их комбинации. Например, самореплицирующаяся молекула РНК может являться инкапсулированной в липосому.

[20] В конкретных вариантах осуществления композиция содержит VRP, содержащую репликон альфавируса, кодирующий два или более белков CMV. В некоторых вариантах осуществления VRP содержит репликон, кодирующий gH и gL CMV. Если желательно, композиция может дополнительно содержать вторую VRP, содержащую репликон, кодирующий gB CMV. Композиция может также содержать адъювант.

[21] Изобретение также относится к способам формирования комплекса белков CMV. В некоторых вариантах осуществления самореплицирующуюся РНК, кодирующую два или более белка CMV, доставляют в клетку, где клетку поддерживают в условиях, подходящих для экспрессии белков CMV, где формируется комплекс белков CMV. В других вариантах осуществления VRP, содержащую самореплицирующуюся РНК, кодирующую два или более белков CMV, доставляют в клетку, где клетку поддерживают в условиях, подходящих для экспрессии белков CMV, где формируется комплекс белков CMV. Способ можно использовать для формирования комплекса белков CMV в клетке in vivo.

[22] Изобретение также относится к способу индукции иммунного ответа у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления самореплицирующуюся РНК, кодирующую два или более белка CMV, вводят индивидууму. Самореплицирующуюся молекулу РНК можно вводить в форме композиции, содержащей систему доставки РНК, такую как липосома. В других вариантах осуществления VRP, содержащую самореплицирующуюся РНК, кодирующую два или более белка CMV, вводят индивидууму. В предпочтительных вариантах осуществления самореплицирующаяся молекула РНК кодирует белки gH и gL CMV. Предпочтительно, индуцированный иммунный ответ включает в себя продукцию нейтрализующих антител против CMV. Более предпочтительно, нейтрализующие антитела являются независимыми от комплемента.

[23] Изобретение также относится к способу ингибирования проникновения CMV в клетку, включающему в себя контакт клетки с самореплицирующейся молекулой РНК, кодирующей два или более белка CMV, таких как gH и gL. Клетка может являться выбранной из группы, состоящей из эпителиальной клетки, эндотелиальной клетки, фибробласта и их сочетаний. В некоторых вариантах осуществления клетку приводят в контакт с VRP, содержащей самореплицирующуюся РНК, кодирующую два или более белка CMV.

[24] Изобретение также относится к применению самореплицирующейся молекулы РНК, кодирующей два или более белка CMV (например, VRP, композиция, содержащая самореплицирующуюся молекулу РНК и липосому), формирующих комплекс белков CMV в клетке, для индукции иммунного ответа или для ингибирования проникновения CMV в клетку.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

[25] Фиг. 1 представляет собой схему CMV, указывающую известные комплексы гликопротеинов, вовлеченные в проникновение CMV в клетки-мишени. Гликопротеины оболочки представляют собой привлекательные кандидаты для вакцин, поскольку они экспрессируются на вирусной поверхности и могут вызывать защитные и долговременные нейтрализующие вирус гуморальные иммунные ответы. Структурные гликопротеины, опосредующие эти процессы, можно разделить на два класса: гликопротеины, которые являются консервативными в семействе вируса герпеса, и гликопротеины, которые не являются консервативными. Среди тех, которые являются консервативными, присутствуют gB, gH, gL, gM и gN. Многие из этих гликопротеинов формируют комплексы друг с другом (gH/gL/±gO; gH/gL/UL128/UL130/UL131; gM/gN) для облегчения локализации на вирусной поверхности и для осуществления их функций в присоединении вируса, проникновении вируса и слиянии клеток.

[26] Фиг. 2A-2F представляют собой схемы конструкций CMV. Фиг. 2A, схемы конструкций gB («gB FL», полноразмерный gB; растворимые gB «gB sol 750» и «gB sol 692»), описанные в примере 1. Сконструированы два различных растворимых варианта gB; в gB sol 750 отсутствует трансмембранный домен и цитоплазматический домен, в gB sol 692 также отсутствует гидрофобная область, и он является сходным с gB sol, описанным в Reap et al. (2007) Clin. Vacc. Immunol. 14:748-55. Фиг. 2B, схема векторов с репликоном gB, использованных для получения частиц для репликации вируса (VRP). Фиг. 2C, схемы конструкций gH («gH FL», полноразмерный gH; растворимый gH «gH sol»), описанных в примере 1. Сконструирован один растворимый вариант gH с отсутствующим трансмембранным доменом. Фиг. 2D, схема векторов с репликоном gH, использованных для получения VRP. Фиг. 2E, схема конструкции gL, описанной в примере 1. Фиг. 2F, схема вектора с репликоном gL, использованного для получения VRP. На фиг. 2B, 2D и 2F, «NSP1», «NSP2», «NSP3» и «NSP4» представляют собой неструктурные белки альфавируса 1-4, соответственно, необходимые для репликации вируса.

[27] На фиг. 3A и 3B показано, что у мышей, иммунизированных VRP gB (FL, sol 750, sol 692) или gH (FL, sol), индуцированы ответы антител, которые являлись нейтрализующими в присутствии комплемента морской свинки. Анализ нейтрализации проводили посредством предварительной инкубации штамма TB40UL32E-GFP вируса CMV (кодирующего усиленный зеленый флуоресцентный белок-GFP, Sampaio et al (2005) J. Virol. 79(5):2754-67), с сывороткой мыши и комплементом морской свинки перед инфекцией эпителиальных клеток ARPE-19. Через пять суток после инфекции определяли количество положительных по GFP клеток. Фиг. 3A, кривые разведений сыворотки для всех сывороток, проанализированных в клетках ARPE-19 в присутствии комплемента. Фиг. 3B, титры 50% нейтрализации для образцов сыворотки. Для вируса, инкубированного с преиммунной сывороткой, получили низкую нейтрализацию при низких разведениях (1:40-1:80). Сыворотка против gB (FL, sol 750, sol 692) обладала очень сильной нейтрализующей активностью с титрами 50% нейтрализации между 1:1800-1:2100. Для всех иммунизированных gB мышей получили сходный профиль нейтрализации. Сыворотка против gH (FL, sol) обладала нейтрализующей активностью с титрами 50% нейтрализации приблизительно 1:160. См. пример 1.

[28] Фиг. 4A представляет собой схематическую иллюстрацию моноцистронных репликонов, кодирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP) или красный флуоресцентный белок (mCherry), и бицистронного репликона, кодирующего GFP и mCherry. «NSP1», «NSP2», «NSP3» и «NSP4» представляют собой неструктурные белки альфавируса 1-4, соответственно. Система полицистронного репликона альфавируса разработана посредством выполнения модификаций существующей системы репликона альфавируса для размещения множества субгеномных промоторов, управляющих интересующими генами.

[29] Фиг. 4B представляет собой графики флуоресценции, показывающие анализ FACS клеток BHKV, инфицированных VRP, содержащими моно- и бицистронные РНК. Для полицистронных VRP альфавируса получили больше клеток, экспрессирующих оба интересующих гена в приблизительно равных количествах (GFP и mCherry; 72,48%), чем при совместной инфекции GFP VRP + mCherry VRP (26,30%). См. пример 2.

[30] Фиг. 5A представляет собой схематическую иллюстрацию конструкции полицистронного репликона альфавируса, кодирующего gH/gL и gH/gL/gO.

[31] На фиг. 5B показано, что gH/gL формируют комплекс in vitro. VRP, содержащие репликоны, кодирующие gH, gL, gO, gH/gL или gH/gL/gO, получали в клетках BHKV. Полученные VRP использовали для инфекции клеток ARPE-19, чтобы продемонстрировать формирование комплекса in vitro. Инфицированные альфавирусом клетки ARPE-19 собирали и анализировали по присутствию gH и gL. Клетки ARPE-19, инфицированные VRP, кодирующими gH/gL, продуцировали комплексы gH/gL с дисульфидными связями (см. в отсутствие DTT, нагрева). gO не изменял ассоциацию gH/gL до поддающейся детекции степени. На блоте слева показана экспрессия белка gH. На блоте справа показана экспрессия белка gL. Маркеры молекулярной массы показаны между блотами. ● = мономерный gH, ●● = мономерный gL, < = гетеродимер (gH + gL), * = димер из гетеродимеров.

[32] На фиг. 5C показана иммунопреципитация комплексов gH и gH/gL из клеток BHKV, инфицированных VRP. Иммунопреципитацию проводили с использованием антител IgG мыши в качестве контроля (дорожки 2, 4, 7 и 10) или антител мыши против gH (Genway) для иммунопреципитации gH (дорожки 3, 5, 8 и 11). Вестерн-блоттинги проводили с использованием слитых вместе антитела кролика против gL и антитела кролика против gH. На дорожках 1, 6 и 9 показан белок gH (верхняя полоса ~75 кДа) и белок gL (нижняя полоса ~ 30 кДа) для контроля. Дорожки 2 и 3 представляют собой лизаты после инфекции gH-VRP. На дорожке 2 показано, что контрольное антитело не иммунопреципитировало gH. На дорожке 3 показан gH, иммунопреципитированный антителом против gH. Дорожки 4 и 5 получены из лизатов после инфекции только gL-VRP. Не присутствовало иммунопреципитации белка gH. Дорожки 7 и 8 получены из лизатов после инфекции бицистронной gH/gL-VRP. На дорожке 8 показано, что gL являлся иммунопреципитированным с использованием антитела против gH. (См. звездочку). Дорожки 10 и 11 получены из лизатов после инфекции трицистронной gH/gL/gO-VRP. На дорожке 11 показано, что gL являлся иммунопреципитированным с использованием антитела против gH. (См. звездочку). Показаны также маркеры молекулярной массы (MW). См. пример 3.

[33] На фиг. 6 показано, что VRP, которые приводят к формированию комплекса gH/gL in vitro, индуцируют сильный иммунный ответ на CMV, который качественно и количественно превосходит ответ на VRP gB. На фиг. 6A и фиг. 6B показаны кривые разведений сыворотки для мышей, иммунизированных VRP gH, gL, gO, gH+gL, gH+gL+gO, gH/gL и gH/gL/gO, при нейтрализации инфекции TB40-UL32-EGFP клеток ARPE-19 в присутствии (фиг. 6A) или в отсутствие (фиг. 6B) комплемента. Различные разведения сыворотки преинкубировали с TB40UL32E-GFP в присутствии или в отсутствие комплемента морской свинки и затем добавляли к эпителиальным клеткам ARPE-19. После 5 суток инфекции вирусом GFP-положительные клетки подсчитывали. Фиг. 6C представляет собой график, показывающий титры 50% нейтрализации, полученные в присутствии и в отсутствие комплемента. «3wp3», три недели после третьей иммунизации. VRP, экспрессирующие отдельные белки CMV (VRP gH, gL, gO или совместно введенные VRP gH, gL и gO), не усиливали нейтрализующую активность выше активности одного gH. В отличие от этого, для сыворотки от мышей, иммунизированных бицистронными VRP gH/gL или трицистронными VRP gH/gL/gO, показали сильные нейтрализующие ответы. Более того, сильные нейтрализующие ответы являлись сходными в присутствии и в отсутствие комплемента морской свинки, показывая, что полицистронные VRP успешно индуцировали независимый от комплемента иммунный ответ. См. пример 4.

[34] На фиг. 7 показано, что VRP, которые влияют на формирование комплекса gH/gL in vitro, индуцировали антитела, которые активно нейтрализовали инфекцию клеток фибробластов MRC-5. На фиг. 7A показаны кривые разведений сыворотки для мышей, иммунизированных VRP gH, gL, gO, gH+gL, gH+gL+gO, gH/gL и gH/gL/gO, для клеток MRC-5 в отсутствие комплемента. Различные разведения сыворотки преинкубировали с TB40GFP в присутствии или в отсутствие комплемента морской свинки и затем добавляли к клеткам фибробластам MRC-5. После 5 суток инфекции вирусом GFP-положительные клетки подсчитывали. Фиг. 7B представляет собой график, показывающий титры 50% нейтрализации, полученные в модели клеток фибробластов MRC-5 в отсутствие комплемента. «3wp3», три недели после третьей иммунизации. VRP, экспрессирующие отдельные белки CMV (VRP gH, gL, gO или совместно введенные VRP gH, gL и gO), не усиливали нейтрализующую активность выше активности одного gH. В отличие от этого, для сыворотки от мышей, иммунизированных бицистронными VRP gH/gL или трицистронными VRP gH/gL/gO, показали необычайно сильные нейтрализующие ответы. См. пример 4.

[35] Фиг. 8A и 8B представляют собой графики, показывающие, что нейтрализующие антитела, индуцированные посредством доставки полицистронных VRP, являлись перекрестно нейтрализующими антителами. Сыворотки от мышей, иммунизированных VRP gH/gL и gH/gL/gO, являлись способными нейтрализовывать клинические штаммы CMV TB40UL32E-GFP и VR1814 как в эпителиальных клетках ARPE-19 (фиг. 8A), так и в клетках фибробластах MRC-5 (фиг. 8B) в отсутствие комплемента морской свинки в анализе нейтрализации IE-1.

[36] Фиг. 9 представляет собой график, показывающий, что нейтрализующие антитела, вызванные в ответ на gH FL/gL, являются независимыми от комплемента и сходными по титру с природным иммунитетом. Мышей иммунизировали VRP gB FL или VRP gH FL/gL при 1×10⁶ ИЕ, 3 раза, с интервалом 3 недели до последнего забора крови. Сыворотку анализировали по способности нейтрализовывать инфекцию TB40UL32E-EGFP CMV клеток ARPE-19 в присутствии и в отсутствие комплемента морской свинки в анализе нейтрализации. В отличие от антител, вызванных в ответ на gB, антитела, вызванные в ответ на gH FL/gL, являются независимыми от комплемента. Более того, антитела против gH FL/gL у этих вакцинированных мышей, являлись сходными по титру с антителами, обнаруженными у естественным образом инфицированных субъектов-людей.

[37] На фиг. 10 показана карта плазмиды для pVCR, модифицированной gH-SGPgL-SGPgO.

[38] На фиг. 11 показана карта плазмиды для pVCR, модифицированной gH-SGPgL.

[39] На фиг. 12 показана карта плазмиды для pVCR, модифицированной gH sol-SGPgL.

[40] На фиг. 13 показана карта плазмиды для pVCR, модифицированной gH sol-SGPgL-SGPgO.

[41] На фиг. 14A-14G показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:___) плазмиды, кодирующей самореплицирующуюся молекулу РНК A160, кодирующую поверхностный гликопротеин H (gH) CMV и поверхностный гликопротеин L (gL) CMV. Нуклеотидные последовательности, кодирующие gH и gL, подчеркнуты.

[42] На фиг. 15A-15H показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:___) плазмиды, кодирующей самореплицирующуюся молекулу РНК A322, кодирующую растворимую форму поверхностного гликопротеина H (gHsol) CMV и поверхностного гликопротеина L (gL) CMV. Нуклеотидные последовательности, кодирующие gHsol и gL, подчеркнуты.

[43] На фиг. 16A-16H показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:___) плазмиды, кодирующей самореплицирующуюся молекулу РНК A323, кодирующую поверхностный гликопротеин B (gB) CMV. Нуклеотидная последовательность, кодирующая gB, подчеркнута.

[44] Фиг. 17A и 17B представляют собой гистограммы, показывающие титры 50% нейтрализации сывороток от мышей, которых иммунизировали VRP или самореплицирующейся РНК. На фиг. 17A показаны титры 50% нейтрализации против CMV человека штамма TB40UL32E-EGFP («TB40») на клетках ARPE-19, и на фиг. 17B показаны титры 50% нейтрализации против CMV человека штамма 8819 на клетках ARPE-19.

[45] Фиг. 18 представляет собой схему пентацистронных РНК репликонов A526, A527, A554, A555 и A556, кодирующих пять белков CMV. Субгеномные промоторы показаны стрелками, другие контрольные элементы подписаны.

[46] Фиг. 19 представляет собой гистограмму флуоресценции, показывающую, что клетки BHKV, трансфицированные РНК репликоном A527, экспрессируют пентамерный комплекс gH/gL/UL128/UL130/UL131. Окрашивание клеток проводили с использованием антител, которые связывают конформационный эпитоп, присутствующий в пентамерном комплексе (Macagno (2010) J. Virol. 84(2): 1005-13).

[47] Фиг. 20 представляет собой схему и график. На схеме показаны бицистронные РНК репликоны, A160 и A531-A537, кодирующие gH и gL CMV. На графике показана нейтрализующая активность иммунной сыворотки от мышей, иммунизированных VRP, содержащими репликоны.

[48] Фиг. 21 представляет собой график, показывающий ответ антител против белка VZV в иммунной сыворотке от мышей, иммунизированных моноцистронными РНК репликонами, кодирующими белки VZV, или бицистронными РНК репликонами, кодирующими VZV gE и gI, или gH и gL. Мышей иммунизировали 7 мкг РНК, составленной с CNE (см. пример 7).

[49] Фиг. 22 представляет собой график, показывающий ответ антител против белка VZV в иммунной сыворотке от мышей, иммунизированных моноцистронными РНК репликонами, кодирующими белки VZV, или бицистронными РНК репликонами, кодирующими VZV gE и gI, или gH и gL. Мышей иммунизировали 1 мкг РНК, составленной с CNE (см. пример 7).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[50] Изобретение относится к платформам для совместной доставки белков вируса герпеса, таких как белки цитомегаловируса (CMV), к клеткам, в частности белков, формирующих комплексы in vivo. В некоторых вариантах осуществления эти белки и сформированные ими комплексы могут вызывать образование сильных нейтрализующих антител. Иммунный ответ, вызываемый совместной доставкой белков вируса герпеса (например, CMV), в частности, белков, формирующих комплексы in vivo (например, gH/gL), может превосходить иммунный ответ, полученный с использованием других способов. Например, молекула РНК (например, репликон), кодирующая как gH, так и gL CMV, может индуцировать лучшие нейтрализующие титры и/или защитный иммунитет по сравнению с молекулой РНК, кодирующей gB, молекулой РНК, кодирующей gH, молекулой РНК, кодирующей gL, или даже смесью молекул РНК, по отдельности кодирующих gH или gL. Кроме того, репликон, кодирующий gH/gL/UL128/UL130/UL131, может обеспечивать ответы, превосходящие ответы на репликон, кодирующий только gH/gL.

[51] В общем аспекте изобретение относится к платформам для доставки двух или более белков вируса герпеса (например, CMV) к клеткам. Платформы включают в себя молекулы рекомбинантной полицистронной нуклеиновой кислоты, содержащие первую последовательность, кодирующую первый белок вируса герпеса (например, CMV) или его фрагмент, и вторую последовательность, кодирующую второй белок вируса герпеса (например, CMV) или его фрагмент. Если желательно, одна или более дополнительных последовательностей, кодирующих дополнительные белки, например, третий белок вируса герпеса (например, CMV) или его фрагмент, четвертый белок вирус герпеса (например, CMV) или его фрагмент, пятый белок вируса герпеса (например, CMV) или его фрагмент и т.д., может присутствовать в молекуле рекомбинантной полицистронной нуклеиновой кислоты. Последовательности, кодирующие белки вируса герпеса (например, CMV) или их фрагменты являются функционально связанными с одним или несколькими подходящими контрольными элементами, так что белки вируса герпеса (например, CMV) или их фрагменты продуцируются клеткой, содержащей рекомбинантную полицистронную нуклеиновую кислоту.

[52] В полицистронных нуклеиновых кислотах, описанных в настоящем документе, кодированные первый и второй белки вируса герпеса или их фрагменты, и кодированные третий, четвертый и пятый белки вируса герпеса или их фрагменты, если присутствуют, обычно и предпочтительно происходят из одного и того же вируса герпеса. В конкретных примерах все белки вируса герпеса или их фрагменты, кодированные полицистронным вектором, представляют собой белки CMV или белки VZV.

[53] Молекулы рекомбинантной полицистронной нуклеиновой кислоты, описанные в настоящем документе, обеспечивают преимущество доставки последовательностей, кодирующих два или более белков вируса герпеса (например, CMV), в клетку, и управление экспрессией белков вируса герпеса (например, CMV) на достаточных уровнях, чтобы приводить к формированию белкового комплекса, содержащего два или более белков вируса герпеса (например, CMV) in vivo. С использованием этого способа два или более кодированных белков вируса герпеса (например, CMV) можно экспрессировать на достаточных внутриклеточных уровнях для формирования комплексов белков вируса герпеса (например, CMV) (например, gH/gL). Например, кодированные белки вируса герпеса (например, CMV) или их фрагменты можно экспрессировать по существу на одинаковом уровне или, если желательно, на различных уровнях посредством выбора подходящих последовательностей для контроля экспрессии (например, промоторов, IRES, участка 2A и т.д.). Это значительно более эффективный способ получения комплексов белков in vivo, чем совместная доставка двух или более индивидуальных молекул ДНК, кодирующих различные вирусы герпеса (например, CMV), в одну и ту же клетку, что может являться неэффективным и высоко изменчивым. См., например, WO 2004/076645.

[54] Молекула рекомбинантной полицистронной нуклеиновой кислоты может быть основана на любой желательной нуклеиновой кислоте, такой как ДНК (например, плазмидная или вирусная ДНК) или РНК. Любую подходящую ДНК или РНК можно использовать в качестве нуклеиновой кислоты - вектора, несущего открытые рамки считывания, кодирующие белки вируса герпеса (например, CMV) или их фрагменты. Подходящие векторы на основе нуклеиновых кислот обладают способностью нести более одного гена белка и управлять их экспрессией. Такие векторы на основе нуклеиновых кислот известны в данной области и включают в себя, например, плазмиды, ДНК, полученные из ДНК вирусов, таких как векторы из вируса осповакцины (например, NYVAC, см. US 5494807), и векторы из поксвируса (например, вектор канарипокс ALVAC, Sanofi Pasteur), и РНК, полученные из подходящих РНК-вирусов, таких как альфавирус. Если желательно, молекула рекомбинантной полицистронной нуклеиновой кислоты может являться модифицированной, например, содержать модифицированные нуклеиновые основания и/или связи, как описано далее в настоящем документе. Предпочтительно молекула полицистронной нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу РНК.

[55] В некоторых аспектах молекула рекомбинантной полицистронной нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу ДНК, такую как плазмидная ДНК. Такие молекулеры ДНК могут, например, кодировать полицистронный репликон и содержать промотор млекопитающих, управляющий транскрипцией репликона. Молекулы рекомбинантной полицистронной нуклеиновой кислоты этого типа можно вводить млекопитающему и затем транскрибировать in situ для получения полицистронного репликона, экспрессирующего белки вируса герпеса.

[56] В некоторых аспектах изобретение относится к молекуле полицистронной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую gH вируса герпеса или его фрагмент и gL вируса герпеса или его фрагмент. Белки gH и gL, или их фрагменты, могут происходить из любого желательного вируса герпеса, такого как HSV-1, HSV-2, VZV, EBV типа 1, EBV типа 2, CMV, HHV-6 типа A, HHV-6 типа B, HHV-7, KSHV и т.п. Предпочтительно, вирус герпеса представляет собой VZV, HSV-2, HSV-1, EBV (типа 1 или типа 2) или CMV. Более предпочтительно, вирус герпеса представляет собой VZV, HSV-2 или CMV. Даже более предпочтительно, вирус герпеса представляет собой CMV. Последовательности белков gH и gL и нуклеиновых кислот, кодирующих белки из этих вирусов, хорошо известны в данной области. Иллюстративные последовательности показаны в таблице 1. Молекула полицистронной нуклеиновой кислоты может содержать первую последовательность, кодирующую белок gH, описанный в таблице 1, или его фрагмент, или последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную с ней. Молекула полицистронной нуклеиновой кислоты может содержать также вторую последовательность, кодирующую белок gL, описанный в таблице 1, или его фрагмент, или последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичную с ней.

Таблица 1
Вирус	номер доступа gH	номер доступа gL
HSV-1 (HHV-1)	NP_044623.1	NP_044602.1
HSV-2 (HHV-2)	NP_044491.1	NP_044470.1
VZV (HHV-3)	NP_040160.1	NP_040182.1
EBV типа 1 (HHV-4)	YP_401700.1	YP_401678.1
EBV типа 2 (HHV-4)	YP_001129496.1	YP_001129472.1
CMV (HHV-5)	YP_081523.1	YP_081555.1
HHV-6 типа A	NP_042941.1	NP_042975.1
HHV-6 типа В	NP_050229.1	NP_050261.1
HHV-7	YP_073788.1	YP_073820.1
KSHV (HHV-8)	YP_001129375.1	YP_001129399.1

[57] В