Антитела против полиубиквитина и способы их применения

Антитела против полиубиквитина и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 61/324602, поданной 15 апреля 2010 г., которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки в полном объеме.

Ссылка на список последовательностей, предоставленный в виде текстового файла по EFS-WEB

Список последовательностей предоставлен одновременно с описанием изобретения в виде текстового файла в формате ASCII по EFS-WEB под именем ”P4410R1_Sequence_Listing.TXT”, дата создания 13 апреля 2011 г., размер 39,9 килобайт. Список последовательностей, поданный по EFS-WEB, является частью описания изобретения и включен в настоящее описание изобретения в качестве ссылки в полном объеме.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителам против полиубиквитина и, в частности, к антителам против полиубиквитина, которые специфически не связываются с моноубиквитином и являются специфичными к определенным формам лизиновых связей полиубиквитина, и к способам применения указанных антител.

Уровень техники

Убиквитин представляет собой мелкий белок, который является важным регулятором целого ряда сигнальных путей клетки. Установлено, что убиквитиновые цепи, связанные лизином в положении 11 (К11), являются важными регуляторами деления клеток (Jin et al., 2008; Kirkpatrick et al., 2006) и участвуют в деградации передачи сигнала убиквитин-лигазных субстратов анафазастимулирующего комплекса (АРС/С), важной стадии деления эукариотических клеток (Jin et al., 2008; Williamson et al., 2009). АРС/C рекрутирует два фермента Е2: UbcH10, инициирующий образование убиквитиновой цепи, и Ube2S, удлиняющий убиквитиновую цепь, которые собирают К11-связанные цепи с высокой специфичностью (Garnett et al., 2009; Williamson et al., 2009; Wu et al., 2010). Утрата указанного АРС/С-специфичного модуля Е2 вызывает нарушение митоза (Williamson et al., 2009; Song and Rape, Molecular Cell in press). Хотя полученные результаты позволяют предположить, что К11-связанные цепи вызывают разрушение белка протеасомой в процессе митоза, исследование убиквитиновых цепей, собранных АРС/С, UbcH10 и Ube2S, основано главным образом на экспериментах, выполненных in vitro. Прямое исследование К11-связанных полиубиквитиновых цепей, регулирующих разрушение белка в клетках, было невозможно из-за отсутствия инструментальных средств, позволяющих обнаруживать такие цепи.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к антителам против К11-связанного полиубиквитина и способам их применения. Один вариант осуществления изобретения относится к выделенному антителу, которое специфически связывается с первым полиубиквитином, содержащим связь, образованную лизином К11, при этом антитело специфически не связывается со вторым полиубиквитином, содержащим связь, образованную вторым лизином, которая отличается от связи, образованной лизином К11. Другой вариант осуществления изобретения относится к выделенному антителу, которое специфически связывается с первым полиубиквитином, содержащим связь, образованную лизином К11, и со вторым полиубиквитином, содержащим связь, образованную вторым лизином, которая отличается от связи, образованной лизином К11, при этом антитело специфически не связывается с моноубиквитином и связывается со вторым полиубиквитином с гораздо меньшим сродством связывания по сравнению со сродством связывания к первому полиубиквитину.

Другой вариант осуществления изобретения относится к выделенному антителу, которое специфически связывается с полиубиквитином, связанным лизином-11, при этом указанное антитело специфически не связывается с моноубиквитином. В одном из аспектов настоящего изобретения антитело содержит по меньшей мере одну последовательность гипервариабельного участка (HVR), выбираемую, соответственно, из любых последовательностей HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3 SEQ ID NO:2 и 57-60; SEQ ID NO:3 и 61; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:6-11; SEQ ID NO:12-17 и 67 и SEQ ID NO:18-23, 68 и 69. В другом аспекте антитело содержит по меньшей мере одну последовательность, выбираемую из HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, из которых HVR-H1 содержит аминокислотную последовательность Х1 Х2 Х3 Х4 Ile X5 (SEQ ID NO:24), где аминокислоту Х1 выбирают из серина и треонина, аминокислоту Х2 выбирают из аспарагина, аспарагиновой кислоты, серина и глицина, аминокислоту Х3 выбирают из тирозина, серина и треонина, аминокислоту Х4 выбирают из триптофана, аспарагиновой кислоты, глицина и тирозина и аминокислоту Х5 выбирают из серина и гистидина; HVR-H2 содержит аминокислотную последовательность Х6 Х7 Ile X8 Pro X9 Gly X10 Thr X11 (SEQ ID NO:25), где аминокислоту Х6 выбирают из глицина и аланина, аминокислоту Х7 выбирают из аспарагиновой кислоты, триптофана, глицина, глутаминовой кислоты и валина, аминокислоту Х8 выбирают из серина, тирозина и аспарагина, аминокислоту Х9 выбирают из аспарагиновой кислоты, аланина, гистидина и аспарагина, аминокислоту Х10 выбирают из тирозина и серина и аминокислоту Х11 выбирают из тирозина, аспарагиновой кислоты и аспарагина; и HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность Х12 Х13 X14 Х15 Х16 Х17 Х18 Х19 Х20 Х21 Asp (SEQ ID NO:26), где аминокислоту Х12 выбирают из аргинина и лизина, аминокислоту Х13 выбирают из глутаминовой кислоты, глицина, аспарагиновой кислоты и пролина, аминокислоту Х14 выбирают из серина, изолейцина, валина и триптофана, аминокислоту Х15 выбирают из триптофана, глицина, тирозина и фенилаланина, аминокислоту Х16 выбирают из триптофана, тирозина, лейцина, глицина и фенилаланина, аминокислоту Х17 выбирают из серина, тирозина, фенилаланина и глицина, аминокислоту Х18 выбирают из аланина, фенилаланина, тирозина и глицина или данная аминокислота отсутствует, аминокислоту Х19 выбирают из триптофана, глицина, аланина и тирозина или данная аминокислота отсутствует, аминокислота Х20 является валином или отсутствует и аминокислоту Х21 выбирают из метионина и фенилаланина.

В другом аспекте настоящего изобретения антитело содержит по меньшей мере одну последовательность, выбираемую из HVR-L1, HVR-L2, из которых HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность Х22 Х23 Ser X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 (SEQ ID NO:73), где аминокислоту Х22 выбирают из аргинина и глицина, аминокислоту Х23 выбирают из аланина и валина, аминокислоту Х24 выбирают из глутамина и гистидина, аминокислоту Х25 выбирают из аспарагиновой кислоты, аспарагина и изолейцина, аминокислоту Х26 выбирают из лейцина и валина, аминокислоту Х27 выбирают из серина, аспарагиновой кислоты, глицина и глутаминовой кислоты, аминокислоту Х28 выбирают из треонина и серина, аминокислоту Х29 выбирают из аланина, валина и фенилаланина, аминокислоту Х30 выбирают из валина и изолейцина и аминокислоту Х31 выбирают из аланина и серина; и HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность X32 X33 X34 Phe X35 Tyr Ser (SEQ ID NO:74), где аминокислоту Х32 выбирают из серина и аспарагина, аминокислоту Х33 выбирают из глутамина и аланина, аминокислоту Х34 выбирают из глутаминовой кислоты и серина и аминокислоту Х35 выбирают из лейцина и валина. Другим аспектом настоящего изобретения является антитело, содержащее по меньшей мере одну последовательность, выбираемую из HVR-H2 и HVR-H3, из которых HVR-H2 содержит аминокислотную последовательность X36 Ile Asn Pro X37 Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly (SEQ ID NO:75), где аминокислоту Х36 выбирают из аланина и глицина и аминокислоту Х37 выбирают из аланина и аспарагина; и HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность Glu Trp Tyr X38 X39 Gly Tyr Val Met Asp Tyr (SEQ ID NO:76), где аминокислоту Х38 выбирают из фенилаланина и тирозина и аминокислоту Х39 выбирают из глицина и аспарагиновой кислоты.

В другом аспекте настоящего изобретения антитело содержит, соответственно, последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:2, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:3 и последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:4. В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, содержащему последовательности HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, соответствующие последовательностям, представленным для клонов А3, А6, А9, В5, F5 и G3 на фигуре 1В. В другом аспекте настоящего изобретения антитело содержит последовательности HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, соответствующие последовательностям, представленным для клонов 1А11, 1С12, 1F12, 2A3, 2A6, 2D7, 2E6 или 2G4 на фигуре 4А. В другом аспекте настоящего изобретения антитело содержит последовательности HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, соответствующие последовательностям, представленным для клонов 1А11, 1С12, 1F12, 2A3, 2A6, 2E6 или 2G4 на фигуре 4В.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, содержащему последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:2, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:3, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:4, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:11, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:17 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO:23. В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, содержащему последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:58, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:3, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:4, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:11, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:17 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO:23. В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, содержащему последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:59, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:3, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:4, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:11, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:17 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO:23. В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, содержащему последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:2, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:3, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:4, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:11, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:67 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO:23. В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, содержащему последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:58, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:3, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:4, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:11, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:67 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO:23. В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, содержащему последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:59, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:3, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:4, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:11, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:67 и последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:23.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, содержащему аминокислотную последовательность легкой цепи, выбираемую из SEQ ID NO:5 и 62-66. В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, содержащему аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбираемую из SEQ ID NO:27-32 и 70-72.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, содержащему аминокислотные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи, которые по меньшей мере на 95% идентичны аминокислотным последовательностям одной из нижеследующих комбинаций последовательностей: SEQ ID NO:5 и 32; SEQ ID NO:63 и 32; SEQ ID NO:65 и 32; SEQ ID NO:5 и 72; SEQ ID NO:63 и 72; SEQ ID NO:65 и 72.

Другой вариант осуществления изобретения относится к выделенному антителу, которое связывается с той же антигенной детерминантой К-11 связанного полиубиквитина, что и любое из вышеуказанных антител, при этом данное антитело специфически не связывается с моноубиквитином. Другой вариант осуществления изобретения относится к выделенному антителу, конкурирующему с любым из вышеуказанных антител за связывание с полиубиквитином, при этом данное антитело специфически не связывается с моноубиквитином. Другой вариант осуществления изобретения относится к любому из вышеуказанных выделенных антител, которое специфически связывается с К11-связанным полиубиквитинированным белком. Другой вариант осуществления изобретения относится к любому из вышеуказанных выделенных антител, которое модулирует по меньшей мере один сигнальный путь, опосредуемый полиубиквитином.

Одним общим аспектом настоящего изобретения является любое из вышеуказанных антител, которое представляет собой моноклональное антитело. Другим общим аспектом настоящего изобретения является любое из вышеуказанных антител, которое представляет собой антитело человека. Другим общим аспектом настоящего изобретения является любое из вышеуказанных антител, которое представляет собой гуманизированное антитело. Другим общим аспектом настоящего изобретения является любое из вышеуказанных антител, которое представляет собой химерное антитело. Другим общим аспектом настоящего изобретения является любое из вышеуказанных антител, которое представляет собой фрагмент антитела, связывающийся с К11-связанным полиубиквитином.

Другой вариант осуществления изобретения относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей любое из вышеуказанных антител. Другой вариант осуществления изобретения относится к вектору, содержащему выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из вышеуказанных антител. Другой вариант осуществления изобретения относится к клетке-хозяину, содержащей выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из вышеуказанных антител. Другой вариант осуществления изобретения относится к клетке-хозяину, содержащей вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из вышеуказанных антител.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу получения любого из вышеуказанных антител, который включает культивирование вышеуказанной клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих продуцирование антитела. Одним из аспектов настоящего изобретения является способ, который далее включает выделение антитела из клетки-хозяина. Другим объектом настоящего изобретения является способ, который далее включает очистку антитела.

Другой вариант осуществления изобретения относится к иммуноконъюгату, содержащему любое из вышеуказанных антител и цитотоксический агент. Другой вариант осуществления изобретения относится к фармацевтическому препарату, содержащему любое из вышеуказанных антител и фармацевтически приемлемый носитель. Одним из аспектов настоящего изобретения является фармацевтический препарат, который далее содержит дополнительное терапевтическое средство. Одним из аспектов настоящего изобретения является дополнительное терапевтическое средство, которое представляет собой химиотерапевтическое средство.

Другой вариант осуществления изобретения относится к любому из вышеуказанных антител, предназначенному для применения в качестве лекарственного средства. Другой вариант осуществления изобретения относится к любому из вышеуказанных антител, предназначенному для применения при лечении заболевания или нарушения, относящегося к клеточному циклу. Одним объектом настоящего изобретения является заболевание или нарушение, относящееся к клеточному циклу, выбираемое из заболевания или нарушения, связанного с аберрантно быстрым развитием клеточного цикла, и заболевания или нарушения, связанного с аберрантно медленным развитием клеточного цикла. Одним объектом настоящего изобретения является заболевание или нарушение, связанное с аберрантно быстрым развитием клеточного цикла, представляющее собой рак. Другим объектом настоящего изобретения является заболевание или нарушение, связанное с аберрантно медленным развитием клеточного цикла, выбираемое из дегенеративного мышечного нарушения или дегенеративного нервного нарушения.

Другой вариант осуществления изобретения относится к применению любого из вышеуказанных антител для приготовления лекарственного средства. Одним из аспектов настоящего изобретения является лекарственное средство, предназначенное для лечения заболевания или нарушения, выбираемого из рака, дегенеративного мышечного нарушения и дегенеративного нервного нарушения. Другой вариант осуществления изобретения относится к способу лечения индивида, страдающего заболеванием или нарушением, выбираемым из рака, дегенеративного мышечного нарушения и дегенеративного нервного нарушения, который включает введение указанному индивиду эффективного количества любого из вышеуказанных антител.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу определения присутствия полиубиквитина или полиубиквитинированного белка в образце, в котором предполагается наличие полиубиквитина или полиубиквитинированного белка, который включает обработку указанного образца по меньшей мере одним из вышеуказанных антител и определение связывания по меньшей мере одного антитела с полиубиквитином или полиубиквитинированным белком в образце. Другой вариант осуществления изобретения относится к способу отделения К11-связанного полиубиквитинированного белка от К11-несвязанного полиубиквитированного белка в образце, который включает приведение в контакт образца по меньшей мере с одним из вышеуказанных антител. Другой вариант осуществления изобретения относится к способу определения функции и/или активности К11-связанного полиубиквитина в клетке или образце, который включает приведение в контакт клетки или образца по меньшей мере с одним из вышеуказанных антител и оценку эффекта, производимого указанным контактированием на клетку или образец.

Краткое описание чертежей

На фигурах 1А и 1В показаны аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепей Fab-фрагментов, полученных в примере 1. На фигуре 1А показана последовательность легкой цепи клонов, выделенных из непроцессированной библиотеки VH. Благодаря структуре библиотеки последовательности легких цепей были идентичны для всех полученных клонов. На фигуре 1В показан сравнительный анализ последовательностей тяжелых цепей клонов, выделенных из непроцессированной библиотеки VH. Для каждого клона указано число сиблинговых клонов, идентифицированных в результате третьего и четвертого циклов сортировки. На фигурах 1А и 1В последовательности HVR каждого клона указаны в рамках, при этом в первой рамке представлена последовательность HVR-L1 (фигура 1А) или HVR-H1 (фигура 1В), во второй рамке представлена последовательность HVR-L2 (фигура 1А) или HVR-H2 (фигура 1В) и в третьей рамке представлена последовательность HVR-L3 (фигура 1А) или HVR-Н3 (фигура 1В).

На фигуре 2 показан анализ ELISA фаговых пятен, демонстрирующий относительные сигналы связывания с панелью убиквитиновых белков при длине волны 450 нм для каждого полученного клона по примеру 1. Клоны библиотеки Fab-фрагментов содержали gD метку, и отображение Fab-фрагментов на фаге оценивали путем связывания с антителом против gD. Несенсибилизированные лунки были использованы в качестве отрицательного контрольного образца.

На фигурах 3А-3С показаны свойства связывания очищенного Fab-фрагмента G3, рассмотренного в примере 1. На фигуре 3А показаны результаты экспериментов по оценке способности очищенного Fab-фрагмента G3 в разных концентрациях связываться с панелью убиквитиновых белков при выполнении анализа ELISA. На фигуре 3В показаны результаты IC50 конкурентного анализа ELISA по измерению сродства очищенного Fab-фрагмента G3 к К11-связанному диубиквитину. На фигуре 3С показаны результаты анализа методом вестерн-блоттинга по определению способности Fab-фрагмента G3 специфически распознавать панель убиквитиновых белков в иммобилизированном виде. Гель, окрашенный кумассии, демонстрирует подвижность каждого образца.

На фигурах 4А и 4В показаны аминокислотные последовательности легких и тяжелых цепей клонов с созревшей аффинностью, полученных в примере 2. На фигуре 4 показаны последовательности легких цепей клонов с созревшей аффинностью. На фигуре 4В показан сравнительный анализ последовательностей тяжелых цепей клонов с созревшей аффинностью. Для каждого клона указано число сиблинговых клонов, идентифицированных в результате выполнения четвертого цикла сортировки. На фигурах 4А и 4В последовательности HVR для каждого клона указаны в рамках, при этом в первой рамке представлена последовательность HVR-L1 (фигура 4А) или HVR-H1 (фигура 4В), во второй рамке представлена последовательность HVR-L2 (фигура 4А) или HVR-H2 (фигура 4В) и в третьей рамке представлена последовательность HVR-L3 (фигура 4А) или HVR-H3 (фигура 4В). Замены аминокислот по сравнению с исходной последовательностью G3 выделены серым цветом.

На фигурах 5А-5В показаны результаты анализов ELISA, выполненных для оценки связывания родительского клона G3 и восьми вариантов с созревшей аффинностью, отображенных на фаге для связывания с панелью убиквитиновых белков, рассмотренных в примере 2Е.

На фигурах 6А и 6В показаны аминокислотные последовательности легких и тяжелых цепей гибридных клонов, полученных в примере 2. На фигуре 6А показаны последовательности легких цепей гибридных клонов. На фигуре 6В показан сравнительный анализ последовательностей тяжелых цепей гибридных клонов. На фигурах 6А и 6В последовательности HVR для каждого клона указаны в рамках, при этом в первой рамке представлена последовательность HVR-L1 (фигура 6А) или HVR-H1 (фигура 6В), во второй рамке представлена последовательность HVR-L2 (фигура 6А) или HVR-H2 (фигура 6В) и в третьей рамке представлена последовательность HVR-L3 (фигура 6А) или HVR-H3 (фигура 6В). Замены аминокислот по сравнению с исходной последовательностью G3 выделены серым цветом.

На фигурах 7А-7D показаны результаты исследований по оценке характеристик связывания гибридных IgG по сравнению с родительским клоном G3 и контрольными образцами, рассмотренные в примере 3. На фигуре 7А представлены результаты анализа ELISA, показывающие связывание IgG клонов G3, 1C12/2E6 и 2A3/2E6 в 4 М мочевины с панелью убиквитиновых белков. На фигуре 7В показаны результаты анализов методом вестерн-блоттинга связывания IgG клонов G3, 1C12/2E6 и 2A3/2E6 с двукратными серийными разведениями К11-связанного диубиквитина (1000, 500, 250, 125, 63, 31 и 16 нг/полосу с указанием градиента) или моноубиквитина, линейного диубиквитина, К48-связанного диубиквитина и К63-связанного диубиквитина (1 мкг/полосу). Гель, окрашенный кумассии, (верхний левый блок) показывает, где каждый из исследованных убиквитинов мигрирует в гели. На фигуре 7С показаны результаты экспериментов, в которых моноубиквитин, К48-связанный полиубиквитин 2-7 (длиной от двух до семи субъединиц убиквитина), К63-связанный полиубиквитин 2-7 (длиной от двух до семи субъединиц убиквитина) и К11-связанный полиубиквитин (1 мкг/полосу) исследовали методом иммуноблоттинга с использованием пан-убиквитинового антитела P4D1 (средний блок) или IgG 2A3/2E6 (правый блок). Окрашивание кумассии позволило выявить состав образцов (левый блок). На фигуре 7D показаны результаты экспериментов, в которых К11-связанный диубиквитин (50 нг/полосу), К48-связанный диубиквитин (1 мкг/полосу), К63-связанный диубиквитин (1 мкг/полосу), лизат цельных клеток, полученный из клеток 293Т человека, (100 мкг/полосу) и S. cerevisiae исследовали методом иммуноблоттинга с использованием IgG 2A3/2E6 (правый блок). Окрашивание кумассии позволило выявить состав образцов (левый блок).

На фигурах 8А-8Е показаны результаты экспериментов по исследованию способности гибридного антитела 2А3/2Е6 специфически распознавать и/или вызывать иммунопреципитацию К11-связанных полиубиквитинированных белков в результате выполнения реакций убиквитинирования in vitro. На фигуре 8А показаны результаты анализа методом вестерн-блоттинга, выполненного с использованием пан-убиквитинового антитела P4D1 после автоубиквитинирования MuRF1. Добавление ферментов Е1 (Ube1), E2 (UbcH5c) и Е3 (MuRF1) привело к превращению моноубиквитина в полиубиквитиновые цепи на MuRF1 (MuRF1-Ub_(n)). На фигуре 8В показаны результаты анализа методом иммунопреципитации, в котором продукт, полученный в результате выполнения анализа автоубиквитинирования MuRF1 с убиквитином дикого типа, использовали в качестве субстрата для иммунопреципитации при помощи IgG 2A3/2E6 в присутствии мочевины в разных концентрациях. Исходную реакционную смесь и вещество, осажденное методом иммунопреципитации, обнаруживали при помощи вестерн-блоттинга с использованием пан-убиквитинового антитела (P4D1). На фигуре 8С показаны результаты эксперимента, выполненного методом иммуноблоттинга аналогично эксперименту, показанному на фигуре 8В, за исключением того, что вместо убиквитина дикого типа был использован K11R убиквитин. На фигуре 8D показаны результаты вестерн-блоттинга, выполненного после реакций автоубиквитинирования MuRF1 in vitro с использованием убиквитина дикого типа, K11R, K48R и K63R убиквитина, которые были осаждены методом иммунопреципитации антителом 2A3/2E6 (К11) или изотипически сходным контрольным антителом и подвергнуты анализу методом вестерн-блоттинга. Числа в скобках указывают соответствующие полосы в геле и столбцы на (Е). Продукты реакций автоубиквитинирования (исходные смеси в полосах 1, 4, 7 и 10) и иммунопреципитации (полосы 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11 и 12) анализировали методом иммуноблоттинга с использованием пан-убиквитинового антитела. Белыми линиями обозначена область геля, окрашенного кумасси, которая была вырезана для масс-спектрометрического анализа AQUA, контролируемого вестерн-блоттингом. На фигуре 8Е представлены результаты масс-спектрометрических анализов AQUA областей геля, показанных на фигуре 8D. Указано число К11, К48 и К63 связей, измеренных в каждом образце. Во всех случаях было обнаружено пренебрежимо малое число убиквитиновых связей в продуктах иммунопреципитации при использовании изотипически сходного контрольного антитела.

На фигурах 9А-9D показаны результаты экспериментов по исследованию способности гибридного антитела 2А3/2Е6 специфически распознавать и/или вызывать иммунопреципитацию К11-связанных полиубиквитинированных белков из клеточных лизатов. На фигуре 9А показана схема эксперимента и представлены результаты иммунопреципитации, полученные методом вестерн-блоттинга с использованием клеточных лизатов из клеток НЕК293Т, псевдотрансфицированных клеток или клеток, содержащих плазмиду, сверхэкспрессирующую убиквитин дикого типа или К0 убиквитин, которые были осаждены методом иммунопреципитации антителом 2А3/2Е6 (К11) или изотипически сходным контрольным антителом. Числа в скобках указывают соответствующие полосы в геле и столбцы на фигуре 9В. Лизаты цельных клеток (исходные смеси, полосы 1, 4 и 7) и продукты иммунопреципитации (полосы 2, 3, 5, 6, 8 и 9) исследовали методом иммуноблоттинга с использованием пан-убиквитинового антитела. Белыми линиями обозначены области геля, окрашенного кумассии, которые были вырезаны для масс-спектрометрического анализа AQUA, контролируемого вестерн-блоттингом. На фигуре 9В показаны окрашенные кумассии гели для вестерн-блоттинга, аналогичные изображенным на фигуре 9А. Области А и В геля, окрашенного кумассии, были вырезаны для исследования исходных смесей и продуктов иммунопреципитации. Нумерация соответствует показанной на фигуре 9А. На фигуре 9С показаны результаты масс-спектрометрических анализов, выполненных в областях геля, изображенных на фигурах 9А и 9В. Указано число К11, К48 и К63 связей, измеренных в каждом образце. Во всех случаях было обнаружено пренебрежимо малое число убиквитиновых связей в продуктах иммунопреципитации при использовании изотипически сходного контрольного антитела. На фигуре 9D изображены графики, позволяющие сравнить процентное значение К11-связей от общего числа убиквитиновых связей, измеренных в исходных смесях и продуктах иммунопреципитации (антитело против К11), которые демонстрируют увеличение К11-связей при использовании гибридного антитела, специфичного к К11-связям.

Подробное описание вариантов осуществления изобретения

I. Определения терминов

“Акцепторная остовная область человека” в соответствии с целями настоящего изобретения означает остовную область, содержащую аминокислотную последовательность остовной области вариабельного домена легкой цепи (VL) или остовной области вариабельного домена тяжелой цепи (VH), выделенную из остовной области иммуноглобулина человека или консенсусной остовной области человека, указанной ниже. Акцепторная остовная область человека, ”выделенная из” остовной области иммуноглобулина человека или консенсусной остовной области человека, может содержать такую же аминокислотную последовательность или может содержать замены в аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления изобретения число замен аминокислот равно 10 или меньше, 9 или меньше, 8 или меньше, 7 или меньше, 6 или меньше, 5 или меньше, 4 или меньше, 3 или меньше либо 2 или меньше. В некоторых вариантах осуществления изобретения акцепторная остовная область VL человека идентична последовательности остовной области VL иммуноглобулина человека или консенсусной остовной области человека.

Термин “сродство” означает силу суммарных общих нековалентных взаимодействий между одним связывающим сайтом молекулы (например, антитела) и его партнером связывания (например, антигеном). За исключением особо оговоренных случаев в значении, использованном в настоящем изобретении, термин ”сродство связывания” означает собственное сродство связывания, которое отражает взаимодействие с отношением 1:1 между членами связывающейся пары (например, антитела и антигена). Сродство молекулы Х к партнеру Y обычно может быть представлено константой диссоциации (Kd). Сродство можно измерить обычными методами, известными в данной области, включая методы, рассмотренные в настоящем описании изобретения. Ниже представлены специальные иллюстративные и типичные варианты осуществления изобретения, относящиеся к измерению сродства связывания.

Антитело ”с созревшей аффинностью” означает антитело, включающее одно или несколько изменений в одном или нескольких гипервариабельных участках (HVR), по сравнению с исходным антителом, которое не содержит таких изменений, улучшающих сродство антитела к антигену.

Термин “антитело-агонист”, как используется в настоящем описании, означает антитело, которое имитирует по меньшей мере одну из функциональных активностей представляющего интерес полипептида.

“Антитело-антагонист” или ”блокирующее антитело” является антителом, которое ингибирует или уменьшает биологическую активность антигена, с которым оно специфически связывается. Определенные блокирующие антитела или антитела-антагонисты в основном или полностью ингибируют биологическую активность антигена.

Термин ”антитело” использовано в настоящем описании изобретения в самом широком значении и означает разные структуры антител, которые включают, не ограничиваясь ими, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, если они обладают требуемой антиген-связывающей активностью.

Термин “фрагмент антитела” означает молекулу, отличную от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, связывающуюся с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антитела включают, не ограничиваясь ими, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, диатела, линейные антитела, одноцепочечные антитела (например, scFv) и мультиспецифические антитела, образованные фрагментами антител.

“Антитело, связывающееся с тем же эпитопом”, что и эталонное антитело, означает антитело, которое блокирует связывание эталонного антитела с антигеном на 50% или больше при выполнении конкурентного анализа, и наоборот эталонное антитело блокирует связывание указанного антитела с антигеном на 50% или больше при выполнении конкурентного анализа. В настоящем описании изобретения представлен типичный конкурентный анализ.

Термины ”антитело против К11-связанного полиубиквитина” и “антитело, связывающееся с К11-связанным полиубиквитином” означают антитело, способное связываться с К11-связанным полиубиквитином с достаточным сродством для того, чтобы указанное антитело можно было использовать в качестве диагностического и/или терапевтического агента для направленного воздействия на К11-связанный полиубиквитин. В одном из вариантов осуществления изобретения степень связывания антитела против К11-связанного полиубиквитина с неродственным белком, не являющимся К11-связанным полубиквитином, составляет менее примерно 10% связывания антитела с К11-связанным полиубиквитином при измерении, например, с помощью радиоиммуноанализа (RIA). В определенных вариантах осуществления изобретения антитело, связывающееся с К11-связанным полиубиквитином, имеет константу диссоциации (Kd) ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10^-8 М или меньше, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 М). В определенных вариантах осуществления изобретения антитело против К11-связанного полиубиквитина связывается с эпитопом К11-связанного полиубиквитина, который является консервативным для К11-связанного полиубиквитина разных видов.

Как используется в настоящем описании термин ”антитело против полиубиквитина” означает антитело, способное специфически связываться с молекулой полиубиквитина.

Как используется в настоящем описании термины ”антитело против убиквитина” и “антитело против моноубиквитина” имеют взаимозаменяемые значения и означают антитело, способное специфически связываться с молекулой убиквитина.

Термин ”химерное” антитело означает антитело, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи выделена из одного определенного источника или вида, в то время как остальная часть тяжелой и/или легкой цепи выделена из другого источника или вида.

Термин “класс” антитела означает тип константного домена или константной области, находящейся в тяжелой цепи. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, при этом некоторые из указанных классов могут быть далее подразделены на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие разным классам иммуноглобулинов, именуются, соответственно, α, β, ε, γ и µ.

Термин ”цитотоксический агент”, как используется в настоящем описании, означает вещество, которое ингибирует или препятствует выполнению функции клетки и/или вызывает гибель или разрушение клетки. Цитотоксические агенты включают, не ограничиваясь ими, радиоактивные изотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu); химиотерапевтические и лекарственные средства (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин и другие интеркалирующие средства); ингибиторы роста; ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты; антибиотики; токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения, в том числе их фрагменты и/или варианты; и разные противоопухолевые или противораковые средства, описанные ниже.

“Нарушение” представляет собой любое состояние, которое может быть улучшено в результате лечения антителом по настоящему изобретению. В определение данного термина входят хронические и острые нарушения или заболевания, в том числе патологические состояния, провоцирующие возникновение у млекопитающего данного нарушения. Неограничивающими примерами нарушений, подлежащих лечению способом по настоящему изобретению, являются рак и гипотрофические нарушения, которые включают, не ограничиваясь ими, дегенеративные мышечные нарушения и дегенеративные нервные нарушения.

Термин ”эффекторные функции” означает биологические активности, обусловленные Fc-областью антитела, которые изменяются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: связывание C1q и комплементзависимую цитотоксичность (CDC); связывание Fc-рецептора; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; уменьшение числа рецепторов на поверхности клетки (например, В-клеточных рецепторов) и активацию В-клеток.

“Эффективное количество” агента, например, фармацевтического препарата, означает количество, которое при вводимых дозах и в течение необходимых периодов времени обеспечивает достижение требуемого терапевтического или профилактического результата.

Термин ”Fc-область” использован в настоящем описании изобретения для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащей по меньшей мере часть константной области. В определение данного термина входят Fc-области нативной последовательности и вариантные Fc-области. В одном варианте осуществления изобретения Fc-область тяжелой цепи IgG человека расположена от остатка Cys226 или Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) Fc-области может присутствовать или отсутствовать. За исключ