Способ прогнозирования течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии по массе cd4+ т-лимфоцитов селезенки

Способ прогнозирования течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии по массе cd4+ т-лимфоцитов селезенки

Реферат

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии, и может быть использовано для прогнозирования течения иммунной тромбоцитопении (ИТП) после спленэктомии по массе CD4+ Т-лимфоцитов селезенки путем определения массы лимфоидного органа, морфометрической оценки количества CD4+ Т-клеток в гистологических срезах селезенки после иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания и вычисления их массы.

Цель изобретения - разработка способа прогнозирования течения ИТП после спленэктомии по массе CD4+ Т-лимфоцитов селезенки.

ИТП относится к группе аутоиммунных гематологических заболеваний и характеризуется снижением содержания кровяных пластинок в периферической крови. Возникновение патологического процесса связывают с разрушением тромбоцитов аутоантителами при участии макрофагов селезенки, что указывает на центральную роль данного органа в патогенезе заболевания (А.А. Масчан, А.Г. Румянцев, Л.Г. Ковалева [и др.] / Рекомендации Российского совета экспертов по диагностике и лечению больных первичной иммунной тромбоцитопенией // Онкогематология. - 2010. - №3. - С. 36-45; F. Rodeghiero, R. Stasi, T. Gernsheimer [et al.] / Standartization of terminology, definitions and autcome criteria in immune thrombocytopenic purpura of adults and children: report from an international working group // Blood. - 2009. - Vol. 113, No 11. - P. 2386-2393). Спленэктомия входит в стандартную программу лечения пациентов с ИТП. До сих пор нет четкого представления о причинах возникновения рефрактерных форм заболевания. В последние годы появились сообщения о Т-клеточном механизме ингибирования активации клеточных линий с участием CD4+ регуляторных лимфоцитов, играющих ведущую роль в иммунном ответе при ИТП (W. Bao, J.B. Bussel, S. Heck [et al.] / Improved regulatory T-cell activity in patients with chronic immune thrombocytopenia treated with thrombopoietic agents // Blood. - 2010. - Vol. 116, No 22. - P. 4639-4645; B.H. Chong / ITP: Tregs come to the rescue // Blood. - 2010. - Vol. 116, No 22. - P. 4388-4390).

Способа прогнозирования течения ИТП после спленэктомии по массе CD4+ Т-лимфоцитов селезенки не существует.

Прототип отсутствует.

Аналогом является известный способ оценки CD4+ и CD8+ Т-клеток селезенки у больных ИТП, не отвечающих на терапию ритуксимабом (S. Audia, M. Samson, M. Mahevas [et al.] / Preferential splenic CD8+ T-cell activation in rituximab-nonresponder patients with immune thrombocytopenia // Blood. - 2013. - Vol. 122. - P. 2477-2486).

Отличия заявляемого способа от аналога включают:

1. В заявляемом способе морфометрически после ИГХ окрашивания гистологических срезов селезенки производят подсчет количества CD4+ Т-лимфоцитов, вычисляют их массу и по величинам масс CD4+ клеток прогнозируют варианты течения ИТП после спленэктомии.

2. В аналоге цитофотометрически по относительному количеству (%) CD8+ и CD8+/CD4+ Т-клеток в селезенке и крови оценивают результаты лечения ИТП у пациентов, не отвечающих на терапию ритуксимабом, метод не позволяет прогнозировать варианты течения ИТП.

В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предлагаемого изобретения.

Заявляемое изобретение разработано в лаборатории патоморфологии крови ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России в соответствии с планом научно-исследовательской работы.

Способ осуществляется следующим образом.

После проведения спленэктомии у больных ИТП определяют массу удаленной селезенки. Гистологическую проводку образцов исследуемого материала выполняют общепринятым способом; приготовление срезов осуществляют из парафиновых блоков селезенок, толщиной 3-5 мкм. Для идентификации CD4+ Т-лимфоцитов в селезенке используют метод ИГХ окрашивания; постановку реакции осуществляют по стандартной методике. Морфометрическую оценку количества CD4+ Т-лимфоцитов выполняют на световом микроскопе со встроенной фото- и видеокамерой с помощью программного обеспечения анализа изображений ImageScope Color, версии М, с окуляром ×10, при объективе ×100. Исследования проводят в 20 полях зрения для каждого образца, начиная от капсулы вглубь лимфоидного органа. Исходя из полученных результатов, вычисляют массу CD4+ Т-лимфоцитов селезенки по формуле:

M=m×D/100%,

где

m - масса селезенки, г;

D - количество CD4+ Т-лимфоцитов, %;

М - масса CD4+ Т-лимфоцитов, г.

Исследования выполнены на гистологических срезах парафиновых блоков селезенок от 32 больных ИТП после спленэктомии в возрасте от 19 до 74 лет (12 - мужского пола и 20 женского). Группу сравнения составили образцы селезенок, взятых от 20 человек, не имевших в анамнезе заболеваний системы крови. После спленэктомии определяли массу селезенки, выполняли проводку образцов послеоперационного материала, морфометрически после ИГХ окрашивания подсчитывали количество CD4+ Т-лимфоцитов селезенки, вычисляли их массу; при значениях массы CD4+ Т-лимфоцитов менее и равной 20,5 г прогнозировали рефрактерную форму ИТП, а при более 20,5 г - вариант ИТП с благоприятным течением заболевания. По результатам анализа у 15 пациентов после спленэктомии была установлена рефрактерная форма патологического процесса и у 17 - благоприятный вариант течения заболевания.

Результаты исследований представлены в примерах, подтверждающих возможность заявляемого способа прогнозировать варианты течения ИТП после спленэктомии по массе CD4+ Т-клеток селезенки.

Пример 1

Больная М, 59 лет, поступила в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России 03.04.2011 г. Анализ крови при поступлении: гемоглобин 154 г/л, эритроциты 5,5×10¹²/_л, лейкоциты 14,4×10⁹/_л, тромбоциты 9×10⁹/_л. Диагноз при поступлении: ИТП, тяжелая форма, плохо контролируемая лекарственными препаратами. Через 2 месяца выполнена операция (07.06.2011 г.): спленэктомия - без осложнений. Масса селезенки больной (m) составила 119,0 г. Проведено ИГХ окрашивание лимфоцитов в гистологических срезах селезенки по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определено количество CD4+ Т-лимфоцитов (D) - 13,4%. Вычислена масса (М) CD4+ Т-клеток по ранее приведенной формуле: 15,9 г. Установленная величина получена в ходе следующего расчета: М = 119,0 г × 13,4% / 100.

Заключение: по результатам ИГХ и морфометрического анализа установлено, что у пациентки с ИТП рефрактерная форма течения заболевания. При динамическом наблюдении за пациенткой уже спустя 2 месяца после спленэктомии прогноз был подтвержден лабораторными показателями (15.08.10): гемоглобин 134 г/л, эритроциты 4,89×10¹²/_л, лейкоциты 10,3×10⁹/_л, тромбоциты 75×10⁹/_л. Пациентка до настоящего времени нуждается в поддерживающей терапии.

Пример 2

Больная Б., 53 года, поступила в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России 30.10.2009 г. Анализ крови при поступлении: гемоглобин 148 г/л, эритроциты 5,69×10¹²/_л, лейкоциты 6,9×10⁹/_л, тромбоциты 26×10⁹/_л. Диагноз при поступлении: ИТП, тяжелая форма, плохо контролируемая лекарственными препаратами. Через 14 месяцев выполнена операция (10.12.2010 г.): спленэктомия - без осложнений. Масса селезенки больной (m) составила 155,0 г. Проведено ИГХ окрашивание лимфоцитов в гистологических срезах селезенки по стандартной методике. Морфометрически определено количество CD4+ Т-лимфоцитов (D) - 15,7%. Вычислена масса (М) CD4+ Т-клеток по ранее приведенной формуле: 24,3 г. Установленная величина получена в ходе следующего расчета: М = 155,0 г × 15,7% / 100.

Заключение: по результатам ИГХ и морфометрического анализа установлено, что у пациентки ИТП благоприятный вариант течения заболевания. При динамическом наблюдении за больной прогноз был подтвержден лабораторными показателями, значения которых находились в пределах нормы в течение 5 месяцев после спленэктомии (26.04.11): гемоглобин 138 г/л, эритроциты 5,01×10¹²/_л, лейкоциты 10,8×10⁹/_л, тромбоциты 204×10⁹/_л. В настоящее время пациентка не нуждается в поддерживающей терапии.

Заявляемое изобретение дает возможность по массе CD4+ Т-лимфоцитов селезенки прогнозировать вариант течения ИТП после спленэктомии. Более низкие величины массы CD4+ Т-лимфоцитов свидетельствуют о рефрактерной форме патологического процесса, напротив, более высокие по сравнению с группой сравнения - о благоприятном течении заболевания. Предлагаемый способ информативен, может быть использован в гематологических и патоморфологических отделениях, морфологических и гистологических лабораториях в качестве дополнительного критерия при прогнозировании варианта течения ИТП и для дифференцированного подхода при назначении терапии.

Способ прогнозирования течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии по массе CD4+ Т-лимфоцитов селезенки, характеризующийся тем, что после удаления селезенки определяют ее массу, в гистологических срезах лимфоидного органа после иммуногистохимического окрашивания морфометрически подсчитывают количество CD4+ Т-лимфоцитов и вычисляют их массу по формуле: M=m×D/100%, где M - масса CD4+ Т-лимфоцитов (г), m - масса селезенки (г), D - количество CD4+ Т-клеток (%), и при значениях массы CD4+ Т-лимфоцитов менее и равной 20,5 г констатируют рефрактерную форму иммунной тромбоцитопении, а при более 20,5 г устанавливают благоприятный прогноз течения заболевания.